血必凈注射液中芍藥苷的降解動力學研究

蒲位凌， 任曉亮， 邱喜龍， 張慧杰， 戚愛棣

（天津中醫(yī)藥大學， 天津 300193）

血必凈注射液中芍藥苷的降解動力學研究

蒲位凌， 任曉亮*， 邱喜龍， 張慧杰， 戚愛棣

（天津中醫(yī)藥大學， 天津 300193）

目的 研究芍藥苷 (Paeoniflorin) 在血必凈注射液及水溶 液中， 不同 pH、 溫 度下降解的 動力學規(guī)律。 方 法

芍藥苷； 血必凈注射液； pH； 溫度； 降解動力學

血必凈注射液是在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，經(jīng)現(xiàn)代制劑工藝精制開發(fā)的中藥復(fù)方注射液。該藥由丹參、紅花、川芎、當歸和赤芍五味中藥組成，臨床上常與抗生素聯(lián)用，治療膿毒癥及多器官功能障礙綜合癥［1-2］。 有文獻報道其與炎癥靶點 COX-2、 5-LOX、 IKK-2 之間存在較好的結(jié)合和抑制效應(yīng)［3］。 有文獻報道， 其對神經(jīng)系統(tǒng)［4］、 免疫系統(tǒng)［5］、心血管系統(tǒng)［6］都有調(diào)節(jié)作用。 鮑天冬等［7］對芍藥苷的體內(nèi)藥動學研究表明其在大鼠體內(nèi)屬于線性藥動學過程。芍藥苷為中藥赤芍的有效成分之一［8］， 也是血必凈注射液中具有抗炎作用的活性成分之一，芍藥苷量受產(chǎn)地、加工方法等多種因素的影響［9］。 冀蘭鑫等［10］測定了血必凈注射液中的11種主要成分， 其中芍藥苷含有量較高。 本實驗從化學反應(yīng)動力學角度對比了芍藥苷在血必凈注射液中和水溶液中的降解規(guī)律，為完善該注射液的質(zhì)控方法和改進劑型穩(wěn)定性提供依據(jù)。

芍藥苷為一種蒎烷單萜苷類物質(zhì)，具有抗炎保肝的作用［11］， 化學結(jié)構(gòu)如圖 1。 芍藥苷結(jié)構(gòu)中酯鍵、 糖苷鍵和縮醛結(jié)構(gòu)，可能被酸或堿催化分解，即不穩(wěn)定基團。有研究表明， 芍藥苷在堿性及高溫條件下不穩(wěn)定［12-13］。 陳劍平［14］等研究表明芍藥苷在不同制劑工藝因素下穩(wěn)定性不同，加熱溫度及時間是影響芍藥苷量的主要因素。因此對其穩(wěn)定性的研究就較為重要，進而有利于血必凈注射液的質(zhì)量控制研究。

圖1 芍藥苷結(jié)構(gòu)

1 儀器與試藥

SHIMADZU高 效 液 相 色 譜 儀 ( 日 本 島 津)， SPD-20A UV-VIS 檢 測 器； BT1250D分 析 天 平 (Sartorius公司)； HH-8S 數(shù)顯恒溫水浴鍋 ( 金壇市盛藍儀器制造有限公司)； DELTA 320 pH計 (瑞士 METTLER TOLEDO公司)。

血必凈注射液 (天津紅日藥業(yè)股份有效公司， 規(guī)格為每支 10mL， 批號 1205301)； 芍藥苷對照品 (天津中新藥業(yè)研究中心， 純度≥98%)； HPLC分析用乙腈為色譜純(Sigma公司)； 娃哈哈純凈水； 氫氧化鈉、 碳酸鈉、 濃鹽酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法的建立 Waters SymmetryTMRP18色譜柱 (4.6 mm×150 mm， 5 μm)； 流動相為乙腈 (A)-水 (B) 梯度洗脫 (見表 1)； 體積流量 1 mL/min； 柱溫為室溫； 檢測波長 230 nm［15］； 進樣量 10 μL。 其色譜圖見圖 2。

表1 梯度洗脫條件

圖2 芍藥苷對照品 （A） 和血必凈注射液（B） 的 HPLC色譜圖

2.1.1 線性關(guān)系試驗 精確稱取 10.82mg芍藥苷于 10mL棕色瓶中， 以純水定容， 配制成質(zhì)量濃度為 1.082 mg/mL的芍藥苷貯備液。精密量取對照品貯備液適量，制得質(zhì)量濃度分別為 5.41、 10.82、 21.64、 43.28、 64.92、 86.56、108.20 μg/mL， 置于 5 mL棕色量瓶中， 搖勻， 按 “2.1”項下的色譜條件， 將上述 7 份對照品溶液分別進樣 10 μL，以峰面積 (Y) 為縱坐標， 質(zhì)量濃度 (X， μg/mL) 為橫坐標進行線性回歸， 得回歸方程:Y=1.416 4 ×104X-1 756，r=0.999 8。 結(jié)果表明， 芍藥苷在 5.41 ～108.20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度試驗 取 “2.1.1” 項下質(zhì)量濃度為 21.62 μg/m L的對照品溶液， 重復(fù)進樣 6 次， 記錄峰面積， 計算得 RSD值為 0.5%。 表明儀器及進樣精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗 取芍藥苷對照品貯備液 6 份， 分別用去離子水稀釋至 21.64 μg/mL， 進樣測定。 結(jié)果芍藥苷RSD為 1.0%， 表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4 加樣回收率試驗 精密量取芍藥苷貯備液 130 μL和 100 μL血必凈注射液于 5 mL棕色量瓶中， 渦旋混勻，以純水定容至刻度。 平行配制6 份， 分別取上述溶液10 μL進 HPLC測定， 記錄峰面積， 通過外標法計算， 得平均加樣回收率為 99.86%， RSD為 1.0%， 見表 2。

表 2 加樣回收率試驗 （n=6）

2.2 芍藥苷水溶液在不同環(huán)境下的穩(wěn)定性研究

2.2.1 不同 pH的緩沖液及芍藥苷貯備液的配制 用適量濃 HCl、 Na2CO3及 NaOH溶液配制 pH 1 至 pH 13 的一系列緩沖液。 另外， 將10 mL棕色量瓶用消毒酒精滅菌后， 精確稱取 11.07mg芍藥苷于量瓶中， 以純水定容， 配制成質(zhì)量濃度為 1.107 mg/mL的芍藥苷貯備液。

2.2.2 芍藥苷在不同 pH下的穩(wěn)定性研究 取芍藥苷貯備液 275 μL， 置于經(jīng)酒精滅菌 5 mL的棕色量瓶中， 用一系列緩沖溶液分別定容至刻度，渦旋混勻，得到芍藥苷在不同 pH條件下的樣品溶液， 分別用 HPLC測定溶液中芍藥苷的初始質(zhì)量濃度 (C0)。 將樣品溶液密封并于室溫條件下放置，間隔一定的時間對樣品取樣，測定溶液中芍藥苷的剩余質(zhì)量濃度 (Ct)。 按照上述方法重復(fù)實驗一次。 以芍藥苷剩余質(zhì)量濃度的對數(shù) ［ln(Ct/C0)］ 對時間 (t) 作圖，見圖3。

圖 3 在不同 pH條件下芍藥苷在水溶液中相對剩余質(zhì)量濃度對數(shù) ［ln（Ct/C0）］ 與時間 t關(guān)系圖

將測定結(jié)果進行擬合，擬合結(jié)果可得芍藥苷的降解過程符合一級動力學，其相關(guān)動力學方程、降解速率常數(shù)(k) 等見表 3。

pH與 lnk 的關(guān)系作圖。 由圖 3 可知， 芍藥苷水溶液在酸性條件 (pH2 ～6) 下較穩(wěn)定， pH1 中有極緩慢的降解，在中性和堿性條件下不穩(wěn)定。 當 pH＞9 后， 降解速率明顯加快。

表3 在不同溫度下芍藥苷降解動力學曲線擬合結(jié)果

2.2.3 芍藥苷在不同溫度下的穩(wěn)定性研究 移取 275 μL芍藥苷貯備液置于 5 mL滅菌量瓶中， 以超純水定容，混勻， 制得樣品溶液， 并分別用 HPLC測定溶液中芍藥苷的初始質(zhì)量濃度 (C0)。 將樣品溶液密封， 分別置于溫度為65、 75、 85、 95 ℃的恒溫水浴鍋中， 間隔一定的時間對樣品取樣， 測定溶液中芍藥苷的殘余質(zhì)量濃度 (Ct)。 按照上述方法重復(fù)實驗一次。 以芍藥苷剩余質(zhì)量濃度的對數(shù) ［ln (Ct/C0)］ 對時間 (t) 作圖， 見圖 4。

圖4 芍藥苷在不同溫度下相對剩余質(zhì)量濃度對數(shù)值［ln Ct/C0］ 與時間 （t） 關(guān)系圖

通過對芍藥苷在水溶液中在不同溫度下降解得到的擬合曲線方程可知其表觀速率常數(shù) k， 并根據(jù)阿侖尼烏斯方程 ln k=ln A-Ea/RT， 可計算其活化能， 結(jié)果見表 3。 結(jié)果表明，芍藥苷在水溶液中的降解反應(yīng)速率隨溫度的升高而加快，該反應(yīng)呈現(xiàn)一級動力學規(guī)律，反應(yīng)的活化能較高，表明芍藥苷在中性水溶液中較為穩(wěn)定。

2.3 芍藥苷在血必凈注射液中的穩(wěn)定性研究

2.3.1 血必凈注射液中的芍藥苷在不同 pH下的穩(wěn)定性研究 用適量濃 HCl、 Na2CO3及 NaOH溶液配制 pH1 至 pH13的一系列緩沖液。 取血必凈注射液 200 μL， 置于經(jīng)酒精滅菌5 mL的棕色量瓶中， 用一系列緩沖溶液分別定容至刻度， 渦旋混勻， 得到注射液在不同 pH條件下的樣品溶液，分別用 HPLC測定溶液中芍藥苷的初始質(zhì)量濃度 (C0)。 將樣品溶液密封并于室溫條件下放置，間隔一定的時間對樣品取樣， 測定溶液中芍藥苷的剩余質(zhì)量濃度 (Ct)。 按照上述方法重復(fù)實驗一次。 以芍藥苷剩余質(zhì)量濃度的對數(shù) ［ln (Ct/C0)］ 對時間 (t) 作圖， 見圖 5。 pH與 ln k的關(guān)系見圖 6。 根據(jù)數(shù)據(jù)可知注射液中芍藥苷在堿性和強酸 (pH 1)環(huán)境不穩(wěn)定， 在酸性 (pH 2 ～6) 條件下穩(wěn)定。

圖5 不同 pH條件下芍藥苷在血必凈注射液中相對剩余質(zhì)量濃度對數(shù)值 ［ln（Ct/C0）］ 與時間關(guān)系圖

圖6 在不同溶液中芍藥苷的降解速率常數(shù) （ln k） 的比較

2.3.2 血必凈注射液中的芍藥苷在不同溫度下的穩(wěn)定性研究 移取 200 μL血必凈注射液于 5 mL滅菌量瓶中， 以超純水定容， 混勻， 制得樣品溶液， 并分別用 HPLC測定注射液中芍藥苷的初始質(zhì)量濃度 (C0)。 將樣品溶液密封，分別置于溫度為 65、 75、 85、 95 ℃的恒溫水浴鍋中， 間隔一定的時間對樣品取樣，測定溶液中芍藥苷的殘余質(zhì)量濃度 (Ct)。 按照上述方法重復(fù)實驗一次。 由不同時間對芍藥苷剩余質(zhì)量濃度的對數(shù) ［ln(Ct/C0)］ 對時間 (t) 作圖，見圖7。結(jié)果表明， 芍藥苷在血必凈注射液中的降解反應(yīng)速率隨溫度的升高而加快，該反應(yīng)呈現(xiàn)一級動力學規(guī)律，反應(yīng)的活化能較高， 見表 4， 表明芍藥苷在血必凈注射液中較為穩(wěn)定。

2.4 各 pH條件下的半衰期和有效期預(yù)測

圖7 在不同溫度下芍藥苷在血必凈注射液中相對剩余質(zhì)量濃度 對 數(shù) 值 ［ ln（ Ct/C0）］ 與時 間 關(guān)系圖

表4 在不同溫度下注射液中芍藥苷降解動力學曲線擬合結(jié)果

芍藥苷分別在水溶液和血必凈注射液中不同 pH下降解，測得兩種介質(zhì)中芍藥苷的相對剩余含量相比較，根據(jù)一級反應(yīng)速率方程 ln(C0/Ct)=kt， 計算降解速率常數(shù) k、有效期 t0.9和半衰期 t0.5， 如表 5。 芍藥苷在不同溶液中降解速率 ln k對 pH作圖。 結(jié)果表明， 芍藥苷在水溶液和血必凈注射液中的降解趨勢一致，在注射液中的穩(wěn)定性稍高于水溶液。

表 5 在不同 pH溶液中芍藥苷試驗結(jié)果的比較

2.5 各溫度下半衰期及有效期預(yù)測 芍藥苷分別在水溶液和血必凈注射液中不同溫度 (65， 75， 85， 95 ℃)下降解，測得兩種介質(zhì)中芍藥苷的相對剩余質(zhì)量濃度相比較， 根據(jù)公式 t0.5=ln2/k和 t0.9=0.105 4/k預(yù) 測 有 效期 t0.9和半衰 期 t0.5， 如 表 6 。 芍 藥 苷 在 不 同 溶 液 中 降 解速率 ln k對 1/T作圖 ( 圖 8) 。 結(jié)果表明， 芍藥苷在水溶液和血必凈注射液中的降解趨勢一致，在注射液中的穩(wěn)定性稍高于水溶液中。

表6 在不同溫度下芍藥苷試驗結(jié)果的比較

圖 8 溫度 （1/T） 與芍藥苷降解速率常數(shù) （ln k） 之間的關(guān)系

3 結(jié)論與討論

3.1 實驗結(jié)果表明， 在加熱和堿性條件下， 芍藥苷的降解屬于一級動力學反應(yīng)。 另外， 在強酸條件下 (pH1)， 芍藥苷在室溫條件下也有很緩慢的降解，推測可能是由于酸堿降解機理不同造成。通過對比芍藥苷在水溶液和血必凈注射液中的降解速度可知，二者降解趨勢大體一致，但芍藥苷在血必凈注射液中比在水溶液中穩(wěn)定，即制劑水平下芍藥苷較穩(wěn)定。本實驗為芍藥苷的使用、貯存及制劑研究和質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

3.2 在 pH1 ～13 一系列的緩沖溶液體系下， 當 pH大于 12后， 降解過快， 故本實驗結(jié)果中 pH的上限為: 水溶液中pH為 11， 注射液中為 12。 芍藥苷在 pH2 ～6 的條件下穩(wěn)定， 故在圖表中未顯示 pH2 ～6 的數(shù)據(jù)結(jié)果。 另外， 為準確表征其降解速率變化較快的區(qū)間，實驗中在降解速度變化較大的 pH區(qū)間進一步縮小 pH間隔以更精確的描繪降解速率隨 pH變化的趨勢。

3.3 芍藥苷為蒎烷型雙環(huán)單萜苷， 其中有酯鍵、 苷鍵及縮醛結(jié)構(gòu)。酯鍵在堿催化下較易發(fā)生水解反應(yīng)；糖苷鍵中的苷鍵原子在酸性環(huán)境中易被質(zhì)子化而裂解；縮醛結(jié)構(gòu)在酸性條件下也易斷裂。在對其降解產(chǎn)物進行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)其中有幾種新物質(zhì)出現(xiàn)，初步判定其為降解產(chǎn)物。其降解產(chǎn)物及降解機理需進一步實驗確定。

3.4 波長及流動相選擇 考慮分析時間及分離效果等因素， 采用乙腈-水為流動相， 由于注射劑成分較復(fù)雜， 采用梯度洗脫并用高比例乙腈將干擾成分全部洗脫。芍藥苷的最大吸收波長為 230 nm， 在此波長下， 芍藥苷響應(yīng)值高，而且在注射劑中的選擇性高，其他成分不干擾芍藥苷測定，故選擇 230 nm為測定波長。

［ 1 ］ 王金達， 雪 琳.細菌、 內(nèi)毒素、 炎性介質(zhì)并治——治療重癥膿毒病的新對策［J］.中國危重病急救醫(yī)學， 1998， 10 (6):323.

［2］ 高紅梅，常文秀，曹書華.“血必凈” 注射液對內(nèi)毒素刺激的內(nèi)皮細胞的影響［J］.中國急救醫(yī)學， 2005， 25(6):437.

［3］ 馬世堂，劉培勛，龍 偉，等.血必凈抗炎作用藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和多靶點作用效應(yīng)［J］.物理化學學報， 2009， 25(10): 2080-2086.

［ 4 ］ Chang Yan， Zhang Lei， Wang Chun， etal.Paeoniflorin inhibits function of synoviocytes pretreated by rIL-1α and regulates EP4receptor expression ［ J］ .J Ethnopharmacol， 2011， 137 (3):1275-1282.

［ 5 ］ 孫麗榮， 曹 雄， 侯鳳青， 等.芍藥苷研究進展［J］.中國中藥雜志， 2008， 33(18):2028-2032.

［ 6 ］ Lin Jingrui， Bi Kaishun， Wang Lingzhi， et al.Inhibitory Effects of Paeonidlorin on ACE Activity in Vitro［ J］ .Mode Tradit Chin Med Mater Med， 2009 ， 11(2):249-252.

［ 7 ］ 鮑天冬， 張英豐， 李玉潔， 等.LC-MS 研究炒白芍提取物中芍藥苷在大鼠體內(nèi)的藥代動力學［J］.中國中藥雜志，2010， 35(9):1193-1196.

［ 8 ］ 楊媛媛， 周 剛， 馬曉康， 等.赤芍的研究進展［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報， 2008， 27(1):67-69.

［9］ 呂 華，郭蘭萍.不同因素對白芍中芍藥苷含量的影響研究進 展 ［ J］.中 國 醫(yī) 院 藥 學 雜 志， 2012， 32(20): 1643-1645.

［10］ 冀蘭鑫， 黃 浩， 姜 民， 等.HPLC測定血必凈注射液內(nèi)11 種主要 成分 ［ J］.中 國 中 藥 雜志， 2010， 35(18): 2395-2398.

［11］ 全國中草藥會編編寫組.全國中草藥匯編: 上冊［M］.2版.北京: 人民出版社， 2000:290.

［12］ 姚仲青， 朱 虹， 姚海峰.溫度及 pH對赤芍總苷穩(wěn)定性的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥， 2006， 17(7):1214-1215.

［13］ 閆興麗， 張建軍， 李小燕， 等.溫度對白芍藥材、 白芍提取物及乾坤清顆粒成品中芍藥苷含量穩(wěn)定性的影響［J］.中草藥， 2003， 34(2):131-133.

［14］ 陳劍平， 林榮鋒， 張惜強， 等.滋腎寧神膠囊中芍藥苷在制劑工藝中的熱穩(wěn)定性考察［J］.中成藥， 2010， 32(5):767-769.

［15］ 李中娥.HPLC法同時測定婦科分清丸中阿魏酸和芍藥苷［J］.中成藥， 2012， 34(3):487-489.

927.11

:B

:1001-1528(2014)02-0404-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.045

2013-02-05

國家 自 然 科 學 基 金 青 年 基 金 項 目 (81102732)； 教 育 部 高 等 學 校 博 士 學 科 點 專 項 科 研 基 金 新 教 師 基 金 項 目(20111210120006)

蒲位凌 (1988—) ， 女， 碩士生， 研究方向: 藥物分析。 Tel:15202206313， E-mail:linlin8229@163.com

*通信作者: 任曉亮 (1980—) ， 男， 研究方向: 藥物分析。 Tel:(022)59596221， E-mail:xiaoliang-ren@sina.com

采用高效液相色譜法 (HPLC) 考察不同 pH和溫度對芍藥苷穩(wěn)定性的影響， 利用化學反應(yīng)動力學模型及 Arrhenius公式分析芍藥苷在不同條件下的降解規(guī)律并計算降解反應(yīng)動力學參數(shù)。結(jié)果 芍藥苷在堿性和加熱時降解較快，符合一級動力學規(guī)律， 堿性條件下隨pH升高， 降解速度明顯增加。 計算得芍藥苷在水溶液和血必凈注射液中降解活化能分別為 114.70 kJ/mol和 122.80 kJ/mol。 結(jié)論 芍藥苷在堿性和強酸性條件下不穩(wěn)定。 相同條件下， 芍藥苷在血必凈注射液中的穩(wěn)定性都要高于其水溶液。