逍遙散干預肝損傷小鼠的代謝組學研究

張 寧，楊祎楠，劉海洋，王業(yè)秋，李建民，耿 放

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱 150040;2.哈爾濱師范大學，黑龍江哈爾濱 150025)

逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，功效為疏肝解郁、健脾和營，是調和肝脾的經典方，臨床上廣泛用于肝損傷的治療。肝損傷是臨床常見的危害人類健康的疾病。代謝組學方法是從系統生物學角度研究相對分子質量1000以下的內源性小分子 (氨基酸、有機酸、糖類及脂肪酸等)受到外界干擾或擾動后的變化情況［1］。氣相色譜-質譜 (GCMS)具有高靈敏度、分離效果好及代謝物易于鑒定等優(yōu)點，是近年來代謝組學主要的研究手段［2］。為了全面揭示逍遙散保肝、護肝的作用，本研究不僅檢測常用的各種血清酶指標，而且還借助代謝組學的方法，利用GC-MS分析小鼠肝組織勻漿及血清的代謝物譜，尋找潛在標記物。為臨床應用逍遙散治療肝損傷提供理論依據。

1 實驗材料及儀器

1.1 動物 雄性昆明種小鼠42只，體質量 (18～25)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學GLP實驗室 (實驗動物生產許可證號:SCXK(黑)2008-004)。

1.2 藥物及制備 處方飲片均購自北京同仁堂制藥集團哈爾濱藥店，經黑龍江中醫(yī)藥大學陳孝忠副教授鑒定。遵照《太平惠民和劑局方》原文，逍遙散的制備方法為:準確稱取柴胡15 g，當歸15 g，白芍15 g，白術15 g，茯苓15 g，甘草7.5 g，于中草藥粉碎機中粉碎成最粗粉，加水1500 mL煮沸，保持沸騰20 min，加入5 g煨姜和5 g薄荷，再保持沸騰煎煮10 min，煎煮液過5層紗布，濾液濃縮至2 g/mL(按生藥量計)。

1.3 主要試劑 硅烷化試劑N-甲基-(三甲基硅烷基)-三氟乙酰胺 (MSTFA)(Apollo Scientific Limited UK)，三甲基氯硅烷 (TMCS)(98%Acros Organics USA)，甲氧胺鹽酸鹽，二十二烷 (均購自Fluka公司);吡啶 (天津光復科技發(fā)展有限公司);正庚烷 (天津市申泰化學試劑有限公司);甲醇 (色譜級，購自Merck公司);丙氨酸氨基轉換酶 (ALT)、天門冬氨酸氨基轉換酶 (AST)、超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)試劑盒均購自南京建成工程生物研究所;其他試劑均為分析純。

1.4 主要儀器 MS-500A型半自動生化分析儀 (成都美生科技有限公司);CTC自動進樣器及自帶頂空裝置 (瑞士CTC股份有限公司);Agilent6890N-5975B氣相色譜-質譜儀(美國安捷倫公司)。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥 將42只雄性小鼠隨機分為3組，即正常對照組、模型組、逍遙散組;逍遙散組按20 g/kg早晚給予逍遙散;正常對照組及模型組給予蒸餾水;連續(xù)給藥7 d。第7天末次給藥1 h后逍遙散組和模型組小鼠同時腹腔注射0.2%CCl4花生油溶液 (10 mL/kg)，正常對照組腹腔注射等量花生油。

2.2 指標測定

2.2.1 小鼠血清中ALT、AST的活性測定 實驗第8天，摘除小鼠眼球取血，常規(guī)分離血清，按試劑盒說明書測定ALT、AST的水平。

2.2.2 小鼠肝組織勻漿中SOD、MDA的水平測定 實驗第8天，處死小鼠后立即取出肝臟，常規(guī)制成肝組織勻漿，按試劑盒說明書測定SOD、MDA的水平。

2.2.3 小鼠肝組織病理形態(tài)學檢測 取完整肝臟中葉，10%甲醛固定。按常規(guī)方法制備切片，在光鏡下進行病理學檢查。

2.3 GC-MS樣品處理 取解凍后血清樣品100 μL(10%肝組織150 μL)，加入500 μL甲醇，旋渦3 min，冰浴30 min后離心 (10000 r/min，4℃，10 min)。取上清液450 μL(10%肝組織400 μL)置Eppendorf管中，N2吹干。加15 mg/mL甲氧胺吡啶溶液50 μL，渦旋混勻，密封后室溫下反應12 h，加衍生化試劑 (MSTFA∶TMCS=100∶1，V/V)75 μL，渦旋混勻，密封70℃反應1 h。室溫冷卻后加含二十二烷 (內標，0.10 mg/mL)的正庚烷150 μL，混勻后離心 (10000 r/min，4℃，10 min)，移取上清液置Eppendorf管中，供 GC-MS 分析［3-4］。

2.4 GC-MS分析條件 升溫程序:85℃保持5 min，以8℃/min升至 120℃，以 2℃/min升至 125℃，以 10℃/min升至190℃保持10 min，以10℃/min升至280℃保持7 min;進樣量1 μL，不分流進樣;載氣為高純氦氣，體積流量為1.0 mL/min;進樣口溫度為270℃;離子源溫度為230℃;四級桿溫度為150℃;調諧方式為自動調諧;掃描方式為全掃描;質量掃描范圍為30～600 aum;閾值為30。

2.5 數據處理 根據GC-MS總離子流圖中各峰的保留時間挑選共有峰，獲取各峰與內標峰的峰面積數據，用相對峰面積 (各峰與內標峰的比值)表示代謝物的量。各組模式識別采用主成分分析 (PCA)應用Matlab 7.0.1軟件。統計方差分析應用SPSS 18.0軟件。

3 結果

3.1 小鼠血清中ALT、AST活性的測定 與正常對照組相比，模型組小鼠血清ALT和AST活性明顯升高 (P＜0.01);與模型組相比，逍遙散組血清ALT和AST活性顯著降低 (P＜0.01)。結果見表1。

表1 逍遙散對急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響(，n=8)

表1 逍遙散對急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響(，n=8)

注:與正常組比較，＊＊P＜0.01;與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

組 別 ALT/(IU·L－1) AST/(IU·L－1)22.96 ± 6.23 31.89 ± 7.26模型組 136.46±15.75＊＊ 145.37±16.39＊＊逍遙散組 89.38± 6.96## 119.04±20.44正常組#

3.2 小鼠肝組織勻漿SOD、MDA水平 與正常對照組小鼠相比，模型組肝組織勻漿SOD的活性顯著降低，MDA的活性明顯升高 (P＜0.01)。與模型組相比，逍遙散組肝組織MDA的活性顯著降低，SOD活性明顯升高 (P＜0.01)。結果見表2。

表2 逍遙散對急性肝損傷小鼠肝勻漿SOD、MDA活性的影響(，n=8)

表2 逍遙散對急性肝損傷小鼠肝勻漿SOD、MDA活性的影響(，n=8)

注:與正常組比較，＊＊P＜0.01;與模型組相比，##P＜0.01

組 別 SOD/(IU·mg－1) MDA/(nmol·mg－1)336.73±25.34 4.22±1.08模型組 261.60±20.29＊＊ 17.48±3.45＊＊逍遙散組 304.77±31.71## 10.30±2.22正常組##

3.3 肝組織病理切片結果 正常對照組小鼠肝小葉結構正常、清晰，細胞排列整齊，大小均勻，細胞核位于細胞中央，圓而邊界清;模型組小鼠肝細胞明顯水腫，細胞核濃縮，部分細胞由多角形變?yōu)閳A球形，胞質疏松呈網狀、半透明，細胞膜界不分明，排列紊亂擁擠，有嚴重的肝細胞壞死現象，可見明顯的結節(jié)狀再生細胞。與模型組比較，逍遙散組小鼠肝細胞水腫減輕，細胞排列較為整齊，結節(jié)狀再生細胞減少。結果見圖3。

圖3 肝損傷小鼠肝組織病理改變 (HE×400)

3.4 GC-MS分析結果 各峰挑選后發(fā)現血清中共有內源性代謝物38種。取同一樣品連續(xù)進樣6次，計算各相對峰面積的相對標準偏差 (RSD)。血清各峰的RSD為3.14%～14.37%。小鼠血清GC-MS分析總離子流圖見圖4所示。

圖4 小鼠血清GC-MS分析總離子流圖

3.5 代謝物鑒定 使用NIST05 a標準譜庫對共有的代謝物進行鑒定，一般認為匹配度大于800(最高值為1000)且可能性大于80%的鑒定結果較為可信。見表3。

3.6 代謝物譜模式識別及水平變化 將正常對照組與模型組血清中的所有內源性代謝物進行PCA(主成分分析)，主成分積分值集中分布在橢圓形散點圖的兩個區(qū)域，模型組明顯偏離正常對照組，無交叉和重疊，正常對照組分布在左方，模型組分布在右方。用T檢驗判斷各組代謝物水平差異，共有11個明顯差異代謝物。與正常對照組相比，模型組除肌醇升高 (P＜0.05)外，其他10個共有代謝物均明顯升高 (P＜0.01)。與模型組相比，逍遙散組丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、氨基丙二酸、蘋果酸、谷氨酰胺、賴氨酸、肌醇降低 (P＜0.05)，絲氨酸、天門冬氨酸、鳥氨酸明顯降低 (P＜0.01)。見表4及圖5。

4 討論

逍遙散常用于臨床慢性肝炎、肝硬化等肝損傷疾病的治療，對于其保肝護肝的藥效物質研究大多只停留在病理生理指標的檢測［5］，一兩個指標的變化只能從宏觀上證明逍遙散的干預作用，無法全面系統的揭示逍遙散的作用機制。代謝組學是研究生物體受到外界擾動后內源性代謝物動態(tài)變化的，可以從微觀的角度揭示逍遙散調節(jié)生物體各個系統發(fā)揮藥物療效的作用機制［6］。本實驗建立在CCl4致小鼠肝損傷模型的基礎上，首先檢測常規(guī)肝功能指標ALT、AST、SOD、MDA，證明肝損傷模型成功及逍遙散對特異指標的宏觀作用。然后參考黃欣等［8］樣品處理方法利用GCMS高通量、高精密度的優(yōu)點從微觀方面對各組血清進行代謝組學研究，采用PCA方法對各組進行模式識別。最后以T檢驗尋找肝損傷發(fā)病機制及逍遙散干預作用的潛在標記物。

表3 小鼠血清內源性代謝物的鑒定

表4 各組血清中明顯差異代謝物變化 (，n=8)

表4 各組血清中明顯差異代謝物變化 (，n=8)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01

正常組 逍遙散組 模型組Alannine 丙氨酸 6.667 0.417±0.078 0.584±0.074* 0.669±0.113化合物 中文名 保留時間/min##Glycine 甘氨酸 11.585 0.149±0.019 0.234±0.033* 0.338±0.077##Serine 絲氨酸 13.129 0.244±0.041 0.302±0.048＊＊ 0.352±0.058##Threonine 蘇氨酸 13.719 0.307±0.041 0.450±0.032* 0.546±0.070##Aminomalonic acid 氨基丙二酸 15.274 0.155±0.057 0.219±0.051* 0.296±0.045##Malic acid 蘋果酸 15.608 0.060±0.012 0.110±0.016* 0.189±0.073##Aspartic acid 天門冬氨酸 16.095 0.078±0.022 0.092±0.014＊＊ 0.099±0.050##Glutamine 谷氨酰胺 17.503 0.289±0.048 0.385±0.054* 0.531±0.133##Ornithine 鳥氨酸 20.238 0.055±0.013 0.214±0.044＊＊ 0.294±0.060##Lysine 賴氨酸 22.242 0.247±0.031 0.298±0.090* 0.550±0.167##Inositol 肌醇 27.914 0.423±0.043 0.491±0.136* 0.514±0.067#

研究表明，模型組小鼠血清ALT、AST明顯升高，證明肝損傷模型復制成功［7］;模型組肝組織勻漿SOD降低，MDA明顯升高，說明肝細胞發(fā)生脂質過氧化反應;肝細胞水腫、壞死，細胞排列紊亂，明顯可見結節(jié)狀再生細胞;灌胃給予逍遙散后，小鼠AST降低，ALT、MDA顯著降低，SOD升高;肝細胞水腫減輕，細胞排列較為整齊，結節(jié)狀再生細胞減少。推測逍遙散有降酶，抗脂質過氧化，促進細胞再生及修復細胞的作用。

肝臟是物質代謝的樞紐，同時也是氨基酸代謝的中心器官，當肝功能受損時，可導致氨基酸代謝過程的紊亂，實驗結果顯示在CCl4引起肝損傷時，模型組血清甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬氨酸、賴氨酸、鳥氨酸均明顯升高［8-10］。產生這些結果的原因可能是脂質過氧化作用，導致溶酶體酶大量釋放入血，組織蛋白分解加強，部分肝細胞結構破壞，使肝細胞合成蛋白質的功能降低，肝對氨基酸清除率降低，造成血中氨基酸水平明顯升高。另一方面受損的肝臟對胰高血糖素的滅活降低，導致內源性蛋白處于高分解狀態(tài)，釋放出大量的氨基酸，使血中氨基酸水平增高［11-12］。蘋果酸是三羧酸循環(huán)的中間產物，它的水平上升，可能是肝損傷狀態(tài)下體內三羧酸循環(huán)發(fā)生紊亂所致［13-14］。肌醇是一種水不溶性維生素，在相同的肝損傷報道中首次發(fā)現，其代表的生物學意義還需要進一步的實驗研究與驗證。

尿素循環(huán)是氮元素代謝與排泄的重要途徑。生物體內多余的氮首先轉化成氨，其中大部分氨再通過肝細胞尿素循環(huán)途徑轉化成無毒的尿素，也有一小部分的氨代謝為谷氨酰胺。在急性肝功能衰竭的情況下，尿素循環(huán)也被破壞，這就導致血清中尿素量的減少以及血氨水平的上升，從而激發(fā)谷氨酰胺的合成［15］。

逍遙散組丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、氨基丙二酸、蘋果酸、谷氨酰胺、賴氨酸、肌醇降低，絲氨酸、天門冬氨酸、鳥氨酸顯著降低。說明逍遙散能有效調節(jié)氨基酸的水平。綜上所述，推測逍遙散的作用機制是降酶，清除自由基，抑制脂質過氧化;有效調節(jié)三羧酸循環(huán)、尿素循環(huán)，使體內部分氨基酸及肌醇恢復正常。

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