二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化紅芪總多糖與皂苷的酶解提取工藝

魏舒暢， 陳方圓， 閆治攀， 金 輝， 王繼龍（甘肅中醫(yī)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000）

二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化紅芪總多糖與皂苷的酶解提取工藝

魏舒暢， 陳方圓， 閆治攀， 金 輝， 王繼龍（甘肅中醫(yī)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000）

目的 采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解提取紅芪總多糖與皂苷的工藝。方法 在均勻設(shè)計(jì)及單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定生物酶用量、酶解時(shí)間、提取時(shí)間和加水倍量為試驗(yàn)因素，以紅芪總多糖、總皂苷提取率為指標(biāo)，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)紅芪酶解提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果 優(yōu)化所得紅芪酶解提取的最佳工藝條件為酶用量280 mg， 酶解時(shí)間 90 min， 加水量 21 倍， 提取時(shí)間 180 m in， 在此條件下， 紅芪總多糖得率為 9.58‰， 總皂苷得率為4.20‰。 結(jié)論 優(yōu)化所得紅芪酶解提取工藝穩(wěn)定可行。

紅芪；總多糖；總皂苷；酶解提取；二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)

紅芪為豆科植物多序巖黃芪 Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根， 具有補(bǔ)氣升陽、 固表止汗、 利水消腫 等功效［1］。 作為中醫(yī)常用傳統(tǒng)藥物在惡性腫瘤及各種退行性疾病的臨床治療與康復(fù)中用量較大。

酶解法提取有諸多優(yōu)點(diǎn)［2-4］， 已廣泛用于中藥制藥領(lǐng)域［5-8］， 紅芪屬纖維性根 莖類藥 材， 適合采用酶解法提取，但截至目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，能確保與試驗(yàn)中心點(diǎn)距離相等的試驗(yàn)點(diǎn)上的預(yù)測值方差相等，克服了其他統(tǒng)計(jì)方法 的 不 足 而 廣 泛 應(yīng) 用 于 科 學(xué) 試 驗(yàn) 中［9-11］。 因此，本實(shí)驗(yàn)以紅芪總多糖、總皂苷得率為指標(biāo)，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)復(fù)合酶提取紅芪多糖、皂苷的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，研究結(jié)果將為該技術(shù)用于紅芪提取物的制備提供依據(jù)，解決由于紅芪精加工基礎(chǔ)研究薄弱所致其高品質(zhì)提取物及下游產(chǎn)品較少的現(xiàn)狀。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV Blue Star B型紫外-可見分光光度計(jì) (LabTech， 北京萊伯泰科儀器有限公司)； DD-5M離心機(jī) (湘儀離心機(jī)儀器有限公司)； AL104型電子天平 (METTLER TOLEDO， 瑞士)； 電熱恒溫水浴鍋 (浙江省余姚市檢測儀表廠)； AKRYUP-1816 超純水機(jī) (成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥 纖維素酶、 果膠酶、 木聚糖酶均由甘肅華羚生物科技有限公司提供，紅芪藥材購自甘肅武都，其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅芪多糖的提取、 測定與得率計(jì)算 向紅芪藥材中加入4倍量蒸餾水，再加入一定量的酶攪勻， 于50℃酶解一段時(shí)間后迅速升溫至沸騰滅活10 min， 補(bǔ)水并回流提取， 水提液濃縮 (藥液比為1 ∶2) 后加乙醇使含醇量為 40%， 低溫靜置 24h后離心， 上清液加乙醇使含醇量為 75%，靜置離心，沉淀用蒸餾水溶解并定容，最后采用改良差示酚硫法［12］測定多糖含量。 紅芪多糖得率計(jì)算如下: y1/‰ = ［ (C×V)/M］ ×1000， 式中:C為多糖質(zhì)量濃度 (μg/mL)，V為多糖液體積 (mL)，M為紅芪質(zhì)量 (g)。

2.2 紅芪皂苷的提取、 測定與得率計(jì)算 精密吸取上述濃縮液 10 mL， 用水飽和正丁醇萃取 4 次(15、 15、 10、 10 mL)， 合并正丁醇萃取液， 水浴揮干， 殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25mL量瓶中。 紅芪皂苷的測定采用香草醛-高氯酸法［13］， 以黃芪甲苷對(duì)照品質(zhì)量 m(mg) 為橫坐標(biāo)， 以吸光度值 A為縱坐標(biāo)， 得到回歸方程 A=2.637 4 m-0.000 8 (r=0.999 3)。 紅芪皂苷得率計(jì)算如下:y2/‰ = m/M×1 000。

2.3 水提工藝考察 采用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)提取時(shí)間、加水量、提取次數(shù)三因素進(jìn)行考察，以總多糖和總皂苷得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選紅芪水提工藝，因素水平見表 1， 試驗(yàn)方案及結(jié)果見表 2。別考察纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶在用量為0、50、 100、 200、 400 mg， 酶解 2 h 條件下對(duì)紅芪總多糖與總皂苷得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 酶用量對(duì)總多糖與總皂苷得率的影響Fig.1 Effect of enzym e dosage on extraction ratio of total polysaccharide and saponin

表1 均勻設(shè)計(jì)因素水平Tab.1 Factors and levels of uniform design

表2 試驗(yàn)方案及結(jié)果Tab.2 Test scheme and results

采用 spss 17.0 軟件進(jìn)行線性回歸，得總多糖得率回歸方程 y1=1.840+0.355x1+0.350x3(F= 10.703， P＜0.05) 及總皂苷得率回歸方程 y2= 2.091+0.052x2(F=9.752， P＜0.05)， 由回歸方程可知，提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)總多糖得率有顯著影響，加水量對(duì)總皂苷得率有顯著影響，故確定最優(yōu)水提工藝為: 總加水量 24倍， 共提取 3次，每次 80 min。

2.4 單因素試驗(yàn) 在最優(yōu)水提工藝的基礎(chǔ)上，分

由圖1可知，3種不同酶隨著酶用量的增加，紅芪皂苷得率均沒有明顯提高，說明在現(xiàn)有的水提條件下單一酶解對(duì)皂苷得率貢獻(xiàn)不大。隨著纖維素酶用量的增加，紅芪多糖得率增大，當(dāng)酶用量大于100 mg時(shí)， 繼續(xù)增加酶用量， 多糖得率沒有明顯提高，說明在該用量下酶濃度已趨于飽和，繼續(xù)增加酶用量對(duì)多糖得率沒有顯著影響。果膠酶與木聚糖酶用量分別為 200 mg時(shí)， 多糖得率均達(dá)到最高，繼續(xù)增加酶用量，得率反而下降。

2.5 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)

2.5.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定由此三種酶組成的復(fù)合酶的最佳配比及酶用量的零水平，選取復(fù)合酶的酶用量(x1)、 酶解時(shí)間 (x2)、 加水量 (x3) 和提取時(shí)間(x4)4 個(gè)因素，以總多糖得率 (y1) 和總皂苷得率 (y2) 為指標(biāo)， 采用四元 (1/2 實(shí)施) 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化紅芪酶解提取工藝，試驗(yàn)因素及水平編碼見表 3， 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表 4， 4個(gè)因素對(duì)總多糖、總皂苷得率相互作用所得結(jié)果見表5～6。

表3 四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)因素水平Tab.3 Factors and levels of quadratic general rotary unitized design

表4 四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab.4 Test scheme and results in quadratic general rotary unitized design

表5 總多糖得率方差分析Tab.5 Variance analysis of extraction ratio of total polysaccharide

表6 總皂苷得率方差分析Tab.6 Variance analysis of extraction ratio of total saponin

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出擬合方程的各項(xiàng)系數(shù)，從而得到總多 糖 得 率 的 回 歸 方 程 y1=6.195 61-0.217 71x1+0.056 84x2-0.261 51x3+0.567 45x4+ 0.542 24+0.188 87-0.207 64+ 0.2770.031 75+0.336 25-0.654 25x1x4

明英宗正統(tǒng)元年六月庚戌(1436年6月29日)，法司審結(jié)劉清之罪是“領(lǐng)官軍護(hù)船料、糧米往松花江，為女直人所掠”。于是，“擬死，并追其糧、料”。但由于“清貧乏無征”，因此明英宗特為寬宥，于本年六月將他與定遼前衛(wèi)指揮同知何海等人謫戍甘州(即今甘肅省)。［10］

總皂 苷 得 率 的 回 歸 方 程 y2=3.744 99-0.085 44x1-0.027 53x2-0.069 86x3+0.023 90x4+ 0.131-0.041-0.024-0.0400.067 50x1x2+0.020 00x1x3-0.082 50 x1x4

由表5結(jié)果可知，總多糖得率回歸方程的失擬性檢驗(yàn) F1=7.844 74 ＜F0.05(5， 3)=9.01 不顯著，從而說明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾很??；顯著性檢驗(yàn) F2=3.355 25 ＞F0.05(11， 8)=3.31， 說明得到的回歸方程顯著。單因素中，僅提取時(shí)間x4達(dá)到了顯著水平， 其他幾個(gè)因素的分析均不顯著， 剔除 α=0.10 的不顯著項(xiàng)后得回歸方程 y1= 6.195 61+0.567 45x4+0.542-0.654 25x1x4。

由表6結(jié)果可知，總皂苷得率回歸方程的失擬性檢驗(yàn) F1=4.097 20 ＜F0.05(5， 3)=9.01 不顯著，從而說明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾很小；顯著性檢驗(yàn) F2=0.827 39 ＜F0.05(11， 8)=3.31， 說明得到的回歸方程不顯著。單因素中，4個(gè)因素的分析均不顯著， 剔除 α=0.10 的不顯著項(xiàng)后得回歸方程 y2=3.744 99。 由于在滿足多糖提取條件的各因素水平下皂苷早已提取完全，因此各因素及回歸方程均無顯著性。

2.5.2 總多糖得率的單因素效應(yīng)分析 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)單因素進(jìn)行效應(yīng)分析，結(jié)果見表7及圖2。

表7 總多糖得率的單因素效應(yīng)分析Tab.7 Analysis of the one-factor effect on extraction ratio of total polysaccharide

圖2 單因素效應(yīng)分析圖Fig.2 Effect analysis of single factor

由表7和圖2可知，提取時(shí)間的變化對(duì)多糖得率影響最大，隨著提取時(shí)間的增加，多糖的得率也逐漸增加。其次是酶用量，酶解時(shí)間和加水量對(duì)多糖得率的影響最小。

2.5.3 總多糖得率的交互作用效應(yīng)分析 由表 5方差分析結(jié)果可知，存在交互作用且達(dá)到顯著水平的有 x1x4， 因此僅對(duì)此組交互作用的因素作效應(yīng)分析。選取二個(gè)因素的零水平，考察另兩個(gè)因素的交互作用，分別作圖可以直觀地分析各因子間的交互作用效應(yīng)， 結(jié)果見圖3。

圖 3 酶用量 （x1） 與提取時(shí)間 （x4） 的交互作用圖Fig.3 Interp lay of enzyme dosage（ x1） and extraction tim e（ x4）

圖3 為酶用量 (x1) 與提取時(shí)間 (x4) 的交互作用圖， 由圖可以看出，當(dāng) x1處于低編碼值 x4處于高編碼值時(shí)， 二者交互作用顯著， 多糖得率 y1值處于較高水平，即低的酶用量和高的提取時(shí)間對(duì)總多糖得率是正效應(yīng)； 隨著 x1編碼值的增加與 x4編碼值的降低， y1值先下降后又有上升趨勢并處于較低的水平，呈鞍型曲面，即高的酶用量和低的提取時(shí)間對(duì)總多糖的得率也有協(xié)同作用。

表8 各變量取值的頻率分布Tab.8 Probability distribution of variables

由表 8 可知， 在 95%的置信區(qū)間總多糖得率大于 6.74‰ 各變量的取值 區(qū)間分別為 0.098 ～0.383、 -0.130 ～ 0.130、 -0.130 ～ 0.130、0.255 ～0.511， 即酶用量為 259.8 ～288.3 mg、 酶解時(shí)間為 56.1 ～93.9 min、 加水量為 20.6 ～21.4倍、 提取時(shí)間為 165.3 ～180.7 min。 考慮到實(shí)際操作性， 將最優(yōu)提取條件定為: 酶用量 280 mg、 酶解時(shí)間 90 min、加水量 21 倍、 提取時(shí)間 180 min。按此工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值， 實(shí)際測得多糖得率為 9.58‰， 與理論預(yù)測值 9.65‰接近， 進(jìn)一步驗(yàn)證了數(shù)學(xué)回歸模型合理。

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)對(duì)多因素多水平的紅芪酶解提取工藝進(jìn)行考察時(shí)，由于正交試驗(yàn)需要較多的試驗(yàn)次數(shù)且因素對(duì)指標(biāo)的影響有多大不能控制，而均勻設(shè)計(jì)雖試驗(yàn)次數(shù)較少，但精度不能保證。二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)次數(shù)少，計(jì)算簡便，又具有旋轉(zhuǎn)性，能使回歸預(yù)測值的方差成為在以球心為原點(diǎn)的球內(nèi)的一個(gè)常數(shù)，克服了二次回歸的預(yù)測值的方差強(qiáng)烈地依賴于實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在因子空間中的位置這個(gè)缺點(diǎn)，減少了誤差的干擾［14］。 因此， 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)因一致精度和較少的試驗(yàn)次數(shù)等優(yōu)點(diǎn)而有利于得到較優(yōu)的提取工藝條件。

3.2 酶解提取過程中酶用量、 酶解時(shí)間、 酶解溫度、 溶劑pH值、 溶劑用量、 提取時(shí)間等參數(shù)都會(huì)影響活性成分的提取，選擇不當(dāng)則會(huì)嚴(yán)重影響酶解工藝確立。由于3種生物酶的最適溫度均為50 ℃，最適 pH均與紅芪水提液的 pH較接近， 因此不再對(duì)其進(jìn)行考察。由于二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)能容納的因素?cái)?shù)有限，本實(shí)驗(yàn)先對(duì)紅芪水提工藝進(jìn)行優(yōu)化，篩選出有顯著性的影響因素，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝優(yōu)化更簡便有效。

3.3 本實(shí)驗(yàn)未建立起紅芪總皂苷酶解提取數(shù)學(xué)模型，主要是因?yàn)樵碥辗肿恿枯^多糖為小，提取時(shí)擴(kuò)散傳質(zhì)阻力較小，加上紅芪皂苷在水中溶解度較大，在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的影響多糖提取的各因素不同取值條件下皂苷可能均已提取完全，造成提取率無顯著差別，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在酶解提取多糖和皂苷時(shí)，當(dāng)多糖提取條件達(dá)到最佳時(shí)皂苷的提取條件也會(huì)處于最優(yōu)狀態(tài)。

3.4 隨著纖維素酶用量的增加， 紅芪多糖得率增大， 當(dāng)酶用量大于 100mg時(shí)， 繼續(xù)增加酶用量，多糖得率沒有明顯提高，說明在該用量下酶濃度已趨于飽和，繼續(xù)增加酶用量對(duì)多糖得率沒有顯著影響。 果膠酶與木聚糖酶用量分別為 200mg時(shí)， 多糖得率均達(dá)到最高，繼續(xù)增加酶用量，得率反而下降，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.5 由圖 3 可以看出， 當(dāng) x1處于低編碼值 x4處于高編碼值時(shí)， 二者交互作用顯著， 多糖得率 y1值處于較高水平，即低的酶用量和高的提取時(shí)間對(duì)總多糖得率是正效應(yīng)； 隨著 x1編碼值的增加與 x4編碼值的降低， y1值先下降后又有上升趨勢并處于較低的水平，呈鞍型曲面，即高的酶用量和低的提取時(shí)間對(duì)總多糖的得率也有協(xié)同作用。但考慮到多糖得率及因酶所致的成本問題，本實(shí)驗(yàn)選擇低的酶用量和高的提取時(shí)間。

［ 1 ］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］.北京: 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010.

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Optim ization of technological conditions for enzymatic extraction of total polysaccharide and saponin from Radix Hedysari by quadratic general rotary unitized design

WEIShu-chang， CHEN Fang-yuan， YAN Zhi-pan， JIN Hui， WANG Ji-long
(Gansu College of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China)

radix hedysari； total polysaccharide； total saponin； enzymatic extraction； quadratic general rotary unitized design.

R944

:A

:1001-1528(2014)02-0286-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.015

2013-08-01

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (81060345)

魏舒暢 (1969—) ， 男， 教授， 碩士， 從事中藥制劑工藝研究。 Tel:(0931)8765391， E-mail:wshch006@sina.com