香附油滴丸中 α-香附酮在血液及細(xì)胞中的移行情況探討

田友清， 丁 平

（1.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院， 江蘇 連云港 222007；2.中國藥科大學(xué)新藥篩選中心，江蘇 南京 210009）

香附油滴丸中 α-香附酮在血液及細(xì)胞中的移行情況探討

田友清1，2， 丁 平1

（1.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院， 江蘇 連云港 222007；2.中國藥科大學(xué)新藥篩選中心，江蘇 南京 210009）

目的 探討香附油滴丸中 α-香附酮在血液及細(xì)胞中的移行情況， 為確定香附油滴丸的定量測(cè)定指標(biāo)提供依據(jù)。方法 以高效液相色譜法 （HPLC） 為手段， 分別檢測(cè)香附油滴丸、 香附油滴丸灌胃給藥后大鼠血清及香附油滴丸給予 H9c2 細(xì)胞后細(xì)胞破碎液中 α-香附酮的移行情況。 結(jié)果 α-香附酮作為香附的主要成分， 在香附油滴丸、 含藥血清及細(xì)胞破碎液中均被檢測(cè)到。 結(jié)論 α-香附酮以原型移行到血液和細(xì)胞中發(fā)揮相應(yīng)的藥理作用， 以 α-香附酮為香附油滴丸的定量測(cè)定指標(biāo)具有合理性。

香附； 香附油滴丸； α-香附酮； 質(zhì)量控制

香附油滴丸是以從香附中提取的揮發(fā)油為原料制成的現(xiàn)代中藥制劑，為了制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，需要科學(xué)確定其主要成分定量測(cè)定指標(biāo)。鑒于藥物的活性成分往往通過進(jìn)入血液循環(huán)并與相應(yīng)的靶細(xì)胞結(jié)合而發(fā)揮作用， 本研究通過考察香附油滴丸中 α-香附酮在血液及細(xì)胞中的移行情況， 探討 α-香附酮作為香附油滴丸定量測(cè)定指標(biāo)的合理性，并為中成藥成分測(cè)定指標(biāo)的確定提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí) SD大鼠， 體質(zhì)量 200 ～250 g，雄性， 動(dòng)物許可證號(hào) SCXK （蘇）2007-0008，由南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠于 SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)， 定時(shí)給予全價(jià)營養(yǎng)飼料喂食， 室溫22～25 ℃， 相對(duì)濕度 50% ～70%。

1.2 藥物與試劑 香附油滴丸 （自制，批號(hào)110310）。α-香附酮對(duì)照品 （110748-200608， 中國藥品生物制品檢定所）； 甲醇 （色譜純， 德國 Merk公司）； DMEM、 胰酶、 FBS （由 GIBCO公司）。

1.3 主要儀器 LC-2010C四元泵高效液相色譜儀、 SPD-10Avp 紫 外-可 見 檢 測(cè) 器 （ 日 本 島 津）；SAVANT SPD 2010 真 空 濃 縮機(jī) （ Thermo Electron公司）； 倒 置 顯 微鏡 （ Olympus）； 培 養(yǎng)箱 （ Thermo）； LEGEND Micro 21R型離心機(jī) （ 德國 Thermo scientific公司）； AE240 電子天平 （梅特勒公司）。

1.4 細(xì)胞系 H9c2 心肌細(xì)胞系， 購自武漢博士德生物工程有限公司。

2 方法和結(jié)果

2.1 香附油滴丸中 α-香附酮的檢測(cè)

2.1.1 色譜條件 Diamond C18色譜柱 （150 mm× 4.6 mm， 5 μm）； 檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm； 柱溫 30 ℃；體積流量 0.8 mL/min； 進(jìn)樣量 20 μL；流動(dòng)相為甲醇-冰醋酸水溶液 （冰醋酸體積分?jǐn)?shù)為 1%）， 梯度見表1。

表1 流動(dòng)相梯度Tab.1 G radient of mobile Phase for HPLC

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取 α-香附酮對(duì)照品 0.015 34 g置于 50 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。 分別精密量取上述對(duì)照品溶液 1、 3、 5、 7、10 mL置于50 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻， 依法測(cè)定。 以 α-香附酮的質(zhì)量濃度對(duì)色譜峰面積進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 Y= 58 726X+39 618， r=0.999 7， 表明 α-香附酮在6.136 ～61.36 μg/mL內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液的制備 取香附油滴丸或空白滴丸 10 粒 （約 0.20 g）， 及相當(dāng)量的香附油， 精密稱定， 置 50 mL量瓶中， 加入甲醇 10 mL，超聲溶解， 放冷， 定容， 搖勻， 用 0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。

2.1.4 樣品檢測(cè) 取各供試品溶液及 α-香附酮溶液，依法測(cè)定， 結(jié)果見圖 1。 通過比較 α-香附酮對(duì)照品、 香附油、香附油滴丸及空白滴丸 HPLC， 確定峰 1、 2、 3 為香附油滴丸的主要峰， 其中峰 2 為α-香附酮， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 3.286 mg/g。

圖 1 香附油滴丸中 α-香附酮的 HPLC檢測(cè)Fig.1 Assay ofα-cyPerone in droPPing Pills of volatile oil from Cyperus rotundus by HPLC

2.2 香附油滴丸灌胃給藥后大鼠血清中 α-香附酮的檢測(cè)

2.2.1 含藥血清和空白血清樣品制備 取大鼠 6只， 禁食 12 h 后眼眶采集空白血， 然后按 1.0 g/kg體質(zhì)量灌胃給予香附油滴丸藥液，每天 2 次，連續(xù)4 d， 末次給藥 1 h后采集含藥血。 空白血和含藥血 低 溫 放 置 后 低 速 離 心 （ 3 000 r/min ×10 min）， 取上層血清 150 μL， 加甲醇 1.2 m L， 渦旋混勻， 高速離心， 取上清， 揮干， 殘留物用 0.15 mL甲醇復(fù)溶， 再離心， 取上清液供 HPLC分析用。

2.2.2 樣品檢測(cè) 取各供試品溶液及 α-香附酮溶液， 依 “2.1.1” 項(xiàng)測(cè)定， 結(jié)果見圖 2。 通過比較α-香附酮對(duì)照品、 香附油滴丸含藥血清、 空白血清HPLC， 確定峰 2 為香附油滴丸的主要入血成分峰，即 α-香附酮， 質(zhì)量濃度為 25.42 μg/mL血液，轉(zhuǎn)移率為 15.47% （按大鼠平均體質(zhì)量 250 g， 血液量均為10 m L計(jì)）。

2.3 香附油滴丸給予 H9c2 心肌細(xì)胞后細(xì)胞破碎液中 α-香附酮的檢測(cè)

圖 2 香附油滴丸灌胃給藥后大鼠血清中 α-香附酮的HPLC檢測(cè)Fig.2 Assay ofα-cyPerone in serum of rat adm inistered orally w ith droPPing Pills of volatile oil from Cyperus rotundus by HPLC

2.3.1 H9c2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)及給藥 H9c2 心肌細(xì)胞用含 12%FBS 的 DMEM培養(yǎng)基于 37 ℃、 5% CO2條件下培養(yǎng)。 稱取4 mg香附油滴丸，用4 mL PBS （含 1‰的 DMSO） 渦旋溶解， 過濾滅菌， 得質(zhì)量濃度為 1 mg/mL的供試液， 加入到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 H9c2 心肌細(xì)胞， 并設(shè)空白對(duì)照組， 繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3.2 樣品制備 24 h 后， 棄上清， 用適量冷PBS 洗滌 3 次， 再用適量三蒸水迅速洗滌 3 次，加三蒸水適量浸泡過夜，至細(xì)胞破裂，刮取細(xì)胞置5 mL Doff管中， 超聲破碎 2 min （ 超聲 10 s， 停頓15 s），加甲醇旋渦提取捕獲成分并沉淀蛋白， 高速離心， 取上清在金屬浴中80℃揮干。加甲醇適量超聲溶解， 高速離心， 取上清供 HPLC測(cè)定用。2.3.3 樣品測(cè)定 取各供試品溶液及 α-香附酮溶液， 依 “2.1.1” 項(xiàng)測(cè)定， 結(jié)果見圖 3。 通過比較α-香附酮對(duì)照品、 加入香附油滴丸的 H9c2 心肌細(xì)胞破碎液及加入空白滴丸的 H9c2 心肌細(xì)胞破碎液HPLC， 確定峰 1、 2、 3 為香附油滴丸的細(xì)胞捕獲成分峰， 其中峰 2 為 α-香附酮， 質(zhì)量濃度為 4.92 μg/mL破碎液， 轉(zhuǎn)移率為 74.96%。

3 討論

香附油滴丸是為深入開發(fā)傳統(tǒng)中藥香附而自主研發(fā)的現(xiàn)代中藥制劑，是以二氧化碳超臨界流體萃取技術(shù)從傳統(tǒng)中藥香附中提取的揮發(fā)油為原料，按適宜比例與聚乙二醇 4000 等輔料混合，通過滴制法制備而成。為了有效控制香附油滴丸的質(zhì)量，合理選擇香附的主要活性成分進(jìn)行測(cè)定是十分必要的。

圖 3 香附油滴丸給予 H 9c2 心肌細(xì)胞后細(xì)胞破碎液中α-香附酮的 HPLC檢測(cè)Fig.3 Assay ofα-cyPerone in disruPtion med ium of H 9c2 cells Pretreated w ith droPPing Pills of volatile oil from Cyperus rotundus by HPLC

鑒于大多數(shù)情況下藥物的活性成分不但能在制劑中易被檢測(cè)出來，且能進(jìn)入血液并與相關(guān)的靶細(xì)胞結(jié)合。因此，選擇具有該特點(diǎn)的成分作為藥物含量測(cè)定的指標(biāo)， 具有合理 性 和 科學(xué)性［1-3］。 α-香附酮作為香附的主要成分， 其活性相當(dāng)廣泛［4］， 在香附及香附油滴丸的質(zhì)量控制中曾作為定量測(cè)定指標(biāo)［5-6］。為了進(jìn)一步證實(shí) α-香附酮作為香附油滴丸定量測(cè)定指標(biāo)的合理性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)香附油滴丸、香附油滴丸灌胃給藥后大鼠血清及香附油滴丸給予H9c2 心肌細(xì)胞后細(xì)胞破碎液中 α-香附酮的移行情況進(jìn)行了考察， HPLC法測(cè)定結(jié)果表明， α-香附酮能進(jìn)入血液， 且能與靶細(xì)胞相結(jié)合， 從而說明 α-香附酮作為香附油滴丸的含量測(cè)定指標(biāo)是合理的。

本實(shí)驗(yàn)選擇 H9c2 心肌細(xì)胞作為 α-香附酮的靶細(xì)胞，是依據(jù)香附提取物對(duì)在體蛙心、兔心和貓心具有強(qiáng)心或減慢心率的作用［7］。 香附油滴丸除 α-香附酮外， 尚有其他成分進(jìn)入血液或與 H9c2 心肌細(xì)胞結(jié)合，但由于缺乏相應(yīng)的對(duì)照品，因此尚無法判斷為何種移行成分，如能通過質(zhì)譜進(jìn)一步研究，可能為確定香附油滴丸其他的定量測(cè)定指標(biāo)提供依據(jù)。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)為中成藥活性成分定量測(cè)定指標(biāo)的確定提供了一種新的研究模式。

［ 1 ］ Wang Shuping， Lei Liu， Wang Lingling， et al.Screening and analysis of themultiple absorbed bioactive components and metabolites in ratplasma after oraladministration of Jitai Tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry［ J］ .Rapid Commun Mass Spectrom， 2010， 24 （ 11 ）：1641-1652.

［2］ 季宇彬，彭海生， 藍(lán)苑元.血清化學(xué)的研究現(xiàn)狀與展望［J］.中草藥， 2003， 34（4）： 99-101.

［3］ 楊秀偉，楊曉達(dá)，王 瑩，等.中藥化學(xué)成分腸吸收研究中 Caco-2 細(xì)胞模型和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的建立［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)， 2007， 5（6）： 634-641.

［4］ 田友清， 丁 平.香附揮發(fā)油的研究進(jìn)展及其開發(fā)前景［J］.中國藥業(yè)， 2010， 19（3）： 1-2.

［ 5 ］ 賈宜軍， 莫結(jié)麗.HPLC內(nèi)標(biāo)法測(cè)定香附中 α-香附酮的含量［ J］ .中藥材， 28（8） ： 722-723.

［ 6 ］ 丁 平， 田友清.HPLC法測(cè)定香附油滴丸中 α-香附酮的含量［J］.江西中醫(yī)藥， 2010， 41（5）： 55-56.

［ 7 ］ Akperbekova B A.On the characteristic of chemical composition of rhizome of Cuperus rotundus L［ J］ .Farmatsiia， 1967， 16（3）： 36-41.

Transitional situation ofα-cyPerone in the droPPing Pills of volatile oil from Cyperus rotundus in blood and cells

TIAN You-qing1，2， DING Ping1

（1.Lianyungang TCM Branch， Jiangsu Union Technical Institute， Lianyungang 222007， China； 2.New Drug Screening Center， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China）

Cyperus rotundus； dropping pills of volatile oil from Cyperus rotundus； α-cyperone； quality control

R969

： A

： 1001-1528（2014）01-0069-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.017

2013-02-16

2012 年江蘇省高校 “青藍(lán)工程” 中青年學(xué)術(shù)帶頭人培養(yǎng)對(duì)象基金； 江蘇省衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)教育研究課題 （J201215）

田友清 （1975—） ， 男， 副教授， 理學(xué)博士， 從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。 Tel： 15950733866， E-mail： tyq0505@163.com