小麥矮腥黑粉菌冬孢子萌發(fā)和室內(nèi)人工接種方法的探索

姚 卓， 陳萬(wàn)權(quán)， 高 利， 劉太國(guó)， 劉 博

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

小麥矮腥黑粉菌冬孢子萌發(fā)和室內(nèi)人工接種方法的探索

姚 卓， 陳萬(wàn)權(quán)*， 高 利， 劉太國(guó)， 劉 博

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

摘要小麥矮腥黑穗病是由小麥矮腥黑粉菌（Tilletia controversa Kühn，TCK）引起的我國(guó)對(duì)外一類檢疫性病害。本項(xiàng)研究對(duì)其病菌冬孢子的萌發(fā)、人工接種方法進(jìn)行了室內(nèi)試驗(yàn)。結(jié)果表明，參試菌株冬孢子在土壤浸提液培養(yǎng)基上45～50 d時(shí)達(dá)到萌發(fā)高峰，冬孢子濃度對(duì)萌發(fā)率有影響，濃度為（100～105）×104個(gè)／m L時(shí)萌發(fā)率最高。因此，可以選用此濃度作為室內(nèi)TCK冬孢子萌發(fā)研究的適宜濃度。在室內(nèi)進(jìn)行TCK冬孢子的人工接種方法的研究表明，冬孢子在培養(yǎng)基上萌發(fā)后，將麥種放在培養(yǎng)皿蓋中的濕濾紙上，置于5℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到苗長(zhǎng)到3～5 cm，然后將麥苗種植到直徑為24 cm的塑料盆中，在白天30℃，夜晚18℃的生長(zhǎng)箱中培養(yǎng)至植株成熟，可獲得7%左右的發(fā)病植株。

關(guān)鍵詞小麥矮腥黑粉菌； 冬孢子萌發(fā)； 人工接種試驗(yàn)

小麥矮腥黑穗病是由小麥矮腥黑粉菌（Tilletia controversa Kühn，TCK）引起的重要國(guó)際檢疫性病害，也是我國(guó)對(duì)外檢疫的一類危險(xiǎn)性植物病害。該病害危害大、防治難，一旦傳入會(huì)給小麥生產(chǎn)帶來(lái)毀滅性危害，通常發(fā)病率約等于小麥產(chǎn)量損失率［1-2］。據(jù)Hoffmann報(bào)告，在流行年份，因TCK引起的損失率一般為20%～50%，最高可達(dá)75%～90%［3］。除了產(chǎn)量損失外，被侵染的小麥出粉率也會(huì)隨著感染嚴(yán)重程度而降低，并且因含有TCK冬孢子而極大地影響品質(zhì)。1935年Young［4］根據(jù)小麥矮腥黑穗病病株矮化明顯、分蘗多、病穗緊密及病粒硬等特征，將其與小麥普通腥黑穗病區(qū)分開。目前該病害已在歐洲、北美、南美、大洋洲、亞洲、非洲等約49個(gè)國(guó)家發(fā)生。這些發(fā)病地點(diǎn)均在北緯30°和南緯30°以上的中緯度地區(qū)。TCK的寄主范圍很廣，危害小麥、大麥、黑麥等禾本科18個(gè)屬的70多種植物，其中，對(duì)小麥危害最嚴(yán)重［5］。該病在栽培條件下的主要寄主為冬小麥，我國(guó)常年小麥種植面積約2 300萬(wàn)hm2，其中冬小麥占絕大部分，隨著我國(guó)加入WTO及與TCK疫區(qū)國(guó)家美國(guó)小麥貿(mào)易的增加，TCK傳入我國(guó)的可能性日益增大。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于小麥矮腥黑粉菌在室內(nèi)條件下完成侵染循環(huán)過(guò)程的研究較少，不能明確小麥矮腥黑穗病病害循環(huán)過(guò)程中各階段的環(huán)境條件。探索小麥矮腥黑粉菌的室內(nèi)人工接種方法，并完成病菌的侵染循環(huán)過(guò)程，將有助于在室內(nèi)隔離條件下進(jìn)行小麥矮腥黑粉菌生物學(xué)研究，包括病菌不同小種的致病性、小麥品種抗病性研究等，防止在室外條件下進(jìn)行研究時(shí)出現(xiàn)病菌擴(kuò)散的情況，造成嚴(yán)重后果，進(jìn)而從各方面加強(qiáng)對(duì)該病的防治。

1 材料與方法

1.1 TCK冬孢子濃度對(duì)萌發(fā)的影響

供試菌株為2011年從口岸截獲的小麥矮腥黑粉菌。小麥矮腥黑粉菌冬孢子的表面消毒處理和萌發(fā)參照王吉霞等的方法［6］。從病穗中取1粒菌癭，置于2 m L離心管中，加入適量蒸餾水浸泡菌癭，靜置30 min，然后將菌癭搗碎并充分振蕩，用150目網(wǎng)篩過(guò)濾后，將濾液放在室溫下培養(yǎng)24 h，低速離心后棄去上清液，加0.25%NaCl O水溶液并在室溫下放置1 min進(jìn)行表面消毒，用滅菌水洗3次，利用血球計(jì)數(shù)板將冬孢子在滅菌水中調(diào)至不同濃度：（5～10）×104、（25～30）×104、（50～55）×104、（75～80）×104、（100～105）×104、（125～130）×104、（150～155）×104、（175～180）×104個(gè)／m L。

將配制好的冬孢子懸浮液加入預(yù)先做好的土壤浸提液培養(yǎng)基平板（1 000 m L培養(yǎng)基中含有20 g瓊脂、5 mg 80萬(wàn)IU青霉素、75 g土壤）上，每皿加冬孢子懸浮液0.25 m L，并用無(wú)菌三角玻璃棒均勻涂抹培養(yǎng)基表面，每個(gè)濃度重復(fù)3次。用封口膜封好后倒置放于5℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為600 lx。

從培養(yǎng)15 d之后開始，每5 d鏡檢觀察1次，每個(gè)培養(yǎng)皿觀察400個(gè)孢子。以先菌絲長(zhǎng)到冬孢子直徑的1／2時(shí)視為萌發(fā)，記錄萌發(fā)起始時(shí)間、萌發(fā)數(shù)目及生長(zhǎng)情況。

1.2 TCK的室內(nèi)人工接種方法研究

供試菌株同上。接種寄主：‘東選3號(hào)’。接種前，將小麥種子用30%NaOCl水溶液表面消毒5 min，無(wú)菌水沖洗3次，以便殺死種子表面可能攜帶的TCK和小麥網(wǎng)腥黑粉菌孢子。然后將小麥種子浸種催芽，待胚芽鞘長(zhǎng)度為1～3 mm時(shí)備用。

接種方法一：小麥在接種前需經(jīng)過(guò)春化處理，春化溫度為4℃，春化時(shí)間約4周。當(dāng)約70%的冬孢子萌發(fā)時(shí)，在每個(gè)土壤浸提液培養(yǎng)基中放入4～5 g種子和5 m L冷水（約5℃），用消毒過(guò)的玻璃棒混合，直到種子濕潤(rùn)并均勻覆蓋病菌。接種必須在擔(dān)孢子開始解體前進(jìn)行，單個(gè)擔(dān)孢子有泡則表明已解體。將接種后的種子播于直徑24 cm塑料盆中，深度約5 cm，每盆種10粒種子。在10℃下培養(yǎng)，直到幼苗出土良好，時(shí)間約2周。然后將幼苗移至高溫室中培養(yǎng)，白天溫度約25℃，夜間溫度約13℃，進(jìn)行常規(guī)管理，將植株種植至成熟。

接種方法二：將接有冬孢子懸浮液的小麥種子（同方法一）播種在直徑11 cm塑料盆的潮濕蛭石中，播種深度為5 cm，然后用一層鋁箔覆蓋，放在10℃下培養(yǎng)2周左右。然后將幼苗移到盛有滅菌土的直徑為24 cm的塑料盆中，每盆約10株，置5～10℃下至少8周，進(jìn)行春化處理，然后將植株放在白天30℃，夜晚18℃的人工氣候培養(yǎng)箱中種植至植株成熟［7］。

接種方法三：將種子放在培養(yǎng)皿蓋中的濕濾紙上，然后將皿底盛有一層承載萌發(fā)孢子的土壤浸提液培養(yǎng)基倒置過(guò)來(lái)，使培養(yǎng)基上承載萌發(fā)冬孢子的一面與小麥種子接觸，放在5℃的培養(yǎng)箱中培育，并可通過(guò)這段時(shí)間的低溫對(duì)小麥進(jìn)行春化處理，直到苗長(zhǎng)到3～5 cm。然后將幼苗種植到直徑為24 cm的塑料盆中，放在白天30℃，夜晚18℃的人工氣候培養(yǎng)箱中種植至植株成熟［8］。

接種方法四：將小麥種子壓入培養(yǎng)基中，TCK冬孢子在培養(yǎng)基表面進(jìn)行萌發(fā)，把種子的胚并列對(duì)著孢子。小麥萌發(fā)時(shí)改變培養(yǎng)基的位置，使胚芽鞘能沿培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)。接種后，將培養(yǎng)皿放置在10℃的生長(zhǎng)箱中，直到麥苗的胚芽鞘長(zhǎng)到3～5 cm。然后將麥苗種植到盛有滅菌土的直徑為24 cm的塑料盆中，放在白天30℃，夜晚18℃的人工氣候培養(yǎng)箱中種植至植株成熟［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同TCK冬孢子濃度對(duì)其萌發(fā)的影響

不同濃度下參試菌株冬孢子的萌發(fā)率變化如圖1所示。由圖1可以看出，TCK菌株冬孢子在最適溫度5℃下，不同冬孢子濃度下的菌株起始萌發(fā)時(shí)間最短為15～20 d，大部分菌株為25 d。通過(guò)對(duì)TCK冬孢子萌發(fā)過(guò)程的系統(tǒng)觀察發(fā)現(xiàn)，TCK冬孢子萌發(fā)后先長(zhǎng)出先菌絲，在瓊脂培養(yǎng)基上，有的菌株先菌絲在產(chǎn)生初生擔(dān)孢子前大量生長(zhǎng)，先菌絲長(zhǎng)短差異較大（圖2a）。有的菌株可在冬孢子上觀察到多個(gè)萌發(fā)孔，在同一冬孢子上產(chǎn)生多條先菌絲（圖2b）。絲狀的初生擔(dān)孢子是從先菌絲頂部開始生長(zhǎng)，形成密集的一束（圖2b），起初先菌絲沒(méi)有隔膜，正常萌發(fā)的冬孢子在培養(yǎng)35 d以后先菌絲一端開始產(chǎn)生隔膜，并可觀察到先菌絲的頂端長(zhǎng)出初生擔(dān)孢子和冬孢子融合后形成的H體和接合釘（圖2c）。45 d左右開始有少量的初生擔(dān)孢子頂端長(zhǎng)出臘腸狀的次生擔(dān)孢子（圖2d）。此結(jié)果與王吉霞［6］的結(jié)果基本一致，各階段孢子形態(tài)如圖2所示。

圖1 TCK不同冬孢子濃度對(duì)萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of TCK teliospores on the germination rate

圖2 TCK冬孢子萌發(fā)過(guò)程中不同階段的形態(tài)（10×）Fig.2 Form of TCK teliospore germination at different stages（10×）

從圖1中還可以看出，不同濃度的參試菌株在45～50 d達(dá)到最高萌發(fā)率，約為60%～75%，與Meiners的研究結(jié)果一致［8］。利用SAS8.0進(jìn)行方差分析結(jié)果表明，在45～50 d參試菌株在濃度達(dá)到（100～105）×104個(gè)／m L時(shí)，與高濃度參試菌株的萌發(fā)率差異達(dá)到顯著水平，隨著濃度的升高，萌發(fā)率差異不顯著（表1）。

2.2 室內(nèi)人工接種方法的研究

采用不同方法進(jìn)行人工接種后，對(duì)小麥不同生長(zhǎng)時(shí)期病害癥狀進(jìn)行系統(tǒng)觀察（圖3）。在小麥生長(zhǎng)初期，病葉片上表現(xiàn)為微小、不清晰或清晰的黃斑和／或條紋（圖3f）。受侵染的植株易產(chǎn)生異常矮化分蘗，病穗的莖稈通?？s短。受侵染的小花未成熟子房呈深綠色，而健康的子房則呈淺綠色。發(fā)育完全的孢子團(tuán)一般呈籽粒狀，但比正常籽粒圓且大，這使得內(nèi)外稃張開，使病穗呈現(xiàn)特征形態(tài)（圖3g）。成熟孢子團(tuán)由冬孢子組成并被薄而修飾過(guò)的子房壁包被（圖3i）。孢子團(tuán)散發(fā)出與魚腥味相似的強(qiáng)烈氣味。病害一般僅在病株的某些分蘗中發(fā)生。在4種接種方法中，方法一和方法三分別獲得了3.33%和6.66%的發(fā)病麥穗。

表1 45 d和50 d時(shí)不同濃度下TCK冬孢子的萌發(fā)率1）Table 1 Germination rate of TCK teliospores under different concentrations after culture of 45 d and 50 d

圖3 TCK侵染循環(huán)示意圖Fig.3 Sketch map of TCK infection cycle

3 結(jié)論與討論

目前有關(guān)TCK冬孢子萌發(fā)的研究主要是其與環(huán)境因子之間的關(guān)系。王吉霞等研究了溫度對(duì)TCK冬孢子萌發(fā)的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，TCK冬孢子萌發(fā)的溫度范圍為－2～12℃，其中5℃為萌發(fā)的最佳溫度［6］。賈文明等對(duì)土壤濕度對(duì)TCK冬孢子萌發(fā)的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，TCK冬孢子在土壤質(zhì)量含水量為1%～28%（相對(duì)含水量3.57%～100%）范圍內(nèi)均可萌發(fā)，其適宜萌發(fā)的土壤含水量范圍為10%～25%（相對(duì)含水量17.85%～89.3%），最佳土壤相對(duì)含水量范圍在65%～75%之間［9］。江輝等研究了TCK不同菌株冬孢子萌發(fā)對(duì)溫度的敏感性，進(jìn)一步明確不同菌株TCK冬孢子萌發(fā)對(duì)溫度的反應(yīng)，菌株在相同的培養(yǎng)條件下，隨著保存年限的增長(zhǎng)，冬孢子的萌發(fā)率會(huì)逐漸下降［10］。本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)TCK冬孢子的濃度梯度，研究濃度與冬孢子萌發(fā)之間的相關(guān)性，試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的TCK冬孢子對(duì)萌發(fā)有一定影響，冬孢子濃度在（100～105）×104個(gè)／m L以下時(shí)，其萌發(fā)率隨濃度增加逐漸升高。相關(guān)研究表明，腥黑粉菌具有魚腥味的化學(xué)物質(zhì)三甲胺可抑制TCK冬孢子萌發(fā)［11］，其他冬孢子未知的內(nèi)源化合物也能抑制萌發(fā)［12］，可能由于高濃度的自我抑制化合物而使殘存在孢子堆中的冬孢子不萌發(fā)［13］。在本試驗(yàn)中，當(dāng)濃度達(dá)到一定范圍時(shí)，冬孢子的萌發(fā)率反而逐漸降低，也證明了上述研究?jī)?nèi)容。因此，在人工接種試驗(yàn)中，需要較高冬孢子萌發(fā)率，以確保病菌能夠侵入小麥體內(nèi)，并在寄主體內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)展，引起小麥發(fā)病，所以在冬孢子萌發(fā)試驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)通過(guò)選擇合適的冬孢子濃度，年代較近的菌株以及控制溫度和濕度等環(huán)境條件，以確保冬孢子有較高的萌發(fā)率。

國(guó)內(nèi)關(guān)于TCK冬孢子人工接種試驗(yàn)的相關(guān)研究較少，在大連、北京、天津等地室外采用將TCK冬孢子撒在土壤表面的接種方法得到了大量TCK病株（章正，王圓等，未發(fā)表資料）。易建平將接種萌發(fā)TCK冬孢子的小麥種子在5℃光照（12 h／d）條件下培養(yǎng)21 d或29 d后，移植于塑料周轉(zhuǎn)箱中，按照小麥常規(guī)田間管理措施管理，直到收獲，該試驗(yàn)獲得了發(fā)病麥穗，這是單個(gè)萌發(fā)TCK冬孢子造成小麥發(fā)病的第一次報(bào)道［14］。但該試驗(yàn)發(fā)病率較低，且將冬孢子接種小麥后移植到室外培養(yǎng)，環(huán)境條件可控性較差。本試驗(yàn)在國(guó)內(nèi)外前人研究的基礎(chǔ)上，探索了不同的冬孢子室內(nèi)接種方法，并嚴(yán)格控制小麥生長(zhǎng)各階段的環(huán)境條件，所采用4種接種方法，其中2種方法得到了TCK病穗，但發(fā)病率均較低?？赡茉蛴校海?）病菌的侵入時(shí)期與小麥的感病時(shí)期不一致，導(dǎo)致病菌未能侵入小麥體內(nèi)；（2）接種后，土壤等環(huán)境條件可能不利于冬孢子生長(zhǎng)，導(dǎo)致病菌未能侵入小麥體內(nèi)；（3）麥苗從低溫培養(yǎng)箱中移至高溫培養(yǎng)箱后溫度突然升高，麥苗生長(zhǎng)迅速，大部分病菌未能侵入到小麥生長(zhǎng)點(diǎn)。但本試驗(yàn)仍然得到了部分發(fā)病植株，證明可在室內(nèi)條件下完成TCK的整個(gè)侵染過(guò)程。在本試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)一步優(yōu)化，如使種子與病菌長(zhǎng)時(shí)間充分接觸，有利于病菌的侵入；嚴(yán)格控制病菌侵入時(shí)期的低溫（約5～10℃）、高濕（約65%～75%）的環(huán)境條件；改善土壤理化條件，使其適合病菌生長(zhǎng)及侵入小麥體內(nèi)，將有可能得到較高的發(fā)病率。如果能在室內(nèi)條件下得到穩(wěn)定的TCK發(fā)病率，將能進(jìn)一步通過(guò)TCK的鑒別寄主來(lái)確定不同病菌小種的致病性，以及目前我國(guó)現(xiàn)有主栽小麥品種對(duì)致病性高的病菌小種的抗病性，有助于有效評(píng)估TCK對(duì)我國(guó)小麥生產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，并從栽培抗病品種等方面入手加強(qiáng)對(duì)小麥矮腥黑穗病的控制。

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中圖分類號(hào)：S 435.121.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.021

收稿日期：2013-05-05

修訂日期：2013-06-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目（2009CB119200，2010CB951503，2011CB100403）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位科學(xué)家（CARS-03-04B）；農(nóng)作物病蟲害疫情監(jiān)測(cè)與防治

*通信作者E-mail：wqchen＠ippcaas.cn

Germination of teliospores and artificial inoculation of Tilletia controversa Kühn

Yao Zhuo， Chen Wanquan， Gao Li， Liu Taiguo， Liu Bo
（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

AbstractDwarf bunt of wheat，caused by Tilletia controversa Kühn is an international quarantine disease on wheat in China.Germination of teliospores and infection of T.controversa by different artificial inoculation methods were tested in the laboratory.The results indicated that the germination rate reached to its peak on the 45th－50th day in the soil extract agar medium.Concentration of teliospores had an impact on germination rate with the highest at the（100－105）×104／m L，which can be used for the inoculation concentration in the greenhouse.The wheat seeds were put on the wet filter paper in the cover of the soil extract agar medium with the germinated teliospores，the medium was overturned and incubated at 5℃until wheat seedlings grew to 3－5 cm，then the wheat seedlings were transplanted to the 24-cm-diameter plastic pots and kept in the growth chamber at 30℃during the day and 18℃during the night until the matured plants.The diseased plants reached to about 7%.

Key wordsTilletia controversa（TCK）； germination of teliospores； artificial inoculation test