廣西莪術(shù)水提物對(duì)大鼠肝臟胞漿液抗氧化酶和微粒體藥物代謝酶的影響

楊秀芬， 石衛(wèi)州， 程允相， 樊星花

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室， 廣西 南寧 530001； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，廣西 南寧 530023）

［藥 理］

廣西莪術(shù)水提物對(duì)大鼠肝臟胞漿液抗氧化酶和微粒體藥物代謝酶的影響

楊秀芬1， 石衛(wèi)州2， 程允相1， 樊星花1

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室， 廣西 南寧 530001； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，廣西 南寧 530023）

目的 研究廣西莪術(shù)水提物對(duì)大鼠肝臟胞漿液和微粒體內(nèi)抗氧化酶和藥物代謝酶的影響。方法 用差速離心法制備肝臟胞漿液及微粒體， 測(cè)定抗氧化酶和藥物代謝酶 NADPH-細(xì)胞色素 P-450 還原酶、 CYP3A、 CYP2E1 和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (GST) 和葡萄糖醛酸-轉(zhuǎn)移酶 (UGT) 的活性。 結(jié)果 在肝胞漿液， 與空白組比較， 廣西莪術(shù)各劑量組對(duì)超氧化物歧化酶 (SOD) 和谷胱甘肽還原酶 (GR) 水平的影響沒有明顯差異 (P＞0.05)； 中劑量顯著增高過氧化氫酶 (CAT) 活性 (P＜0.01)； 高劑量明顯增高 GSH-PX活性 (P＜0.05)。 廣西莪術(shù)各劑量組對(duì) CYP2E1 和 UGT的活性均沒有顯著的影響 (P＞0.05)； 均明顯增高 GST活性 (P＜0.05)； 低劑量顯著降低 NADPH-細(xì)胞色素 P-450 還原酶活性 (P＜0.05)， 各劑量組明顯降低 CYP3A活性 (P＜0.05)； 苯巴比妥鈉組明顯增高 CYP3A、 GST和 UGT的活性(P＜0.05)。 結(jié)論 廣西莪術(shù)可能會(huì)影響體內(nèi)藥物代謝， 合并用藥時(shí)， 應(yīng)考慮潛在的藥物間相互作用。

廣西莪術(shù)；抗氧化酶；藥物代謝酶

莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù) Cureuma phaeocaulis Val.、 廣西莪術(shù) Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或 者 溫 郁 金 Curcuma wenyujin Y.H. Chen et C.Ling的干燥塊莖［1］。 性辛、苦、溫，歸肝脾經(jīng)，具有破血行氣止痛，積散結(jié)，破血祛瘀，行氣止痛等功效。近年來研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)具有抗腫瘤、 抗病毒、 抗炎鎮(zhèn)痛、 抗白血病等作用［1］。 廣西莪術(shù)為廣西產(chǎn)大宗道地中藥材，約占莪術(shù)市場(chǎng)的60%的份額。本課題主要研究廣西莪術(shù)對(duì)大鼠肝臟抗氧化酶和藥物代謝酶的影響，以進(jìn)一步探討廣西莪術(shù)的作用和作用機(jī)制，從而指導(dǎo)臨床合理用藥。

1 驗(yàn)材料和方法

1.1 藥品和試劑 廣西莪術(shù) rhizomes of Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang于 2011 年 4月26日購于廣西欽州市靈山縣陸屋鎮(zhèn)， 經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室何報(bào)作教授鑒定為正品。 藥物煎煮方法參見文獻(xiàn) ［2］。

谷 胱 甘 肽-過 氧 化 物 酶 (GSH-Px 批 號(hào)20110628)、 過氧化氫酶 (CAT批號(hào) 20110609)、超氧化物歧化酶 (SOD批號(hào) 20110622)、 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (GST批號(hào) 20110707) 谷胱甘肽還原酶 (GR批號(hào) 20110701) 試劑盒均購自南京建成生物 工 程 研 究 所。 氨 基 比 林 (Sigma-aldrich，1001024266)； Tris( 三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷，Sigma，Cat.No.T8060)； NADP+(煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸， Scientific Research special， 004669)； G-6-P(葡萄糖-6-磷酸， Sigma， G7250)； NADP+-G-6-P(Sigma， Cat.No.D8090)；G-6-PDH( 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，Roche， G8020)； Triton X-100( 聚乙二醇辛基苯基 醚， Solarbio， Cat.No.T8200)；維生素 C(Sigma)； UDP-葡萄糖醛酸 ( 尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸，Sigma)； 其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 臺(tái)式低速離心機(jī) (北京京立離心機(jī)有限公司)； TU-1901 紫外可見分光光度計(jì) (北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)； 數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-8(國華電器有限公司， 型號(hào) HH-2)； 電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)； 酶標(biāo)儀 (德國 BioTeK公 司)； 96 孔板 (JET BIOFIL)； 冰 箱(SIEM ENS 公司， 型號(hào) KK24T18TI)； 微量加樣器(法國 GILSON)； 超低溫冰箱 ( 美國 Thermo Forma，型號(hào)725)。

1.3 給藥方 法［3-5］雄 性 SD大鼠 40 只，體 質(zhì) 量180 ～220g， SPF級(jí)， 合格證號(hào):SCXK2009-0002，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按體質(zhì)量給藥，灌胃給予廣西莪術(shù)水煎液低、中、高生藥給藥量均為 0.81、 2.43、 7.29 g/kg， 1 日 1 次，連續(xù) 3周， 飼養(yǎng)至第21日， 以等量純凈水為陰性對(duì)照組: 1 日 1 次灌胃， 連續(xù) 21 d， 飼養(yǎng)至第 21 日。 陽性對(duì)照: 飼養(yǎng)方法同陰性對(duì)照組，飼養(yǎng)至第 18日，腹腔注射 80mg/kg的苯巴比妥鈉， 1 日1 次， 連續(xù)4 d。 給藥結(jié)束后， 大鼠禁食 12 h 后， 斷頭處死大鼠，分離肝臟，用冰冷的生理鹽水充分灌流、洗凈至白陶土樣，勻漿，4 ℃， 1 000 g， 離心 15 min，取上清液， 于 4 ℃， 12 500 g， 離心兩次，每次15min， 取上 清 液 轉(zhuǎn) 移 至 超 速 離 心 管 內(nèi)， 4 ℃，105 000 g， 離心 1 h， 上清液為胞漿液， 沉淀為微粒體。

1.4 胞漿液抗氧化酶和微粒體 GST活性按試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.5 NADPH-細(xì) 胞 色 素 C （ P-450 ） 還 原 酶 的 測(cè)定［3］取 2.8 mL磷酸緩沖液，加微粒體蛋白懸液0.1 mL， 加細(xì)胞色素 C 0.1 mL，混勻，550 nm處測(cè)定吸光度值。測(cè)定管中操作步驟同上后，加入NADPH溶液 20 μL， 立即混勻， 秒表計(jì)時(shí)， 每分鐘測(cè)定 1 次 OD值， 連續(xù)測(cè)定 3 min。

1.6 氨基比林-N-脫甲基酶 （CYP3A） 活 性的測(cè)定［3-4］配制 0.5 mmol/L甲醛工作液， 取 0、 0.1、0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 m L工作液， 分別用蒸餾水補(bǔ)充到 1mL。 37 ℃水浴3min， 加入三氯醋酸終止反應(yīng)，離心 10 min，取上清液 1 mL， 加入Nash 試劑 1 mL， 60 ℃水浴 10 min， 自來水冷卻，測(cè)定 420 nm處的 OD值。 以系列濃度的甲醛為橫坐標(biāo)，各濃度標(biāo)準(zhǔn)液的OD值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得甲醛線性回歸方程。在測(cè)定管中加入微粒體蛋白懸液 0.5 mL， 氨基比林-MgCl2水溶液 0.5 m L， 37 ℃水浴溫孵 2 min 后， 加入 NADPH啟動(dòng)反應(yīng)， 37 ℃水浴 30 min，加入 ZnSO40.35 mL， 冰浴5 min，加 飽 和 Ba(OH)20.35 mL， 混 勻，放 置5 min后離心， 取上清液 1 m L， 其余步驟同甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，依據(jù)甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。

1.7 苯胺-4-羥化酶 （CYP2E1 ） 活性的測(cè)定［3-4］配制 10 μmol/L 4-氨基酚工作液， 取此工作液 0、0.2、 0.4、 0.6、 0.8 和 1.0 mL， 用 6%三氯醋酸(TCA) 補(bǔ)充至 1 m L， 加至已盛有 1%苯酚的試管中， 混勻，加入 1 mL 1 mol/L Na2CO3， 室溫放置30 min，測(cè)定 630 nm波長(zhǎng)處吸光度值。以 4-氨基酚濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸， 求得 4-氨基酚的線性回歸方程。 取 0.73 mL NADP+-G-6P Tris緩沖 液 與 0.03 mL鹽酸 苯 胺 混合， 37 ℃水浴 2 min， 加微粒體 0.2 mL，37 ℃水浴 30 min， 加入冰冷的 20%三氯醋酸 1 mL終止反應(yīng)， 離心 15 min， 取上清液 1 mL， 其余步驟同 4-氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備， 依據(jù) 4-氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。

1.8 葡萄糖醛酸-轉(zhuǎn)移酶 （UGT） 活性的測(cè)定［3］

取輔助因子溶液 1 mL和 0.5 m L(1 mmol/L)2-氨基酚， 加 0.5 mL微粒體蛋白懸液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)， 空白管加入 0.5 mL蒸餾水代替 2-氨基酚。37 ℃水浴，振搖溫孵 30 min。 加 1 m L冰冷的 20%三氯醋酸，0.1 mL的磷酸緩沖液以終止反應(yīng)。 冰浴 5 min，3 000 r/min離心 5min， 取上清液 1mL， 加 0.5mL新鮮配制的 0.1% 亞硝酸 鈉，混 勻，放 置 2 min。加 0.5 mL 0.5%氨基磺酸胺， 混勻， 放置 3 min，加 0.5 mL 0.1%N-奈乙烯二胺， 混勻， 放置于暗處60 min， 以空白管調(diào)零， 540 nm處測(cè)定吸光度值。苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備按 “2.4” 項(xiàng)的方法繪制， 然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 廣西莪術(shù)對(duì)大鼠肝臟胞漿液抗氧化酶活性的影響 與空白組比較， 廣西莪術(shù)各劑量組對(duì) SOD和GR水平的影響沒有明顯差異 (P＞0.05)； 中劑量顯著增高 catalase(CAT) 活性 (P＜0.01)； 高劑量明顯增高 GSH-PX活性 (P＜0.05)(見表 1)。

2.2 廣西莪術(shù)對(duì)大鼠肝微粒體藥物代謝酶活性的影響 與空白組比較，廣西莪術(shù)各劑量組對(duì)CYP2E1 和 UGT的活性均沒有顯著的影響 (P＞0.05)； 均明顯增高 GST活性 (P＜0.05)； 低劑量顯著 降 低 NADPH-細(xì) 胞 色 素 P-450 還 原 酶 活 性(P＜0.05)，各劑量組明顯降低 CYP3A活性 (P＜0.05)； 苯巴比妥鈉組明顯增高 CYP3A、GST和UGT的活性 (P＜0.05)， (見表2)。

表 1 廣西莪術(shù)對(duì)大鼠胞漿液 CAT、 T-SOD、 GSH-Px、 GR和 GST的影響 （） （n=7 ～8）Tab.1 Efffect of aqueous extract of Curcuma kwangsinesis on the activities of drug m etabolizing enzymes in m icrosomes of liver tissues of rats（） （n=7 ～8）

表 1 廣西莪術(shù)對(duì)大鼠胞漿液 CAT、 T-SOD、 GSH-Px、 GR和 GST的影響 （） （n=7 ～8）Tab.1 Efffect of aqueous extract of Curcuma kwangsinesis on the activities of drug m etabolizing enzymes in m icrosomes of liver tissues of rats（） （n=7 ～8）

注:與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別劑量/(g·kg-1) CAT /(U·mgprot-1) SOD /(U·mgprot-1) GSH-Px /(活力單位) GR /(U·gprot-1)空白組-271.35 ±51.59250.55 ±33.43346.16 ±34.613.73 ±2.03廣西莪術(shù)低0.81268.23 ±30.67285.89 ±49.56353.37 ±76.276.80 ±6.44廣西莪術(shù)中2.43375.57 ±33.54**266.45 ±49.79396.92 ±132.275.64 ±5.22廣西莪術(shù)高7.29269.94 ±33.56275.87 ±23.87430.38 ±82.63*6.36 ±6.36

表 2 廣西莪術(shù)對(duì)大鼠肝微粒體內(nèi) NADPH-細(xì)胞色素 P-450 還原酶、 CYP3A、 CYP2E1、 GST和 UGT活性的影響 （）（n=7 ～8）Tab.2 Effect of aqueous extract of Cu rcuma kwangsiensis on the activities of drug metabolizing enzymes in m icrosomes of liver tissues of rats（） （n=7 ～8）

表 2 廣西莪術(shù)對(duì)大鼠肝微粒體內(nèi) NADPH-細(xì)胞色素 P-450 還原酶、 CYP3A、 CYP2E1、 GST和 UGT活性的影響 （）（n=7 ～8）Tab.2 Effect of aqueous extract of Cu rcuma kwangsiensis on the activities of drug metabolizing enzymes in m icrosomes of liver tissues of rats（） （n=7 ～8）

注:與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別劑量/(g·kg-1) P-450 還原酶/(nmol細(xì)胞色素C·min-1·mg-1) CYP3A /(nmol· min-1·mg-1) CYP2E1 /(nmol·min-1· mg-1) GST /(U· mgprot-1) UGT /(nmol·min-1· mgprot-1)空白組-0.51 ±0.131.52 ±0.9314.84 ±3.0317.45 ±4.580.13 ±0.03廣西莪術(shù)低0.810.19 ±0.10*0.61 ±0.80*17.21 ±5.5633.57 ±17.63*0.10 ±0.04廣西莪術(shù)中2.430.29 ±0.150.42 ±0.67**15.60 ±2.4936.69 ±21.58*0.10 ±0.04廣西莪術(shù)高7.290.44 ±0.340.27 ±0.33**22.63 ±9.4240.20 ±15.11**0.10 ±0.04陽性組(苯巴比妥)0.08-3.03 ±1.10**-30.63 ±11.92*0.18 ±0.04*

3 討論

3.1 廣西莪術(shù)對(duì)胞漿液抗氧化酶的影響 抗氧化酶 SOD、 CAT、 GSH-Px等是機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的主要組分，其作用是及時(shí)清除體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的各種自由基、氧化還原產(chǎn)物、過氧化物等。直接或間接保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受自由基、氧化還原產(chǎn)物、過氧化物損傷［6-7］。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在灌胃給予廣西莪術(shù)水煎液后，在肝臟胞漿液中，中、高劑量組可不同程度增高 CAT和 GSH-Px的活性， 提示廣西莪術(shù)在較大劑量時(shí)能夠增強(qiáng)大鼠肝臟的抗氧化能力。

3.2 廣西莪術(shù)對(duì)藥物代謝酶的影響 藥物相互作用最常見的原因是藥物代謝酶酶的誘導(dǎo)或抑制，中藥用藥以復(fù)方水煎液或單味藥材的水煎液為主，一個(gè)方劑含有多種中藥，一種單味藥材的水煎液也可能含有成千上萬或更多種成分。因此對(duì)中藥進(jìn)行藥物代謝酶的研究，有助于闡明中藥作用機(jī)制及毒副作用發(fā)生機(jī)制，對(duì)臨床合理用藥具有指導(dǎo)作用。

細(xì)胞色素 P450(cytochrome P450， CYP) 是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類含血紅素和硫羥基的蛋白質(zhì)， 是一超家族藥物代謝酶系［8］。 NADPH-細(xì)胞色素 P450 還 原 酶 (NADPH cytochrome P450 reductase， CPR) 是 CYP酶可提供 CYP酶系氧化還原反應(yīng)所需的第 1個(gè)電子，其表達(dá)的缺失將抑制CYPP450 酶的活力［9］。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣西莪術(shù)在低、 中劑量時(shí)對(duì) CPR活性有明顯的降低作用，具體原因有待進(jìn)一步研究。

CYP3A是肝臟與小腸中含量最為豐富的藥物代謝酶， 臨床常用藥物中亦約有 50%經(jīng)由 CYP3A代謝［10］。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 廣西莪術(shù)各劑量組明顯地抑制大鼠 CYP3A的活性。 臨床上當(dāng) CYP3A底物類藥物如紅霉素、他汀類藥物、硝苯地平、環(huán)孢素等與廣西莪術(shù)合并用藥時(shí)，應(yīng)考慮到可能存在潛在的代謝性藥物相互作用。

CYP2E1 在肝 臟中占 肝細(xì)胞 色素酶 總量的7%［11］。 CYP2E1 不但參與部分藥物的代謝， 而且還能催化許多前致癌物和毒物的活化過程［11］。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 廣西莪術(shù)對(duì) CYP2E1 活性沒有明顯的影響。

谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶 (GST) 和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶 (UGT) 是Ⅱ相主要的藥物代謝酶， 主要參與藥物的結(jié)合代謝， GST催化還原型谷胱甘肽與一系列親電子化合物結(jié)合，對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的親電子致癌物、外源性毒物起解毒和保護(hù)作用［12-13］，UGT催 化大 多 數(shù) 藥物、 致 癌物、 毒 物 等與葡萄糖醛結(jié)合而代謝、 解毒、 排泄［14］。 GST分布于大多數(shù)組織，如肝臟、腸道、腎臟、睪丸、腎上腺和肺，其中又以肝臟最多。廣西莪術(shù)各劑量組對(duì) GST均有明顯的誘導(dǎo)作用。 說明廣西莪術(shù)可加速代謝排出體內(nèi)毒性化學(xué)物質(zhì)，增加肝臟的解毒能力。本研究顯示，與空白組相比，廣西莪術(shù)對(duì)UGT沒有明顯的影響。

苯巴比妥鈉是 CYP3A、 GST和 UGT的經(jīng)典誘導(dǎo)劑。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果同樣也顯示苯巴比妥鈉能顯著升高 CYP3A、 GST和 UGT的活性。

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Effect of aqueous extract of Curcuma kwangsiensis rhizom a on liver antioxidant enzymes in cytosols and drugm etabolizing enzym es in m icrosomes in liver of rats

YANG Xiu-fen1， SHIWei-zhou2， CHENG Yun-xiang1， FAN Xing-hua1
(1.Department of Pharmacology， Faculty of Pharmacy， Guangxi University Of Chinese Medicine， Nanning 530001， China； 2.Department of Pharmacy， The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530023， China)

AIM To study the effect of aqueous extract of Curcuma kwangsiensis rhizom(ECKR)on liver antioxidant enzymes in cytosols and drug metabolic enzymes in microsomes in liver of rats.MEHTODS Cytosols and microsomes were isolated from liver and prepared by differential centrifugation using the standard procedure. The activities of antioxidant enzymes and drugmetabolic enzymeswere determined by UV-Vis spectrophotometer. RESULTS In cytosols， all dosages of ECKR showed no effecton SOD and GR(P＞0.05)compored to the control group.Medium dosage(2.43 g/kg)significantly increased the activities of catalase(CAT)(P＜0.05) ，and the highest dose sharply increased the activities of GSH-PX(P＜0.05).In microsomes， compared with the control group，all dosages of ECKR had no effecton the activities of CYP2E1， UGT's activities，butallsignificantly increased the activities of GST(P＜0.05).Low dosage(ECKR 0.81 g/kg)decreased the activities of NADPH cytochrome P450 reductase(P＜0.05).All of ECKR groups significantly reduced the activities of CYP3A(P＜0.05).The positive control group(phenobabital)induced the activity of CYP3A， GST and UGT obviously(P＜0.05).CONCLUSION ECKRmay affect drugmetabolism in vivo.There fore， drug-drug interactions should beconsidered when ECRR is used with other drugs.

Curcuma kwangsiensis rhizoma； antioxidant enzymes； drugmetabolic enzymes

R285.5

:A

:1001-1528(2014)02-0221-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.001

2013-03-04

國家自然科學(xué)基金 (81060353) ； “教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃人選” 資助項(xiàng)目 ( 教技函 2010-14 號(hào)， NCET-10-0093)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (2011GXNSFF018006)。

楊秀芬 (1969—)， 男， 醫(yī)學(xué)博士， 教授， 碩士生導(dǎo)師， 研究方向: 活血化瘀類中藥對(duì)藥物代謝酶和抗氧化酶活性的影響。Tel:(0771)2279423， E-mail:xiufenyang@163.com