小兒牛黃清心散預防大鼠驚厥作用的研究

李文娟， 蔣 莉， 陳恒勝， 陳小璐

（重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院 兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點實驗室， 兒科學重慶市重點實驗室，重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預防國際科技合作基地， 重慶 400014）

小兒牛黃清心散預防大鼠驚厥作用的研究

李文娟， 蔣 莉*， 陳恒勝， 陳小璐

（重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院 兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點實驗室， 兒科學重慶市重點實驗室，重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預防國際科技合作基地， 重慶 400014）

目的 觀察小兒牛黃清心散對幼年大鼠驚厥的預防效果。 方法 將 130 只 21 d 的 SD大鼠隨機分為在體研究組和腦片組。 在體研究組分為 7 個亞組: 正常對照組、 空白對照組、 生理鹽水對照組， 安定對照組 (2.632 mg/kg·d)，小兒牛黃清心散低 (0.3 g/kg·d)、 中 (8 g/kg·d)、 高劑量組 (16 g/kg·d)， 每個亞組 10 只， 安定、 小兒牛黃清心散灌胃， 早晚 2 次灌胃， 給藥 1 d。 在第 2 次給藥結束后 30 min， 除空白對照組給予等體積的生理鹽水腹腔注射外，余各組腹腔注射戊四唑 (70 mg/kg)， 觀察各組驚厥發(fā)作的潛伏期， 發(fā)作程度， 持續(xù)時間， 死亡率， 同步腦電圖變化。組織水平研究的動物分為6個亞組:正常對照組，生理鹽水對照組，安定對照組，小兒牛黃清心散低、中、高劑量組。 給藥方法同在體研究組。 在第 2 次給藥結束后 30 min， 制作急性腦片， 記錄在無鎂人工腦脊液中各組腦片皮層和海馬場電位出現(xiàn)的潛伏期，放電波出現(xiàn)的頻率，幅度。結果 小兒牛黃清心散中、高劑量干預組可明顯延長戊四唑誘導大鼠驚厥的潛伏期， 縮短驚厥發(fā)作時間， 降低死亡率 (P＜0.01)， 改善腦電圖情況， 小兒牛黃清心散中、 高劑量干預組可明顯降低無鎂誘導腦片皮層和海馬 CA1 區(qū)的發(fā)作率， 延長潛伏期， 降低場電位的頻率及波幅。 結論 小兒牛黃清心散有較好的預防幼年大鼠驚厥的作用，并呈劑量依賴性。

小兒牛黃清心散；驚厥；戊四唑；無鎂；幼年大鼠

驚厥是小兒時期最常見的神經系統(tǒng)急癥，在兒童中的發(fā)生率高達 3% ～5%， 且與成人相比， 小兒驚厥更易出現(xiàn)嚴重驚厥和驚厥持續(xù)狀態(tài)，導致驚厥性腦損傷［1］。

目前臨床上主要采用苯二氮艸卓類與抗癲癇藥物 (anti-epilepsy drugs， AEDs) 控制及預防驚厥發(fā)作，但反復服用此類藥物可能影響兒童的認知發(fā)育［2］，內分泌功能［3］及骨骼的發(fā)育［4］。 中藥是我們的祖先在長期的醫(yī)療實踐中積累起來的財富，受到國人的青睞，但由于缺少對藥物療效的科學評價，在臨床上使用受限。

因此，本實驗擬通過戊四唑制備幼年大鼠在體急性驚厥模型，并以無鎂誘導制備腦片水平的驚厥模型，在整體和組織水平，探究小兒牛黃清心散預防幼年大鼠驚厥發(fā)作的作用，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用 21 日齡 SD大鼠 130 只， 雌雄各半， 體質量 (45 ±5)g， 由重慶醫(yī)科大學動物實 驗 中 心 提 供， 動 物 許 可 證 號:syxk (渝)20040001。

1.1.2 主要試劑及器材 小兒牛黃清心散 (山東方健制藥有限公司提供， 國藥準字 Z37020495)；戊四唑 (pentylenetetrazole，PTZ) ，用 生 理 鹽 水 配成 1%的戊四唑溶液； 正常人工腦脊液 (artificial cerebrospinal fluid， ACSF， mmol/L) 配方［5］:NaCl 124，KCl2.8 ，NaHCO326，NaH2PO41.25， 維生素C 0.4， 丙酮酸鈉 2， 乳酸鈉 2，D-葡萄糖 10， CaCl22， MgSO41.2； 切片液配方 (mmol/L)［5］:KCl 3 ，NaHCO326， NaH2PO41.25， 維生素 C 0.4， 丙酮酸鈉 2， 乳酸鈉 2，D-葡萄糖 10， CaCl20.1， MgSO44，MgCl22， 蔗糖 220，( 上 述試劑均購自 sigma公司)； 振 蕩 切 片 機 ( 購 自 World Precision Instruments) ， 放 大 器 (Axon Instruments multiClamp 700B)， 顯 微 鏡 (Nikon 公 司)， 微 電 極 拉 制 器(美國 Sutter Instrument公司)， 腦電圖記錄儀 ( 美國 IWORX公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與給藥 130 只 SD大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為在體研究組和腦片組2個大組，在體研究組分為7個亞組:正常對照組、空白對照組、生理鹽水對照組，安定對照組，小兒牛黃清心散低、 中、 高劑量組， 每個亞組 10 只。 除正常對照組外， 余各組分別給予生理鹽水 2 mL/次、安定2.632mg/(kg·d)(相當于兒童 0.5 mg/kg的臨床用量)， 小 兒 牛 黃 清 心 散 0.3 g/(kg· d)， 8 g/(kg·d)， 16 g/(kg·d)灌胃［6］( 安定及小兒牛黃清心散均分別溶于等體積的生理鹽水中)。各組均于早晚2次灌胃，給藥1 d。 腦片組分為6個亞組:正常對照組、生理鹽水對照組，安定對照組，小兒牛黃清心散低、中、高劑量組。給藥方法同在體研究組。

1.2.2 模型的制作 在體研究中， 參照文獻方法，稍作改進， 在動物日齡 16 d時于皮層頂葉硬膜外放置電極［7-8］， 并繼續(xù)母乳喂養(yǎng)至 21 d 給藥［9］。 實驗動物在第二次灌胃結束后 30min， 正常對照組不予處理，空白對照組給予等體積的生理鹽水腹腔注射， 其余各組動物均給予腹腔注射戊四唑 (70 mg/kg)， 觀 察 各 組 動 物 在 戊 四 唑 腹 腔 注 射 后30 min內的行為學表現(xiàn)及死亡情況， 按照 racine［10］標準，記錄各組幼鼠驚厥發(fā)作的潛伏期，發(fā)作級別，發(fā)作持續(xù)時間。從腹腔注射生理鹽水或戊四唑后開始對各組動物進行同步腦電圖描記［7-9］。

腦片研究組， 在第 2 次灌胃結束后 30 min， 制作急性腦片［11］(切片液和記錄液配方如前所述)，記錄各組腦片的皮質區(qū)和海馬 CA1 區(qū)從無鎂誘導至場電位放電波出現(xiàn)的時間及放電波的波幅，頻率，放電持續(xù)時間，正常對照組腦片用于記錄正常人工腦脊液環(huán)境下的場電位的基線情況。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS 17.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有計量資料符合正態(tài)分布者用表示， 組間比較采用單因素方差分析， 方差齊者用 LSD法， 不齊者， 采用 Tamhane's T2(M)法， 不符合正態(tài)分布者用四分位間距 M(Q) 表示， 等級資料采用非參數(shù)的秩和檢驗， 以 α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 在體觀察小兒牛黃清心散預防戊四唑誘導驚厥的效果 以戊四唑注射后各組幼鼠驚厥發(fā)作的潛伏期，發(fā)作持續(xù)時間，發(fā)作程度，死亡數(shù)為指標，比較藥物的療效， 結果如表1。 結果顯示， 與生理鹽水對照組相比，中、高劑量的小兒牛黃清心散組的動物的驚厥發(fā)作級別明顯降低，持續(xù)時間顯著減少， 死亡率明顯降低 (P＜0.05)。 高劑量組與中劑量相比，高劑量組實驗動物驚厥發(fā)生的潛伏期顯著延長，發(fā)作級別明顯降低，持續(xù)時間明顯減少(P＜0.05)， 高劑量組與安定組相比， 無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 各組動物腦電圖的比較 各組發(fā)作持續(xù)期的典型的腦電圖檢測情況如圖1， 正常組幼年大鼠的腦電圖為低幅的 α或 β波， 散在 θ 波。 注射 PTZ后，生理鹽水組動物腦電圖異常，可見尖波、棘波、 棘-慢、 尖-慢波等癲癇波發(fā)放， 波幅較高， 安定組及清心散高劑量組動物腦電圖未見明顯異常。而使用中、低劑量組腦電圖可見散在中、高波幅的尖、棘波、尖 (棘) 慢綜合波。

表1 戊四唑誘導后各組大鼠急性驚厥潛伏期、 驚厥持續(xù)時間、 驚厥發(fā)作程度的比較 M （Q）Tab.1 Com parison of the latent period and seizure time and seizure scores of each group after the injection of PTZ M （ Q）

2.3 腦片水平研究小兒牛黃清心散預防無鎂人工腦脊液誘導驚厥的效果 在組織水平研究組中，以腦片為對象，比較各組無鎂人工腦脊液誘導后驚厥發(fā)生的潛伏期，發(fā)作率，波幅，頻率，結果如表2， 圖 2、3 所示。 正常對照組的腦片在正常的人工腦脊液環(huán)境中，皮層和海馬組織均不能誘導驚厥發(fā)生， 場電位基線平穩(wěn)， 波幅為 0mv。 在無鎂誘導的驚厥模型中，隨著無鎂誘導的潛伏期的延長，小兒牛黃清心散低、中劑量組、生理鹽水對照組均可誘導癇性放電發(fā)生，表現(xiàn)為場電位的頻率及波幅增高。而生理鹽水組、中劑量干預組、高劑量干預組， 三者比較差異有顯著意義 (P＜0.05)， 提示中劑量和高劑量干預組均可以縮短無鎂誘導驚厥發(fā)生的潛伏期，降低腦片場電位的頻率及波幅，高劑量效果較中劑量明顯，高劑量干預組可顯著降低發(fā)作率，而中劑量對發(fā)作率的改善并不明顯。中劑量干預組與低劑量干預組相比，腦片放電發(fā)作的潛伏期、頻率、波幅均顯著低于低劑量干預組 (P＜0.05)。 而低劑量干預組與生理鹽水組在上述指標的比較未見顯著差異 (P＞0.05)。

圖1 各組腦電圖檢測情況Fig.1 EEG of each group

3 討論

小兒牛黃清心散是我國民間廣泛應用的一種中藥復方制劑，主要含有天麻、膽南星、黃連、赤芍、 大黃、 全蝎、 水牛角濃縮粉、 僵蠶 (麩炒)、牛黃、 琥珀、雄黃、 冰片、朱砂、 金礞石 (煅)等14味中藥。傳統(tǒng)醫(yī)學認為其主要用于小兒內熱、急驚痰喘、四肢抽搐、神志昏迷的治療。

關于小兒牛黃清心散的配方中單一藥物成分的抗驚厥的藥效及機制的研究比較多見，如天麻有抗驚厥的作用［12］，天然冰片可能通過調節(jié)腦內氨基酸類神經遞質的水平來改善模型小鼠的驚厥行為［13］。 根據(jù)中藥配伍應用的特色， 對中藥復方的研究更能體現(xiàn)中醫(yī)學的整體療效［14］， 針對目前國內尚缺乏對小兒牛黃清心散復方制劑預防驚厥作用的藥效評價的研究。本研究通過制作急性驚厥模型，在整體和組織層面觀察小兒牛黃清心散的止驚療效。

表3 各組無鎂誘導腦片海馬 C A1 區(qū)及皮層場電位的情況 （）Tab.3 Field potential of CA1 region of the hippocam pus and the cortex of brain slice in each group induced by the M g2+ free artificial cerebrosp inal fluid（）

表3 各組無鎂誘導腦片海馬 C A1 區(qū)及皮層場電位的情況 （）Tab.3 Field potential of CA1 region of the hippocam pus and the cortex of brain slice in each group induced by the M g2+ free artificial cerebrosp inal fluid（）

注:與生理鹽水組、清心散低劑量組比較，*P＜0.05

組別海馬 CA1區(qū)場電位皮層場電位腦片數(shù) 潛伏期 /min發(fā)作率 /%頻率 /Hz波幅 /mV腦片數(shù)潛伏期 /min發(fā)作率 /%頻率 /Hz波幅/mV生理鹽水組1050.24 ±6.441008.59 ±1.260.640 ±0.0751029.57 ±2.871007.89 ±0.160.228 ±0.055正常對照組10---------安定對照組10-0- - 10-0- -清心散低劑量組1049.58 ±5.211008.67 ±1.160.648 ±0.0991029.75 ±3.041007.95 ±0.220.209 ±0.037清心散中劑量組1095.47 ±2.74*100*3.89 ±0.73*0.298 ±0.067*1082.88 ±13.28*100*3.92 ±0.21*0.176 ±0.012*清心散高劑量組10-0- - 10-0--

戊四唑誘導的急性驚厥模型是復制急性全身性驚厥發(fā)作的一種常用模型［15］。 被廣泛應用于癲癇發(fā)病機制的研究、抗癲癇藥物的篩選以及治療方法的探索等［6］。 因此， 我們采用戊四唑所致驚厥模型，在動物整體水平，從行為學角度研究小兒牛黃清心散的止驚療效，結果提示小兒牛黃清心散可呈劑量依賴性地對抗戊四唑誘導的急性驚厥，降低發(fā)作率，延長驚厥發(fā)作的潛伏期，降低發(fā)作級別，縮短驚厥發(fā)作的持續(xù)時間，降低死亡率，其中，高劑量干預組可有效改善腦電圖的癇性放電，與驚厥發(fā)生的行為學變化一致。高劑量干預組與安定組預防驚厥的效果比較沒有顯著差異。

在整體研究的基礎上，我們進一步采用腦片觀察小兒牛黃清心散的止驚療效。無鎂誘導腦片的驚厥模型是常見的經典腦片驚厥模型之一［11］。 有研究表明無鎂誘導的腦片異常放電的起源自內嗅皮層， 繼而向顳葉皮層及海馬結構傳播擴散［16］， 因此，皮層和海馬作為癲癇發(fā)作的易感區(qū)域，參與了癲癇電活動的起源、傳播及擴散，而皮層和海馬細胞外場電位是皮層和海馬結構神經環(huán)路興奮性的總體體現(xiàn)。本實驗中發(fā)現(xiàn)小兒牛黃清心散可呈劑量依賴性預防無鎂誘導腦片的癇性放電，且高劑量的小兒牛黃清心散對無鎂誘導的腦片有較好的抗驚厥作用，效果與安定組相當。

圖2 各組無鎂誘導腦片海馬 CA1區(qū)場電位情況Fig.2 Field poten tial of CA1 region of the hippocampus of brain slice induced by the M g2+free artificial cerebrospinal fluid in each group

圖3 各組無鎂誘導腦片皮層場電位的情況Fig.3 Field poten tial of the cortex of brain slice inducedby the M g2+free artificial cerebrospinal fluid in each group

本研究雖在動物水平和腦片水平均證實了小兒牛黃清心散高劑量組有較好的預防驚厥的作用，在動物水平的研究結果可以為臨床的進一步大樣本前瞻性的研究提供一定的指導，但由于中藥起效較慢，故不適用于驚厥急性發(fā)作的處理，只可能作為預防驚厥發(fā)作的選擇藥物之一。其具體預防驚厥的機制也有待進一步深入研究。

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Anticonvulsive effect of Child Niuhuang Qingxin Powder on seizures in infantile rats

LIWen-juan， JIANG Li*， CHEN Heng-sheng， CHEN Xiao-lu

(Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders， Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing， Chongqing International Science and Technology Cooperation Center for Child Development and Disorders， Children's Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing 400014， China)

ABSTRACT:AIM To study the preventive effectof Child Niuhuang Qingxin Powder(CNHQX)on convulsant action in the infantile rats.METHODS One hundred and thirty infantile Sprague-Dawley(SD)rats were equally randomized into twomain groups including in vivo group and brain slice group and the former group were subdivided into 7 subgroups(normal control group，blank control group， saline control group， diazepam group(2.632 mg/kg·d)， low-dose， middle-dose and high-dose of CNHQX group［(300， 8 and 16 g/kg·d)］and each subgroup contained 10 rats.The rats were respectively orally pretreated with 2 mL)twice for one day， and were injected ip. with a dose of 70 mg/kg of pentylenetetrazole for30 min after the administration after the second time except rats in the normal controlgroup.The convulsive behaviors including the latentperiod， seizure time，seizure score，simultaneous EEG， mortality was observed for 30 min after each injection.The rats in the latter group were divided into 6 sub-groups including the normal control group ， saline control group， diazepam group， low-dose， middle-dose and high-dose of CNHQX group and the administrationsof the drugs in each group was the same as in vivo group.The rats in the brain slice group weremade into brain slices at30min after the administration the second time and the slices were induced by Mg2+free artificial cerebrospinal fluid(ACSF)for the record of field potential of the cortex and CA1 region of the hippocampus including the latent period， and frequency and amplitude of wave.RESULTS CNHQX significantly prolonged the onsetof seizures， delayed the seizure time， decreased the seizure score andmortality and improved the EEG athigh-dose andmiddle-dose(P＜0.01).It also decreased the seizure rate and prolonged the onset of seizures， decreased frequency and amplitude ofwave induced by the Mg2+free artificial cerebrospinal fluid of brain slice in high-dose and middle-dose.CONCLUSION CNHQX has possessed anticonvulsant activity against pentylenetetrazole-induced and Mg2+free artificial cerebrospinal fluid induced seizuresdose dependently in the developing rats.

Child Niuhuang Qingxin Powder(CNHQX)； zeizure； pentylenetetrazole； Mg2+free；infantile rat

R285.5

:A

:1001-1528(2014)02-0244-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.006

2013-06-25

李文娟 (1987—) ， 女， 碩士生， 研究方向: 未成熟腦驚厥性腦損傷與腦保護作用。 Tel:13983467430， E-mail:627775752 @qq.com

*通信作者: 蔣 莉 (1964—) ， 女， 教 授， 研 究 方 向: 小 兒 神 經 系 統(tǒng) 疾 病 基 礎 與 臨 床。 Tel:(023)63621892， E-mail:dr-jiangli @126.com