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    脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物和殼聚糖作為黏膜免疫載體的研究現(xiàn)狀

    2014-04-08 21:31:23王立強(qiáng)綜述王洪軍審校
    生物技術(shù)通訊 2014年4期
    關(guān)鍵詞:脂質(zhì)體殼聚糖鼻腔

    王立強(qiáng) 綜述,王洪軍 審校

    沈陽軍區(qū)聯(lián)勤部 疾病預(yù)防控制中心,遼寧 沈陽 110034

    預(yù)防控制病毒性傳染病的關(guān)鍵技術(shù)是研制免疫原性強(qiáng)和免疫途徑生物利用率高的有效疫苗。目前,已納入國家計(jì)劃免疫的疫苗,除少數(shù)為口服外,多數(shù)以針劑注射為主,而注射疫苗抗原用量大,針頭為潛在的感染源。相比之下,通過鼻黏膜給藥更符合原位免疫設(shè)計(jì)理念,它可以將病毒控制在感染的起始階段,具有刺激局部黏膜免疫,帶動(dòng)機(jī)體系統(tǒng)免疫的優(yōu)點(diǎn)。氣溶膠疫苗抗原對黏膜淋巴組織的刺激是產(chǎn)生分泌性IgG的必要條件,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生早期、高效和持久的免疫應(yīng)答,形成較長時(shí)間的抗病毒狀態(tài)。因此,鼻黏膜免疫載體和傳遞系統(tǒng)是氣溶膠疫苗鼻腔黏膜免疫策略成功的關(guān)鍵。

    1 鼻腔給藥特點(diǎn)

    鼻腔作為給藥部位具有以下生物學(xué)特征:①促進(jìn)藥物吸收:鼻腔黏膜上有很多細(xì)微絨毛,上皮細(xì)胞下有豐富的毛細(xì)血管和淋巴管,增加了藥物吸收的有效面積,使藥物容易通過鼻黏膜吸收;②避免肝臟的首過效應(yīng)和胃腸道酶的降解:藥物經(jīng)鼻黏膜吸收后直接進(jìn)入體循環(huán),提高了藥物的生物利用度;③給藥方便:以滴入或噴入方式給藥,患者可自行完成。但鼻黏膜絨毛的另一個(gè)生理特點(diǎn)是,任何粉末或顆粒在鼻腔的總接觸時(shí)間是20~30 min,鼻黏膜上的黏液被纖毛以5~6 mm/min的速度迅速清除[1]。為了解決鼻黏膜免疫的局限性,現(xiàn)已應(yīng)用近年發(fā)展的可降解生物材料脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物和殼聚糖等緩釋或控釋微顆粒來延長疫苗在鼻腔內(nèi)的滯留時(shí)間及滯留量,達(dá)到提高有效生物利用度的目的。

    2 鼻黏膜免疫

    傳統(tǒng)的免疫途徑為注射給藥,機(jī)體生理順應(yīng)性差,亦有引起返祖現(xiàn)象。鼻腔黏膜免疫是一種非侵入性疫苗接種途徑。鼻腔中的酶活性相對較低,可以保護(hù)疫苗不受酶的降解。據(jù)報(bào)道,與口服疫苗相比,抗原經(jīng)鼻黏膜免疫的劑量為口服免疫劑量的1/4,但仍可在血清及黏液中誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗原特異性抗體反應(yīng),鼻黏膜免疫不僅可以誘導(dǎo)產(chǎn)生全身性IgG抗體反應(yīng),還可以產(chǎn)生黏膜IgA抗體反應(yīng),最終形成兩道防御體系來共同保護(hù)機(jī)體免受傳染性疾病病原的侵害[2]。鼻腔中含有豐富的樹突狀細(xì)胞,可以介導(dǎo)強(qiáng)大的全身性及黏膜免疫反應(yīng),可以防御各種抗原及病原體通過呼吸系統(tǒng)對機(jī)體的侵害。鼻黏膜免疫可在唾液腺及生殖道中產(chǎn)生抗原特異性免疫反應(yīng),表明刺激后的淋巴細(xì)胞遷移到了共同黏膜免疫系統(tǒng)的特異性效應(yīng)因子位點(diǎn),這符合黏膜特異性淋巴細(xì)胞歸巢的理論[3]。

    3 鼻黏膜免疫載體

    脂質(zhì)體(liposome)、免疫刺激復(fù)合物(immune stimulating complexes,ISCOM)和殼聚糖(chitosan,CS)是近年發(fā)展的黏膜免疫載體。

    3.1 脂質(zhì)體

    脂質(zhì)體是由同心脂質(zhì)雙分子層包圍一個(gè)水核形成的球形小囊,可以攜帶脂溶性和水溶性的抗原,主要由磷脂和膽固醇組成[4]。脂質(zhì)體作為一種新型疫苗載體,具有許多生物學(xué)特點(diǎn):①增強(qiáng)抗原透入細(xì)胞的能力,能將目的抗原特異傳遞到靶細(xì)胞中,無毒無免疫原性,減少了疫苗對鼻黏膜的毒性和刺激性[5];②穩(wěn)定抗原,防止疫苗抗原被黏膜上的酶類降解而失活,使黏膜免疫部位保持高的疫苗濃度[6];③包被脂質(zhì)體的抗原可長期在吞噬細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞中存在,持續(xù)釋放被包封疫苗,形成長效緩釋作用[7];④脂質(zhì)體作為鼻黏膜免疫佐劑具有生物黏附特性,膜表面帶負(fù)電荷比帶正電荷的脂質(zhì)體有更強(qiáng)的誘導(dǎo)抗體形成的能力,膜表面帶有抗原的脂質(zhì)體載體的作用比膜內(nèi)帶有抗原的脂質(zhì)體載體更強(qiáng);特別是帶正電荷的脂質(zhì)體生物黏附性較強(qiáng),能減少疫苗被黏膜纖毛的清除,使疫苗較長時(shí)間保持有效血藥濃度,提高生物利用度[8];⑤可作為鼻黏膜免疫載體,刺激機(jī)體的黏膜和全身免疫應(yīng)答反應(yīng);⑥具有生物低密度,可生物降解,易于制備,使用方便。脂質(zhì)體發(fā)揮佐劑作用不受其與抗原連接形式的影響,只須將兩者簡單混合即可[9-10]。

    多種病毒抗原包入脂質(zhì)體內(nèi)可以用于鼻腔黏膜接種。此外,將變應(yīng)原包入脂質(zhì)體內(nèi)鼻腔給藥,還可抑制特異性IgE抗體反應(yīng),從而阻止吸入或食入抗原時(shí)引起的變態(tài)反應(yīng)。Childers等[11]首次以人體為對象,研究了鼻內(nèi)接種脂質(zhì)體-蛋白菌苗后引起的免疫反應(yīng)。所用抗原系富含葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的變異鏈球菌粗制抗原制劑(C-GTF)。受試者鼻內(nèi)接種包被C-GTF的脂質(zhì)體后,鼻洗液中特異性抗C-GTF IgA水平有所提高,誘生的唾液特異性IgM和IgA2水平提高程度較低,血清中IgM和IgA水平也有增加。通過進(jìn)一步比較鼻內(nèi)接種包被C-GTF的脂質(zhì)體后誘生的免疫應(yīng)答與單純C-GTF誘生的免疫應(yīng)答,發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體-抗原組中只有鼻洗液特異性IgA1應(yīng)答顯著強(qiáng)于單純抗原組,提示脂質(zhì)體可影響局部黏膜免疫應(yīng)答的強(qiáng)度,而不影響全身應(yīng)答反應(yīng)。

    脂質(zhì)體作為氣霧疫苗載體,其安全性日益受到關(guān)注。小鼠和人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明,脂質(zhì)體鼻腔給藥是安全的。賴氨匹林脂質(zhì)體家兔鼻腔給藥[12],20 d后處死,顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)鼻黏膜血管無病理改變,纖毛完好,組織無出血或炎細(xì)胞浸潤;而給予水溶液的對照組,鼻黏膜血管有輕度損害,纖毛卷曲,有少許炎細(xì)胞浸潤。脂質(zhì)體作為載體存在的問題是:①脂質(zhì)體的尾部脂肪酸易被氧化,影響其穩(wěn)定性;②小脂質(zhì)體囊相互融合成大脂質(zhì)體,易破壞脂質(zhì)體膜;③批間差異較大。

    3.2 免疫刺激復(fù)合物

    ISCOM是一類以脂質(zhì)(lipid)、皂素(saponin)為主的復(fù)合型佐劑。在ISCOM基質(zhì)中,皂素分子Quil A結(jié)合于固醇類和磷脂酰膽堿,可形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),其直徑為30~40 nm,能夠與抗原疏水部分結(jié)合,從而將其親水面暴露于免疫細(xì)胞[13]。

    ISCOM是Morein于1984年發(fā)現(xiàn)的一種新的疫苗輸送系統(tǒng)[14]。其作用機(jī)制是,捕獲大量抗原分子并釋放給抗原提呈細(xì)胞,刺激B細(xì)胞反應(yīng),增加抗體產(chǎn)生,誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng),刺激產(chǎn)生CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子IL-12,促進(jìn)MHC分子的表達(dá),促進(jìn)CTL活性和細(xì)胞免疫[15]。ISCOM也可以促進(jìn)病毒蛋白的攝取、加工和呈遞給特異性CD8+T淋巴細(xì)胞,但在鼻腔內(nèi)上皮細(xì)胞不能攝取ISCOM-Matrix投遞的抗原,暗示鼻內(nèi)免疫時(shí),上皮細(xì)胞不能被特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別并殺死[16]。其優(yōu)點(diǎn)是能夠快速、有效地將抗原提呈給免疫系統(tǒng),可在免疫后迅速激活機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答效果。其復(fù)合疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比,疫苗抗原的需求量減少至1/10~1/2[17],能夠增加抗體反應(yīng)水平和持久性,也能產(chǎn)生強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。而且,復(fù)合形成的蛋白抗原性與游離形式的溶液相比穩(wěn)定性增強(qiáng)。IS?COM疫苗的穩(wěn)定性極好,能被冷凍、凍干,并能溶解于多種緩沖液中,有利于疫苗的保存、貯藏。

    ISCOM作為疫苗載體能夠發(fā)揮免疫佐劑作用:①能夠引發(fā)MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類CTL反應(yīng),平衡Th1和Th2反應(yīng),產(chǎn)生包括所有同型和亞型的抗體反應(yīng),增強(qiáng)長期的記憶反應(yīng)[18],具有免疫調(diào)節(jié)作用;②誘導(dǎo)IL-2、IFN-γ、IL-12等多種細(xì)胞因子,細(xì)胞因子之間具有相互激發(fā)誘導(dǎo)連鎖反應(yīng)作用[19];③可以黏附用藥,滿足黏膜輸送系統(tǒng)的要求;鼻腔接種或口服后能引起多種反應(yīng),包括遠(yuǎn)端的腸道、生殖道的黏膜反應(yīng);④能更有效地遞呈抗原,適于各年齡段人員免疫;⑤ISCOM包含的抗原可以是一種病毒的包膜蛋白、細(xì)胞膜蛋白或含疏水區(qū)的任何抗原;非疏水性抗原可以加入疏水的尾部,或通過酸處理暴露隱藏的疏水區(qū)再整合到ISCOM中[20],因此能在相對長的時(shí)間內(nèi)起作用。

    自1984年Morein等公布ISCOM技術(shù)后,這一新的佐劑系統(tǒng)已在多種疫苗中得到應(yīng)用。馬流感病毒和ISCOM整合疫苗已于1989年在瑞典上市,并沒有嚴(yán)重副反應(yīng)。人用疫苗目前僅Flu-ISCOM進(jìn)入臨床試驗(yàn),其Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)已完成,期待這種新的技術(shù)能給傳統(tǒng)的疫苗帶來變革。將含有ISCOM的疫苗注射接種后,T細(xì)胞應(yīng)答首先在引流淋巴結(jié)中被檢測到,接種50 d后,在骨髓中也有大量抗體產(chǎn)生細(xì)胞[21],由于抗原提呈細(xì)胞的內(nèi)體小泡和泡質(zhì)溶膠的雙重作用,含ISCOM的疫苗可以通過MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ兩種途徑將抗原提呈給免疫系統(tǒng),同時(shí)激活CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞[22]。含ISCOM的疫苗的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以經(jīng)口服或鼻腔接種獲得免疫,且能達(dá)到在局部和全身黏膜表面誘導(dǎo)有效和特異的黏膜免疫應(yīng)答。小鼠鼻腔接種流感ISCOM疫苗后,可誘導(dǎo)堅(jiān)強(qiáng)的黏膜抗體和CTL應(yīng)答反應(yīng),并可抵抗攻擊感染。氣霧ISCOM疫苗除了可以引發(fā)MHC-Ⅰ介導(dǎo)的CTL活性外,還有全身性免疫應(yīng)答,包括特異抗體、分泌型IgA、CD8+T細(xì)胞應(yīng)答等[23]。重復(fù)低劑量氣霧免疫ISCOM疫苗不會(huì)引起免疫耐受[24]。

    ISCOM在使用上也存在一些限制性因素。它并非可以和任何抗原都能形成復(fù)合體[25],只有那些含疏水基團(tuán)很多的抗原或免疫原才能與ISCOM形成復(fù)合體,含親水基團(tuán)多的抗原(免疫原)不適合與IS?COM佐劑混合制備疫苗。

    3.3 殼聚糖

    殼聚糖是帶陽電荷的線性多糖,是一種生物粘性物質(zhì),由殼質(zhì)所產(chǎn)生,存在于甲殼類的殼中,通過脫乙酰作用而形成,可有一系列的脫乙酰程度和不同的相對分子質(zhì)量。殼聚糖谷氨酸鹽的平均相對分子質(zhì)量約為250×103,脫乙酰程度為80%以上,水溶性(pH6.5),在單一的殼聚糖溶液組方時(shí),其生物利用度可增加5~6倍[26]。殼聚糖又是一種天然聚多糖,有良好的生物相容性和生物可降解性,其分子中的葡糖胺基荷正電,與荷負(fù)電的DNA可產(chǎn)生靜電作用,凝聚為多聚復(fù)合物[27],這種納米粒子可以克服疫苗經(jīng)黏膜吸收的生理學(xué)屏障,通過細(xì)胞內(nèi)吞途徑,抵達(dá)黏膜下淋巴組織,能夠與鼻上皮細(xì)胞及其黏液層起強(qiáng)烈作用,以保證在被黏膜纖毛清除之前使疫苗通過鼻黏膜[28]。殼聚糖還可以通過上皮細(xì)胞之間緊密連接處的暫時(shí)開放而增加極性疫苗細(xì)胞旁路搬運(yùn)的能力。實(shí)驗(yàn)證明,殼聚糖遞送系統(tǒng)可明顯增強(qiáng)流感疫苗在小白鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)。殼聚糖納米粒比溶液制劑更有效地促進(jìn)黏膜對疫苗的吸收,增強(qiáng)機(jī)體對疫苗的免疫反應(yīng)[29]。

    殼聚糖是自然界中惟一含游離氨基堿性基團(tuán)的可食性動(dòng)物纖維,殼聚糖作為黏膜疫苗載體,具有良好的生物相溶性、低毒性及促滲作用[30],在鼻黏膜免疫領(lǐng)域倍受關(guān)注,它能與活體組織相容,被體內(nèi)的溶菌酶、胃蛋白酶降解后,降解產(chǎn)物能完全被人體吸收,無毒、無副作用。殼聚糖還具有良好的凝結(jié)能力和免疫刺激活性。研究證明,與普通的水溶性流感疫苗相比,含有可溶性殼聚糖的流感疫苗能促進(jìn)小鼠體內(nèi)血凝抑制抗體的產(chǎn)生[31]。基于上述生物特性,殼聚糖在黏膜免疫中得到了廣泛應(yīng)用。殼聚糖作為黏膜疫苗載體的作用機(jī)制表現(xiàn)如下:①黏膜吸附特性:殼聚糖分子中的羥基、氨基可與黏膜粘液中帶負(fù)電荷的糖蛋白形成氫鍵而產(chǎn)生黏附作用,延緩抗原的清除,使其有更多的時(shí)間與黏膜接觸,使抗原易穿過黏膜屏障,與黏膜下的淋巴組織發(fā)生作用;殼聚糖的黏膜吸附性能誘導(dǎo)黏膜和系統(tǒng)免疫反應(yīng),與小腸中下游黏膜之間的黏附性,能夠加強(qiáng)它與腸腔表面的緊密接觸,有利于微球繼續(xù)向集合淋巴結(jié)轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而引起全身及黏膜免疫反應(yīng)[32];②促滲作用:殼聚糖可使黏膜上皮細(xì)胞緊密結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而開放跨膜通道,提高黏膜通透性,促蛋白抗原大分子的跨黏膜吸收;用殼聚糖及其衍生物作用于細(xì)胞單層,可引起跨上皮細(xì)胞電阻降低,促進(jìn)疫苗抗原順利通過細(xì)胞旁路進(jìn)入體內(nèi),增強(qiáng)疫苗的滲透吸收,提高抗原的生物利用度[33];③殼聚糖在黏膜免疫中的佐劑效應(yīng):疫苗經(jīng)鼻黏膜免疫產(chǎn)生的免疫反應(yīng)常不能達(dá)到理想的免疫效果,故須依賴一些有效的黏膜免疫佐劑和載體系統(tǒng),而殼聚糖能夠提高巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、漿細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及多形核細(xì)胞的活性和積聚能力,阻止病原微生物的侵入和定居,誘導(dǎo)細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-4等的產(chǎn)生,激發(fā)有效的T細(xì)胞免疫應(yīng)答,中和細(xì)菌毒素,增強(qiáng)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。殼聚糖自身還可引起IL-10釋放及黏膜IL-4的表達(dá),并激活脾臟的CD4+T細(xì)胞,明顯上調(diào)黏膜Th2免疫反應(yīng),巨噬細(xì)胞攝取殼聚糖后即可活化[34]。殼聚糖的這種非特異免疫佐劑作用與其脫乙?;潭群蛣┬陀嘘P(guān),脫乙?;潭雀叩目扇苄詺ぞ厶腔钚暂^弱,而顆粒狀殼聚糖更易誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的吞噬作用[35]。殼聚糖可有效促進(jìn)局部(特別是黏膜局部)的免疫反應(yīng),增強(qiáng)抗原傳遞系統(tǒng)功能,具有免疫佐劑和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。

    4 結(jié)語

    綜上所述,脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物和殼聚糖作為新型鼻黏膜免疫載體或佐劑,為鼻腔黏膜途徑給藥開拓了更為廣闊的應(yīng)用前景。目前脂質(zhì)體尚存在不夠穩(wěn)定等缺點(diǎn),給長期貯存及用藥帶來不便。應(yīng)結(jié)合鼻腔黏膜的生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來綜合考慮脂質(zhì)體的粒徑大小、表面電荷和制備方法等因素,以達(dá)到最佳應(yīng)用效果。免疫刺激復(fù)合物佐劑是適合所有疫苗的通用免疫調(diào)解技術(shù)平臺,它能夠刺激機(jī)體對常規(guī)疫苗用量1/10的抗原產(chǎn)生相同或更強(qiáng)的抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng),而且這種反應(yīng)持續(xù)時(shí)間長,未見過敏反應(yīng)或其他嚴(yán)重毒害事件發(fā)生的報(bào)道。以ISCOM為載體的抗宮頸癌疫苗和高效低毒流感疫苗已進(jìn)行Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn),市場潛力巨大。殼聚糖是天然來源的多糖類陽離子高分子材料,來源廣泛,納米微粒、微球制備工藝簡單,不需有機(jī)溶劑,有利于疫苗的穩(wěn)定。目前水溶性殼聚糖品種不多,一般需要溶解于醋酸等弱酸溶液中,由于pH值較低,DNA疫苗容易在制備過程中降解,因而開發(fā)和采用水溶性好的殼聚糖衍生物是十分必要的。隨著研究的深入和新劑型的開發(fā),殼聚糖納米載體和PEG交聯(lián)殼聚糖季銨鹽水凝膠作為佐劑和載體,將會(huì)在黏膜免疫產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[25]。因此,新型鼻黏膜疫苗的開發(fā),主要通過鼻黏膜表面抗原呈遞系統(tǒng)的改進(jìn)來實(shí)現(xiàn)。國外科學(xué)家已將痘病毒氣霧疫苗成功地應(yīng)用于猴體試驗(yàn),安全有效,艾滋病和人乳頭狀瘤病毒氣霧疫苗、麻疹氣霧疫苗已經(jīng)世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)。

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