獼猴桃灰霉病病原菌鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

李 誠， 蔣軍喜*， 趙尚高， 李幫明， 余 強(qiáng)， 涂貴慶

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南昌 330045；2.江西省奉新縣農(nóng)業(yè)局，奉新 330700）

獼猴桃灰霉病病原菌鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

李 誠1， 蔣軍喜1*， 趙尚高2， 李幫明2， 余 強(qiáng)2， 涂貴慶2

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南昌 330045；2.江西省奉新縣農(nóng)業(yè)局，奉新 330700）

摘要通過病原菌形態(tài)特征、致病性測定及rDNA-ITS的同源性分析，確定江西奉新獼猴桃灰霉病的病原菌為Botrytis cinerea（有性態(tài)Botryotinia fuckeliana），該病菌在5～30℃的溫度范圍內(nèi)均能正常生長，且該病菌只能通過傷口接種引起獼猴桃發(fā)病。采用菌絲生長速率法測定11種殺菌劑對(duì)該病原菌的毒力大小，結(jié)果表明，肟菌·戊唑醇水分散粒劑、氟硅唑乳油、異菌脲懸浮劑、苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、戊唑醇懸浮劑和吡唑醚菌酯乳油對(duì)其菌絲生長有較強(qiáng)的抑制作用，EC50值分別為0.118 0、0.288 6、0.355 2、1.541 8、1.760 2和1.778 4μg／mL。

關(guān)鍵詞獼猴桃灰霉?。?Botrytis cinerea； 毒力測定

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch.）為獼猴桃科、獼猴桃屬多年生木質(zhì)落葉藤本植物［1］。我國于20世紀(jì)70年代從新西蘭引進(jìn)優(yōu)良品種開始規(guī)?；N植獼猴桃以來，到目前為止已發(fā)展成為全球最大的獼猴桃生產(chǎn)國［2］。我國的獼猴桃主要分布在陜西、河南、四川、江西等省的亞熱帶中高海拔地區(qū)。江西奉新自20世紀(jì)80年代開始對(duì)獼猴桃進(jìn)行品種選育和栽培以來，到目前為止栽培面積超過2 600 hm2，獼猴桃產(chǎn)業(yè)已成為奉新農(nóng)業(yè)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)［3］。然而，隨著奉新獼猴桃生產(chǎn)規(guī)模的逐年擴(kuò)大，獼猴桃灰霉病也日益突出。該病害在奉新主要發(fā)生在獼猴桃果實(shí)貯藏期，在花期和掛果期較少發(fā)生，病果率通常在10%左右，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)20%以上。果實(shí)受害時(shí)常從果蒂處開始變褐腐爛，逐漸向臍部擴(kuò)展而造成全果發(fā)病，病果表面常出現(xiàn)白色至灰色霉層，有時(shí)可見黑色不規(guī)則形菌核。灰霉病已對(duì)奉新獼猴桃果實(shí)貯藏產(chǎn)生了較大影響。鑒于目前國內(nèi)對(duì)獼猴桃灰霉病研究相對(duì)較少的現(xiàn)狀，筆者對(duì)奉新獼猴桃灰霉病進(jìn)行了病菌分離鑒定，并就溫度對(duì)病菌菌絲生長的影響和不同藥劑對(duì)其室內(nèi)毒力大小進(jìn)行了測定，以期增進(jìn)對(duì)獼猴桃灰霉病的了解，并為該病害的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

病果：分別從江西奉新縣農(nóng)業(yè)局冷藏庫和江西新葉有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品有限公司冷藏庫中采集具典型灰霉病癥狀的獼猴桃病果（‘金魁’），各采集25個(gè)，采回后立即進(jìn)行病菌分離。

供試藥劑：共11種，分別為25%吡唑醚菌酯乳油，50%烯酰嗎啉可濕性粉劑，50%啶酰菌胺水分散粒劑，均由巴斯夫（中國）有限公司生產(chǎn)；75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑，50%異菌脲懸浮劑，43%戊唑醇懸浮劑，均由拜耳作物（中國）有限公司生產(chǎn)；40%氟硅唑乳油，52.5%噁唑菌酮·霜脲氰水分散粒劑，均由上海杜邦農(nóng)化有限公司生產(chǎn)；10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑，由先正達(dá)（中國）投資有限公司生產(chǎn)；50%福美雙可濕性粉劑，由河北贊峰生物工程有限公司生產(chǎn)；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，由江蘇龍燈化學(xué)有限公司生產(chǎn)。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)上，用70%乙醇擦拭消毒病果表皮，待乙醇揮發(fā)后撕去病果皮，將發(fā)病果肉移于備好的PDA平板上，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待果肉四周長出菌絲體后，挑取菌落邊緣菌絲體，將其轉(zhuǎn)移至新的PDA平板上對(duì)其進(jìn)行純化獲得純培養(yǎng)。將所獲得的純培養(yǎng)分別置5、10、15、20、25、30和35℃7個(gè)不同溫度中進(jìn)行培養(yǎng)，跟蹤觀測菌落形態(tài)和顏色變化，并測量不同溫度下的菌絲生長速率。斜面甘油保存菌種于4℃冰箱備用。

1.3 致病性測定

按照柯赫氏法則，對(duì)分離得到的病菌在離體獼猴桃（‘金魁’）上進(jìn)行致病性測定。方法如下：接種分刺傷和非刺傷兩種方式進(jìn)行。刺傷接種：去除供試果接種面的果毛后用乙醇擦拭消毒，待乙醇風(fēng)干后用無菌打孔器打取一個(gè)直徑約5 mm的傷口面，以直徑為5 mm的菌餅為接種體，將接種體菌絲面緊貼傷口面進(jìn)行接種，設(shè)無菌PDA基塊作對(duì)照，每處理3次重復(fù)，接種后用無菌濕棉球保濕，置25℃培養(yǎng)箱中逐日觀測接種果發(fā)病情況，待果實(shí)發(fā)病后從病部再次分離病原菌。非刺傷接種，直接將接種體菌絲面緊貼果實(shí)消毒面進(jìn)行接種，其余方法步驟同刺傷接種。

1.4 病原菌的分子鑒定

采用CTAB法提取病原菌基因組DNA［4］，并用真核生物通用引物對(duì)ITS1（ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，）擴(kuò)增r DNA-ITS序列［5］。擴(kuò)增反應(yīng)體系：ITS1（10 pmol／L）1μL、ITS4（10 pmol／L）1μL、DNA模板2μL、2×Taq PCR Master Mix 25μL，加dd H2O 21μL至終體積50μL?；靹蚝蟀匆韵鲁绦蜻M(jìn)行PCR擴(kuò)增：94℃3 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。陰性對(duì)照用dd H2O取代DNA模版。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托天根生化（北京）有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)DNAStar（Madison Wisconsin，USA）軟件進(jìn)行序列分析去除兩端引物后BLAST與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行相似性比較，確定病原菌歸屬。

1.5 室內(nèi)毒力測定方法

采用菌絲生長速率法測定11種藥劑對(duì)獼猴桃灰霉病菌的抑菌作用［6］。具體方法如下：用無菌水將各藥劑按有效成分分別稀釋為1.0×104、2.5× 103、6.3×102、1.6×102、3.9×101、1.0×101、2.4× 100、6.1×10-1、1.5×10－1μg／m L 9個(gè)不同濃度的藥液，取1 m L藥液與9 m L約50℃的PDA混勻配制含不同濃度的含藥PDA平板，以無菌水作為對(duì)照，用直徑5 mm的無菌打孔器在適齡菌落邊緣同一圓周上打取菌餅，將其接至PDA平板中央，每平板接一個(gè)菌餅，每處理3個(gè)重復(fù)，接菌后置25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率，用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，求得毒力回歸方程、EC50和相關(guān)系數(shù)，根據(jù)EC50大小評(píng)價(jià)殺菌劑的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌分離及形態(tài)特征

共對(duì)50個(gè)發(fā)病獼猴桃進(jìn)行病菌分離，經(jīng)純化后觀測比較發(fā)現(xiàn)，所有菌株的形態(tài)特征一致，因此將其視為同一種真菌，選取一個(gè)代表性菌株編號(hào)HM-1，對(duì)其形態(tài)特征描述如下：在25℃條件下，菌落蓬松絨毛狀，初為白色，后逐漸變?yōu)榛野咨?，邊緣不整齊，生長速率為20.17 mm／d，培養(yǎng)15 d后平板上可見大小約（1～4）mm×（1～2）mm的不規(guī)則黑色菌核，25 d后可見菌核上產(chǎn)生大量的灰色菌絲體（圖1a～b），顯微鏡檢分生孢子梗叢生，大小約為（200～300）μm×（11～16）μm，淡褐色，頂端分枝，其上附著分生孢子，分生孢子脫落后露出棒頭狀小柄（圖1c），分生孢子卵圓形或橢圓形，無色或淡灰褐色，單胞，大小為（8.75～13.75）μm×（6.25～8.75）μm（圖1d），該病菌在5～30℃的溫度范圍內(nèi)均能正常生長，最適生長溫度為20℃（生長速率25.11 mm／d），大于35℃時(shí)菌落停止生長（圖2）。根據(jù)病原的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，初步將該病原菌鑒定為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

圖1 病原菌HM-1形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological characteristics of HM-1

圖2 溫度對(duì)HM-1菌絲生長的影響Fig.2 Effects of temperature on mycelial growth of HM-1

圖3 HM-1菌株對(duì)獼猴桃的致病性測定Fig.3 Pathogenicity assays of HM-1 to kiwifruit

2.2 致病性測定

致病性測定結(jié)果表明：接種96 h后，刺傷接種的獼猴桃開始發(fā)病，從接種口開始有大量絨狀灰白色菌絲產(chǎn)生，接種口周圍果實(shí)發(fā)軟腐爛（圖3a），刺傷對(duì)照接種和非刺傷接種均不表現(xiàn)出發(fā)病癥狀（圖3b～d）。對(duì)接種發(fā)病的獼猴桃再次進(jìn)行病菌分離，分離結(jié)果獲得與接種菌一致的病原菌。

2.3 病原菌的分子鑒定

以供試菌株HM-1基因組DNA為模板，用引物ITS1／ITS4對(duì)其rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序去除兩端引物后獲得大小為500 bp的片段（GenBank登錄號(hào)為JX885685），經(jīng)BLAST與NCBIGenBank中已有序列進(jìn)行相似性比較分析，分析結(jié)果表明該菌株與一株來自西班牙的Botryotinia fuckeliana（GenBank登錄號(hào)為FN812726）菌株大小均為500 bp，且無堿基差異，相似性為100%。根據(jù)序列分析結(jié)果將其菌株HM-1鑒定為Botryotinia fuckeliana。

由于Botrytis cinerea的有性態(tài)即為Botryotinia fuckeliana，所以結(jié)合病菌的形態(tài)學(xué)特征、致病性測定和分子鑒定結(jié)果，確定引起獼猴桃灰霉病的病原菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）（有性態(tài)為富氏葡萄核盤菌Botryotinia fuckeliana）。

2.4 不同藥劑對(duì)獼猴桃灰霉病菌的抑菌效果

室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，不同藥劑對(duì)獼猴桃灰霉病菌菌絲生長均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用（表1），其中，肟菌·戊唑醇、氟硅唑和異菌脲的抑菌效果很好，EC50分別為0.118 0、0.288 6和0.355 2μg／mL；其次為苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇和吡唑醚菌酯，EC50分別為1.541 8、1.760 2和1.778 4μg／m L；噁唑菌酮·霜脲氰和烯酰嗎啉的抑菌效果較差，其EC50分別高達(dá)86.381和415.22μg／mL。

表1 11種藥劑對(duì)獼猴桃灰霉病菌的毒力回歸方程Table 1 Toxicity regression equation of 11 fungicides against gray mold pathogen of kiwifruit

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，rDNA-ITS序列分析已成為植物病原真菌分類鑒定研究中一種常用、快速、靈敏且準(zhǔn)確可靠的手段。本研究應(yīng)用r DNAITS序列分析和病原的形態(tài)特征相結(jié)合，確定引起奉新獼猴桃灰霉病的病原菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）（有性態(tài)為富氏葡萄核盤菌B.fuckeliana），兩種方法鑒定結(jié)果相互印證，使病原鑒定結(jié)果可靠性更強(qiáng)。

Botrytis cinerea（有性態(tài)B.fuckeliana）屬半知菌類，絲孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，葡萄孢屬真菌，是一類重要的植物致病菌，主要危害包括獼猴桃在內(nèi)的苗圃植物、蔬菜、觀賞園藝植物、田間（果園）作物、儲(chǔ)藏和運(yùn)輸過程中的農(nóng)產(chǎn)品等［7］。由Botrytis cinerea（B.fuckeliana）引起的獼猴桃灰霉病是獼猴桃生長期和采后儲(chǔ)藏期的重要病害之一，該病害自20世紀(jì)80年代初在美國、意大利和新西蘭被發(fā)現(xiàn)報(bào)道以來［8-10］，到目前為止已在日本、韓國、智利和土耳其等多個(gè)國家和地區(qū)被陸續(xù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)［7，11-13］。該病害在報(bào)道的國家和地區(qū)都曾帶來嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失，如20世紀(jì)90年代在美國加利福尼亞州和新西蘭獼猴桃種植區(qū)發(fā)生時(shí)造成當(dāng)?shù)丶s20%～30%的經(jīng)濟(jì)損失［14］，我國于1990年在陜西周至縣發(fā)現(xiàn)該病害，造成約450 hm2獼猴桃有不同程度的發(fā)病，發(fā)病率高達(dá)8.7%，給當(dāng)?shù)孬J猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來較大的損失［15］。

目前國內(nèi)對(duì)獼猴桃灰霉病研究相對(duì)甚少，防治該病目前仍以化學(xué)防治為主，煙劑2號(hào)（陜西動(dòng)物研究所研制）、乙烯菌核利、異菌脲和二甲酰亞胺是目前國內(nèi)防治獼猴桃灰霉病的常用藥劑［16-17］。國外的研究已從傳統(tǒng)的化學(xué)防治逐漸向植物源農(nóng)藥和生物防治方面發(fā)展?；瘜W(xué)防控方面，Michailides和Bardas等人研究表明乙烯菌核利、啶酰菌胺和吡唑醚菌酯對(duì)獼猴桃灰霉病具有較好的防控作用［14，18］；Minas等人研究表明在冷庫中用臭氧處理可以大大降低獼猴桃灰霉病的發(fā)生［19］。植物源農(nóng)藥方面，F(xiàn)atemia和Shirzad等報(bào)道從百里香、茴香、夏得薄荷、葛縷子和茴芹等植物中提取的香油精對(duì)獼猴桃灰霉病菌具有很好的抑菌作用［20-21］；Kulakiotu等對(duì)歐洲葡萄和美洲葡萄揮發(fā)物進(jìn)行研究后得出美洲葡萄揮發(fā)物對(duì)獼猴桃灰霉病具較好的防治作用［22］。生物防控方面，Boyd-wilson等研究表明Alternaria、Epicoccum和Ulocladium spp.三類真菌與獼猴桃灰霉病菌具有很好的競爭作用，可以減弱獼猴桃灰霉病菌的致病力［23］。

目前生物防治和植物源農(nóng)藥在獼猴桃灰霉病的防治方面在國內(nèi)尚未被推廣，具體防效如何未知，所以化學(xué)防治還是首選的防控措施。在本研究所篩選出的6種藥劑中，異菌脲和吡唑醚菌酯，前人已有報(bào)道在田間具有較好的防控作用［17-18］，而肟菌·戊唑醇、氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇為首次有針對(duì)性地開展對(duì)獼猴桃灰霉病菌的藥劑篩選研究。由于本研究是在室內(nèi)完成，所以在推廣到田間病害防控之前，還需進(jìn)一步做田間防效試驗(yàn)，此外還需考慮藥劑的成本、對(duì)獼猴桃生長和環(huán)境是否有影響，力爭施用低毒、低殘留、低成本的高效環(huán)保型殺菌劑。

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中圖分類號(hào)：S 436.634

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.008

收稿日期：2013-07-10

修訂日期：2013-08-31

基金項(xiàng)目：江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（GJJ13269）；國際合作項(xiàng)目（200DFA31050）

*通信作者E-mail：jxau2011＠126.com

Identification of the pathogenic fungus of kiwifruit gray mold and indoor screening of fungicides

Li Cheng1， Jiang Junxi1， Zhao Shanggao2， Li Bangming2， Yu Qiang2， Tu Guiqing2
（1.College of Agronomy，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China；2.Agricultural Bureau of Fengxin County，F(xiàn)engxin 330700，China）

AbstractThe pathogen causing gray mold on kiwifruit in Fengxin County of Jiangxi Province was identified as Botrytis cinerea（anamorph Botryotinia fuckeliana）by morphological characteristics，pathogenicity test and sequence homology analysis of r DNA-ITS.The pathogenic fungus could normally grow at 5－30℃，and penetrate fruit of kiwifruit only through wound infection.Following identification of the pathogen，toxicity test of 11 fungicides to B.cinerea was carried out in the laboratory by using mycelium growth rate method，and the results showed that trifloxystrobin·tebuconazole WG，flusilazole EC，rovral SC，difenoconazole WG，tebuconazole SC and pyraclostrobin EC had higher inhibition effects to the pathogen.The EC50values were 0.118 0μg／m L，0.288 6μg／m L，0.355 2μg／m L，1.541 8μg／m L，1.760 2μg／m L and 1.778 4μg／m L，respectively.

Key wordsgray mold of kiwifruit； Botrytis cinerea； toxicity test