芩白清肺濃縮丸對肺炎支原體作用

蒙艷麗， 王 欣， 王偉明

（黑龍江省中醫(yī)研究院中藥所， 黑龍江 哈爾濱 150036）

芩白清肺濃縮丸對肺炎支原體作用

蒙艷麗， 王 欣， 王偉明*

（黑龍江省中醫(yī)研究院中藥所， 黑龍江 哈爾濱 150036）

目的 觀察芩百清肺濃縮丸 （黃芩、 百部、 桔梗、 地龍、 麥冬、 紫菀 ） 對肺炎支原體 ATCC 15531 的作用。 方法 肺炎支原體給予低劑量 和高劑 量的芩百清 肺濃縮丸后， 利 用 Real-time PCR、 Reverse Transcription-PCR、 Western Blot方法測定肺炎支原體黏附蛋白 P1、 P30 的表達(dá)。 結(jié)果 與空白組比較， 芩百清肺濃縮丸高劑量組和低劑量組都能下調(diào) P1、 P30 mRNA和 P1 蛋白表達(dá)， 但高劑量組作用更加顯著。 結(jié)論 芩百清肺濃縮丸通過降低 P1、 P30 肺炎支原體蛋白的表達(dá)，從而妨礙肺炎支原體在呼吁道上皮細(xì)胞的定植達(dá)到抗肺炎的作用。

肺炎支原體； 芩百清肺濃縮丸； P1； P30

肺炎支原體是各年齡特別學(xué)齡前兒童呼吸道感染最常見病原體，因小兒的肺結(jié)構(gòu)發(fā)育不完善，經(jīng)過反復(fù)感染后，易致纖維化等肺部疾?。?］。目前臨床藥物普遍存在毒副作用及易引起耐藥等缺點(diǎn)。芩百清肺濃縮丸是國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的第一個用于臨床治療小兒支原體肺炎的中藥新藥。其中黃芩為君藥，百部為臣藥，佐以桔梗、地龍、麥冬、紫菀，共六味藥組方而成，具有清肺之熱毒、苦寒降肺之逆氣，保肺之陰津、苦潤復(fù)金之清肅，共奏清熱解毒，潤肺止咳之功效，尚無毒副作用，也不引起耐藥。前期試驗(yàn)表明其治療肺炎支原體及其耐藥株作用確切［2］， 能提高免疫功能和促進(jìn)氣道組織修復(fù)［3-4］。

本研究首先利用 BALB/c小鼠肺組織病理闡明芩百清肺濃縮丸有抗肺炎支原體作用，再通過肺炎支原體實(shí)驗(yàn)株研究肺炎支原體黏附蛋白 P1、 P30 表達(dá)，闡明芩百清肺濃縮丸抗肺炎支原體作用機(jī)制，確定藥物作用的靶點(diǎn)，為新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品 芩百清肺濃縮丸， 自制， 本品為棕色薄膜包衣濃縮水丸，符合 2010 版 《中國藥典》丸劑下的各項(xiàng)規(guī)定。

1.2 肺炎支原 體 培 養(yǎng) 肺 炎 支 原體 （ ATCC 15531 ） 購 自 American Type Culture Collection， 培養(yǎng)在胎牛血清中 24 h 后， 放于含 20%胎牛血清，10%酵母的 PPLO培養(yǎng)基中生長， 每隔 7 d 傳代一次。實(shí)驗(yàn)分為肺炎支原體空白對照組和給藥組，給藥組分別在肺炎支原體培養(yǎng)基中加入 100 μg/m L芩百濃縮丸 （低劑量）和 200 μg/mL芩百濃縮丸（高劑量） 3 d， 提取 mRNA和蛋白質(zhì)。

1.3 動物 BALB/c小鼠購自哈爾濱腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心， 飼養(yǎng)在 GLP環(huán)境。 小鼠被分成空白對照組， 模型對照組和給藥組， 每組 10 只。 模型對照組和給藥組小鼠乙醚麻醉后鼻滴入 20 μL 106CCu 肺炎支原體， 每天1 次， 共 3 d。 給藥組分別給予芩百清肺濃縮丸 2.3 g/（kg·d） （低劑量） 和4.6 g/（kg·d） （高劑量） 6 d，空白對照組和模型對照組給予相同劑量的生理鹽水。小鼠肺組織病理切片對比給藥組與其它組肺結(jié)構(gòu)的變化。

1.4 試劑 Trizol購自美國 Invitrogen 公司， 肺炎支原體檢測試劑盒購自中國 Da An gene，one-step RT-PCR kit購自中 國 Tiangen， Goat anti-P1 購自美國 Santa， 引 物 均 合 成 自 上 海 生 物工程技 術(shù) 有 限公司。

1.5 儀 器 中 國 博 日 Real-Time PCR， Reverse transcribe PCR儀， Bio-rad 半干電轉(zhuǎn)儀， Bio-rad 電泳儀和凝膠成像儀， 日本 Olympus熒光顯微鏡.

2 方法

2.1 HE染色 剛?cè)〉男迈r肺組織塊經(jīng)福爾馬林溶液固定48 h，用鑷子取出放到大的蠟盒上， 用刀片切成 1 cm×0.5 cm的小塊， 用小白蠟盒包上，放入80%的乙醇中過夜。 第 2 天把蠟盒依次放入95%乙醇Ⅰ中 （3 h） -95%乙醇Ⅱ中 （3 h） -100%乙醇Ⅰ中 （3 h） -100%乙醇Ⅱ中 （過夜）。第2 天從100%Ⅱ的乙醇中取出小蠟盒放到 二甲苯Ⅰ、 二甲苯Ⅱ中各 30 min， 然后放入蠟缸Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ中各浸泡 30 min， 包埋， 切片， HE染色。

2.2 芩百清肺濃縮丸最小抑菌濃度 最小抑菌濃度是能夠抑制細(xì)菌生長、繁殖的最低藥物濃度，在這個濃度肺炎支原體代謝被抑制，培養(yǎng)基沒有顏色改變。 800 μg芩百清肺濃縮丸加入 1 mL肺炎支原體的培養(yǎng)基中，使用二倍稀釋法設(shè)定8個藥物濃度（800 ～6.25 μg）， 當(dāng)空白對照組即肺炎支原體培養(yǎng)基由紅變黃時，8個給藥組中培養(yǎng)基不變色組即最小抑菌濃度。 肺炎支原體在 100 ℃ 沸水中煮 10 min， 提取 DNA， 使用 Real-Time PCR， 按照 試劑盒步驟操作，測定各組中含支原體的量。

2.3 Reverse transcribe PCR 實(shí)驗(yàn)分為空白 對照組， 低劑量 組 （100 μg/mL） 和高 劑量組 （200 μg/mL）， 給藥組加芩百清肺濃縮丸3 d， 收集肺炎支原體， 使用 Trizol提取 RNA， 按照一步法反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)過程擴(kuò)增并檢測 P1、 P30 mRNA水 平。 P1-forword primers 5′-CCTTGTGAATTTGCTCAG-3′， reverse primers 5′-GTCAGCTGCAGTTAGAAA-3′。 P30-forward primers 5′-ATGAAGTTACCACCTCGAAGAAGC-3′ ， reverse primers 5′-TTAGCGTTTTGGTGGAAAACCGGGTTG-3′。

2.4 WesternBlot 實(shí) 驗(yàn)分為空白 對 照 組， 低 劑量組 （100 μg/m L） 和高劑量組 （200 μg/m L），給藥組加芩百清肺濃縮丸 3 d， 收集肺炎支原體， lysis buffer提 取 蛋白，檢測蛋白濃度，相同蛋白濃度加入12%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn) PVDF膜， 用羊抗 P1抗體 4 ℃孵化整夜， 兔抗羊抗體室溫孵化 90 m in， 使用顯影液顯影， 分析條帶，檢測蛋白變化。

3 結(jié)果

3.1 肺組織的病理改變 肺組織 HE染色后， 顯微鏡拍照觀察肺組織的病理改變 （圖 1）。 在模型對照組中出現(xiàn)支氣管上皮脫落，支氣管血管周圍間質(zhì)增厚，肺泡塌陷，肺泡壁充血，毛細(xì)血管內(nèi)有許多紅細(xì)胞。低劑量組僅有部分支氣管上皮脫落。高劑量組和空白對照組的肺組織相似 （HE染色 ×20）。

圖 1 BALB/c小鼠的肺病理檢測Fig.1 Pathological exam ination of the lungs of BALB/c m ice

3.2 芩百濃縮丸抗肺炎支原體藥效實(shí)驗(yàn)［5］芩百濃縮丸藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芩百清肺濃縮丸對肺炎支原體有明顯抑制作用， 最小抑菌質(zhì)量濃度達(dá)到 100 μg/mL（圖2）， 具有臨床治療價值。

圖2 芩百清肺濃縮丸抗肺炎支原體藥效活性實(shí)驗(yàn)Fig.2 In vitro activity of QinbaiQ ingfei Pellets against Mycoplasma pneumonia

3.3 芩百清肺濃縮丸對 P1 基因和蛋白的影響 各組肺炎支原體提取 P1 蛋白和 mRNA， 使用 WesternBlot和 Reverse transcribe PCR方法檢測 P1 蛋白和 mRNA在各組間的差異。 結(jié)果顯示低劑量組和高劑量組都能降低 P1表達(dá)， 但以高劑量組明顯（圖3） （n=2）。

3.4 芩百清肺濃縮丸對 P30 基因的影響 收集肺炎支原體，提取 mRNA，使用 reverse transcriptional-PCR方法檢測 P30 mRNA表達(dá)。 結(jié)果顯示低劑量組和高劑量都能降低 P30 表達(dá)， 但以高劑量組明顯 （圖4） （n=2）。

3.5 統(tǒng)計(jì)分析 reverse transcription-PCR and Western blot使用 Gel-Pro analyzer分析結(jié)果。

圖3 P1 蛋白和 m RNA的抑制作用Fig.3 Inhibition of P1 Protein and m RNA exPression

圖 4 P30 m RNA抑制作用Fig.4 Inhibition of P30mRNA exPression

4 討論

中醫(yī)沒有支原體肺炎的病名，但從其發(fā)病和臨床表現(xiàn)可歸屬于中醫(yī)學(xué) “咳嗽” 范疇。 從病機(jī)角度為外感風(fēng)熱燥毒所致 “肺燥咳嗽”， 故應(yīng)以清熱解毒、潤肺止咳為主要治則。肺熱清，毒邪解，肺津復(fù)，氣道爽，肺復(fù)清肅之職，則咳嗽、發(fā)熱等癥皆除。按此治則，在臨床研究基礎(chǔ)上組成治療兒童支原體肺炎的清熱解毒、 潤肺止咳代表方藥——芩百清肺止咳方， 并制成濃縮丸。 由 SFDA指定的 8家 GCP歷時 6 年完成了 653 例 II、Ⅲ期臨床試驗(yàn)，獲得了臨床研究總結(jié)報告，數(shù)據(jù)由上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物臨床研究中心鄭青山教授統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明：芩百清肺濃縮丸治療支原體肺炎總療效優(yōu)于阿奇霉素顆粒，與阿奇霉素比較，起效快，改善癥狀明顯。本實(shí)驗(yàn)試圖從機(jī)制上闡明芩百清肺濃縮丸抗肺炎支原體作用，第一次揭示了其降低 P1、 P30 抗肺炎支原體作用。

本實(shí)驗(yàn)首先使用 BALB/c小鼠肺組織切片解釋芩百清肺濃縮丸能殺滅肺炎支原體治療支原體肺炎，接著通過對體外實(shí)驗(yàn)證明藥物作用靶蛋白。藥效實(shí)驗(yàn)證明芩百清肺濃縮丸的最小抑菌濃度是 100 μg/mL， 抗肺炎支原體作用顯著， 具有臨床治療價值，它也確定了體外給藥標(biāo)準(zhǔn)。本研究的目標(biāo)是探討 P1、 P30 表達(dá)， 先前研究發(fā)現(xiàn)肺炎支原體導(dǎo)致人類疾病的一個主要原因是它黏附宿主呼吸道上皮，借助黏附細(xì)胞器牢固地黏附于上皮細(xì)胞表面的受體上，使得肺炎支原體能夠在呼吸道上皮細(xì)胞定植， 并 由 此 感 染 宿 主［6-10］。 黏 附 細(xì) 胞 器 包 括 P1、P30、 HMW1、 HMW2、 HMW3、 HMW4、HMW5 等黏附蛋白，它們在結(jié)構(gòu)和作用上相互合作，共同發(fā)揮作用。 其中 P1、 P30 直接與受體結(jié)合是黏附所必須的蛋白，它也是重要的免疫原可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的異常，最終引起機(jī)體肺部和肺外多系統(tǒng)的病變。 HMW是黏附輔 助 蛋 白， 它 不 直 接 參 與 黏 附［11-15］。 利 用 reverse transcription-PCR和 WesternBlot， 知道芩百清肺濃縮丸降低了 P1、P30mRNA和P1 蛋白質(zhì)表達(dá)，特別是高劑量組作用顯著。

本研究闡明了芩百清肺濃縮丸通過降低 P1、P30 來抗肺炎支原體， 這個發(fā)現(xiàn)提供了芩百清肺濃縮丸如何殺滅肺炎支原體的機(jī)制，對于更遠(yuǎn)的研究提供了理論基礎(chǔ)。

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M echanism s of Q inbai Qingfei Pellets inhibiting Mycoplasma pneumoniae

MENG Yan-li， WANG Xin， WANGWei-ming*
（Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine， Harbin 150036， China）

AIM To observe the effects of Qinbai Qingfei Pellets（Scutellariae Radix， Stemonae Radix， Platycodi Radix， Pheretima， Ophiopogonis Radix， Asteris Radix et Rhizoma） on both drug-sensitive and drug-resistant strains of Mycoplasma pneumoniae.Mycoplasma pneumoniae ATCC 15531 was used.METHODS After being treated with high-dose and low-dose of Qinbai Qingfeis Pellets， gene and protein expression were measured by real-time quantitative PCR， Reverse Transcription-PCR and Western Blot.RESULTS Both high and low doses of Qinbai Qingfei Pellets greatly decreased P1， P30 expressions as compared with the control group in a dose-dependentmanner.CONCLUSION The experiment finds that P1 and P30 expressions of Mycoplasma pneumoniae can be inhibited by the treatmentwith QinbaiQingfei Pellets to intervene the colonization of upper respiratory endothelial cells.

Mycoplasma pneumoniae； Qinbai Qingfei Pellets； P1； P30

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0036-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.009

2013-02-15

國家重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng) （2010ZX09101-104 ）； 黑龍江省青年科學(xué)基金 （ QC2011C077 ）； 黑龍江省杰出青年科學(xué)基金（JC200813）

蒙艷 麗 （ 1976—）， 女， 助 理 研 究 員， 醫(yī) 學(xué) 碩 士， 研 究 方 向： 新 藥 研 發(fā)。 Tel： （ 0451 ） 55665478， E-mail： songxy60@ aliyun.com

*通信作者： 王偉明 Tel：（0451）55665478， E-mail： wangweiming475@aliyun.com