以整合素αvβ3為靶點(diǎn)的腫瘤靶向制劑

楊旺桂，劉芳，邊疆

重慶佳辰生物工程有限公司 生物研究中心，重慶 400084

腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢，治療方法也在不斷發(fā)展，尋找腫瘤的生物標(biāo)志物進(jìn)行靶向治療已成為主流方向。血管是腫瘤獲取營養(yǎng)的來源，抑制腫瘤血管生成可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。因此，腫瘤血管的生物標(biāo)志物也是腫瘤治療不可抗拒的選擇。2004年2月，以血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）為靶標(biāo)的抑制血管生成的抗腫瘤藥貝伐單抗被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市，成為重磅炸彈產(chǎn)品，這也為其他以腫瘤血管生物標(biāo)志物為靶標(biāo)的藥物打開了成功的大門。

整合素是一類異二聚體跨膜細(xì)胞表面受體，由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基通過非共價(jià)鍵結(jié)合而成，是細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）之間相互作用的媒介。迄今已報(bào)道的整合素有24個(gè)，包括18個(gè)α亞基和8 個(gè)β亞基[1]。整合素與ECM 蛋白結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞的活動(dòng)和侵襲[2]，在血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[3]。在特定環(huán)境中，整合素能否與ECM的配體結(jié)合，決定著細(xì)胞的存活或凋亡[2]。整合素與其配體結(jié)合后，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、存活、侵襲等活動(dòng)[3-4]；整合素與配體的結(jié)合受阻，則會(huì)引起細(xì)胞凋亡[5]。

整合素αvβ3 是目前研究最廣泛的整合素家族成員，在休眠的內(nèi)皮細(xì)胞和其他正常組織中低表達(dá)甚至不表達(dá)[6]，但在多種腫瘤細(xì)胞[2]及腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中[7-9]的表達(dá)量卻會(huì)急劇升高，因此成為理想的抑制腫瘤及腫瘤血管生成的靶點(diǎn)。臨床研究表明，整合素αvβ3 的表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)，是腫瘤惡性程度的標(biāo)志[8,10]。通過抑制αvβ3的功能，可誘導(dǎo)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而使腫瘤無法獲得生長必需的營養(yǎng)，促使腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤的目的，而這個(gè)過程并不會(huì)對(duì)正常組織的血管造成不良影響[7-8]。

整合素αvβ3 通過識(shí)別RGD（Arg-Gly-Asp）序列，與其細(xì)胞外配體結(jié)合實(shí)現(xiàn)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。RGD序列普遍存在于ECM 的玻璃粘連蛋白、纖維結(jié)合蛋白、骨橋蛋白、人纖維蛋白原等黏附蛋白中，在整合素識(shí)別其配體過程中起重要作用[11]。由于腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞都能高表達(dá)整合素αvβ3，因此RGD 序列不僅能結(jié)合到腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，還能與腫瘤細(xì)胞結(jié)合[12]。正因?yàn)檫@一優(yōu)勢，使RGD 得到眾多研究者的關(guān)注，并設(shè)計(jì)和制備RGD 肽及其衍生物制劑進(jìn)行腫瘤的診斷和治療。

1 RGD診斷試劑

用放射性核素標(biāo)記RGD 肽及其衍生物制備示蹤劑，進(jìn)行整合素αvβ3 表達(dá)水平的顯影，達(dá)到腫瘤診斷的目的，已得到廣泛關(guān)注和研究。Chen 等[13-14]發(fā) 現(xiàn)，［18F］FAl-NOTA-PRGD2、［68Ga］Ga-NOTAPRGD2和［18F］FPPRGD2 都有良好的整合素αvβ3 靶向性，且在顯影和藥代動(dòng)力學(xué)方面沒有顯著差別，但［18F］FAl-NOTA-PRGD2和［68Ga］Ga-NOTA-PRGD2比［18F］FPPRGD2 的制備更加簡單，表現(xiàn)出更好的應(yīng)用前景。多中心臨床研究表明，作為整合素受體顯影的臨床示蹤劑，99mTc-3PRGD2 可敏感地用于肺癌的診斷[15]。［18F］AH-111585具有良好的生物分布，可無創(chuàng)檢測腫瘤血管，在Lewis肺癌的小鼠模型中能如實(shí)反映抗腫瘤治療的效果[16]，在7名患者中成功地檢測出了原發(fā)和轉(zhuǎn)移的乳腺癌[17]。另外，有多個(gè)放射性核素標(biāo)記的RGD 肽及其衍生物正進(jìn)行臨床試驗(yàn)，GE Healthcare 開發(fā)的［18F］AH-111585 已在2012 年9月完成Ⅱ期臨床試驗(yàn)。

2 RGD-脂質(zhì)體抗腫瘤制劑

脂質(zhì)體作為藥物載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：既可包載疏水性藥物，也能包載親水性藥物；具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)，可保護(hù)包載的藥物不被降解；表面用靶向抗體或配體修飾后具有特異靶向性[18]。RGD-脂質(zhì)體可靶向高表達(dá)整合素αvβ3 的腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，在腫瘤治療中作為抗腫瘤藥物的載體，可提高療效并降低副作用，具有廣闊的應(yīng)用前景[19]。

目前，以RGD-脂質(zhì)體進(jìn)行的抗腫瘤研究，主要將其作為放射性核素、細(xì)胞毒藥物、siRNA 等的載體，把藥物匯集在腫瘤組織，并通過內(nèi)吞作用，使藥物進(jìn)入腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，提高它們的抗腫瘤作用。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)吞RGD-10B 脂質(zhì)體的活性比RAD-10B 脂質(zhì)體和PEG-10B 脂質(zhì)體都高，且細(xì)胞活力下降程度較后兩者更顯著[18]。在人肺癌細(xì)胞A549和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的藥物吸收研究中，RGD-紫杉醇脂質(zhì)體和紫杉醇脂質(zhì)體的細(xì)胞吸收比泰素（Taxol）高3倍以上，RGD-紫杉醇脂質(zhì)體比紫杉醇脂質(zhì)體高約40%[20]。在人肺癌A549 裸鼠模型中，RGD-紫杉醇脂質(zhì)體處理組的腫瘤微血管密度顯著低于紫杉醇脂質(zhì)體處理組[20]。RGD-阿霉素脂質(zhì)體通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，可有效地把阿霉素載入腫瘤細(xì)胞，從而使腫瘤細(xì)胞中具有較高的阿霉素濃度[21-22]，對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16和A375的IC50分別僅為阿霉素脂質(zhì)體的52%和68%[21]。B16 小鼠模型中，RGD-阿霉素脂質(zhì)體比阿霉素脂質(zhì)體更有效地抑制了腫瘤生長，兩者延長小鼠的存活時(shí)間分別是生理鹽水處理組小鼠壽命的25.2%和12.0%[21]。同樣，在C26 直腸癌小鼠模型中，RGD-阿霉素脂質(zhì)體的療效比阿霉素和阿霉素脂質(zhì)體更好，RGD-阿霉素脂質(zhì)體延長小鼠的存活時(shí)間為18 d，阿霉素脂質(zhì)體為15 d[23]。因此，以RGD-脂質(zhì)體作為藥物載體進(jìn)行抗腫瘤治療，使腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的吸收增多，提高了抗腫瘤藥物的療效。

在RGD-脂質(zhì)體表面修飾細(xì)胞穿膜肽，可提高脂質(zhì)體的細(xì)胞吸收率；而修飾另一個(gè)靶向配體制備成雙靶向脂質(zhì)體，則可提高靶向特異性。八聚精氨酸（R8）作為細(xì)胞穿膜肽修飾于RGD-PEG-siRNA 脂質(zhì)體表面后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的吸收率和轉(zhuǎn)染效率較RGD-PEG-siRNA 脂質(zhì)體和PEG-siRNA 脂質(zhì)體均高得多，而這3 種脂質(zhì)體在不表達(dá)整合素αvβ3的皮膚內(nèi)皮細(xì)胞中，其細(xì)胞吸收和基因表達(dá)卻沒有顯著差異[24]。RGD/anginex（腫瘤血管生成抑制肽）雙靶向脂質(zhì)體在體外表現(xiàn)出協(xié)同靶向效應(yīng)；在B16F10 黑色素瘤小鼠模型中，雙靶向脂質(zhì)體的特異性較anginex-脂質(zhì)體和RGD-脂質(zhì)體高[25]。

另外，腫瘤細(xì)胞可通過表達(dá)P-糖蛋白而擁有耐藥性[26-27]，給腫瘤治療帶來不利，采用交叉給藥可提高療效。在阿霉素抗性的人乳腺癌MCF7/A 小鼠模型中，用RGD-P-糖蛋白siRNA 脂質(zhì)體與RGD-阿霉素脂質(zhì)體交替給藥，腫瘤生長被顯著抑制[19]。

3 RGD-膠束抗腫瘤制劑

聚合物膠束具備獨(dú)特的核-殼結(jié)構(gòu)，其疏水核提供天然的疏水性藥物載體環(huán)境，親水殼維持膠束在水溶液中的穩(wěn)定性，是難溶性藥物理想的給藥備選方案。

聚合物膠束作為藥物載體具有容易制備、粒徑?。?0～100 nm）、穩(wěn)定性好、載量大、釋放可控的優(yōu)勢[28]。制備膠束的聚合物有聚乙二醇-聚乳酸[28-31]、聚乙二醇-聚賴氨酸[32]、聚乙二醇-聚己內(nèi)酯[33]、聚乙二醇-硬脂酸-殼聚糖[34]等兩親性化合物。聚合物膠束本身沒有主動(dòng)靶向功能，但可在循環(huán)系統(tǒng)中長時(shí)間保持穩(wěn)定，通過EPR 效應(yīng)，即被動(dòng)靶向作用，作為抗腫瘤藥物的給藥系統(tǒng)[35]。在大多數(shù)臨床條件下，被動(dòng)靶向給藥副作用較大，因此，通過特異性配體、抗體進(jìn)行主動(dòng)靶向給藥，是膠束給藥系統(tǒng)的發(fā)展趨勢。

把兩親性聚合物的親水端與RGD 肽或其衍生物偶聯(lián)，制備的RGD-聚合物膠束可靶向腫瘤細(xì)胞的整合素αvβ3和αvβ5[36-37]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤細(xì)胞B16和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)RGD-聚合物膠束的吸收率分別比非靶向聚合物膠束高3.3和2.7 倍[28]，RGD-阿霉素聚合物膠束對(duì)MDA-435/LCC6WT細(xì)胞和MDA-435/LCC6MDR細(xì)胞的毒性分別是非靶向阿霉素聚合物膠束的10 倍和78 倍[33]；在MDA-435/LCC6WT小鼠模型中，注射RGD-阿霉素聚合物膠束的處理組，其存活時(shí)間顯著高于非靶向阿霉素聚合物膠束組、阿霉素組和生理鹽水組[33]。同樣劑量的阿霉素，RGD-阿霉素聚合物膠束比阿霉素注射液更有效地抑制腫瘤生長，且沒有明顯的副作用[33]。RGD-阿霉素聚合物膠束在血漿中能維持較高的阿霉素濃度，在心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟中的阿霉素則顯著低于阿霉素注射液；在腫瘤組織中，RGD-阿霉素聚合物膠束的阿霉素濃度顯著高于非靶向阿霉素聚合物膠束[29]。腫瘤切片免疫染色發(fā)現(xiàn)RGD-阿霉素-考布他汀A4 聚合物膠束對(duì)CD31 陽性的小鼠腫瘤血管抑制率為84.6%，顯著抑制了腫瘤細(xì)胞的繁殖，具有優(yōu)越的抗腫瘤療效[29]。B16F10 黑色素瘤小鼠模型注射RGD-阿霉素-考布他汀A4 聚合物膠束的腫瘤抑制率為90.3%，注射非靶向阿霉素-考布他汀A4 聚合物膠束的腫瘤抑制率則為66.7%，前者顯著優(yōu)于后者；延長小鼠存活時(shí)間上，靶向膠束也較非靶向膠束長，分別為生理鹽水處理組小鼠壽命的82.2%和36.8%[29]。RGD-紫杉醇聚合物膠束對(duì)惡性膠質(zhì)瘤U87MG 細(xì)胞的抑制能力較紫杉醇高2.5 倍，與非靶向紫杉醇聚合物膠束、紫杉醇處理組相比，顯著延長了荷瘤裸鼠的生存時(shí)間[30]。

此外，RGD-聚合物膠束包載超順磁納米粒，可作為核成像探針對(duì)腫瘤進(jìn)行靈敏地檢測，是腫瘤診斷和腫瘤治療監(jiān)控的有力工具[31,38]。

4 RGD-納米粒抗腫瘤制劑

納米粒作為藥物載體的主要作用是將藥物輸送到特定的細(xì)胞群，并釋放藥物發(fā)揮療效，而在其他部位則盡量減少藥物的滯留，使系統(tǒng)的毒性最小化。納米粒包括聚合物納米粒[39-44]、脂質(zhì)納米粒[45-46]、順磁納米粒[47-48]、生物大分子納米粒[49]等，通過適當(dāng)?shù)姆绞皆谄浔砻嫘揎桼GD 肽或其衍生物，可實(shí)現(xiàn)納米粒的腫瘤靶向作用。

RGD-納米粒與高表達(dá)整合素αvβ3 的血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的親和性，載藥后提高了藥物對(duì)靶細(xì)胞的毒性。以聚氧乙烯-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷包裹疏水性納米晶制備的納米粒，在100%胎牛血清中保持穩(wěn)定，與生物大分子發(fā)生的非特異性結(jié)合僅限于較低水平，表面修飾cRGD（cyclo RGD）后，對(duì)高表達(dá)整合素αvβ3 的U87MG 膠質(zhì)瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的親和性，而對(duì)低表達(dá)整合素αvβ3的MCF-7 乳腺癌細(xì)胞僅發(fā)生微量的結(jié)合[43]。以c（RGDfK）和轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的多分枝兩親性共聚物——聚胺酯丙交酯/L-磷脂酰乙醇胺共聚物嵌段制備的雙靶向紫杉醇納米粒，對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的毒性比紫杉醇提高了10 倍，對(duì)高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的人宮頸癌細(xì)胞的毒性提高了2 倍[42]。說明靶向載藥納米粒通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用使藥物有效進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞和靶向腫瘤細(xì)胞。

RGD-納米粒的腫瘤組織靶向性，提高了藥物的抗腫瘤療效，延長了荷瘤小鼠的生存時(shí)間。c（RGDfK）-脂質(zhì)納米粒在體外能被高表達(dá)整合素αvβ3 的HEK293（β3）細(xì)胞特異性結(jié)合并內(nèi)吞，靜脈注射HEK293（β3）移植瘤裸鼠模型后，cRGD-脂質(zhì)納米粒可累積在腫瘤部位[46]。c（RGDyK）-PEG-聚環(huán)丙烷碳酸酯紫杉醇納米粒比PEG-聚環(huán)丙烷碳酸酯紫杉醇納米粒、泰素顯示出更強(qiáng)的穿透性，并積聚在腫瘤組織，顯示較強(qiáng)的腫瘤生長抑制作用[40]。c（RGDyK）-聚環(huán)丙烷碳酸酯納米粒載藥系統(tǒng)可以能量依賴的方式將紫杉醇轉(zhuǎn)運(yùn)到人U87MG 惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，使細(xì)胞微管明顯變得更加穩(wěn)定，抑制了腫瘤細(xì)胞的繁殖，延長U87MG 小鼠模型的存活時(shí)間為生理鹽水處理組小鼠壽命的52.4%，高于非靶向紫杉醇聚環(huán)丙烷碳酸酯納米粒的28.6%[41]。生長在大腦的惡性膠質(zhì)瘤進(jìn)行藥物治療時(shí)，藥物須通過血腦屏障和血管-腫瘤屏障，導(dǎo)致腫瘤對(duì)藥物的吸收非常有限，嚴(yán)重影響了療效[50-52]；當(dāng)把腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）基因組裝到RGD-納米粒（RGD-PEG-PEI/pORF-hTRAIL）中，與靶向腦部血管的紫杉醇膠束（CDX-PEG-PLA-PTX）聯(lián)合給藥時(shí)，可顯著延長顱內(nèi)惡性膠質(zhì)瘤（U87）裸鼠模型的生存時(shí)間[44]。另外，RGD-納米粒在腫瘤部位的濃度高于肝臟、脾和肺，RGD-白介素2 基因納米粒處理的神經(jīng)母細(xì)胞瘤（Neuro-2A）小鼠模型，其腫瘤體積比對(duì)照小了75%，且該處理組有三分之一的小鼠長期生存[45]。

RGD-納米粒除了可作為藥物載體進(jìn)行抗腫瘤治療外，也可作為探針進(jìn)行腫瘤診斷和治療過程的監(jiān)控。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞（MLS）對(duì)RGD-超小順磁氧化鐵納米粒（RGD-USPIO）的吸收顯著高于非靶向納米粒，在惡性膠質(zhì)瘤（U87MG）裸鼠模型中，RGD-USPIO 主要集中在腫瘤新生血管區(qū)域[48]。通過活體顯微鏡檢查、核磁共振成像、整體熒光顯像等技術(shù)的多模態(tài)成像，RGD-順磁量子點(diǎn)納米?？杀O(jiān)控腫瘤血管的生成[47]。以靶向核素、整合素αvβ3、Tnc蛋白的AS1411、RGD、TTA1制備的多適配體靶向納米粒作為腫瘤探針進(jìn)行腫瘤診斷，顯示出比AS1411、RGD、TTA1 單個(gè)探針更強(qiáng)的特異性和信號(hào)強(qiáng)度[41]。

5 結(jié)語

發(fā)現(xiàn)RGD是細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)至今已超過20年，對(duì)其在疾病診斷和治療中的應(yīng)用備受關(guān)注。對(duì)RGD腫瘤診斷試劑的研究已進(jìn)入臨床階段，而以RGD 制備靶向抗腫瘤藥物還未見相關(guān)的臨床試驗(yàn)報(bào)道。RGD-納米抗腫瘤制劑，包括脂質(zhì)體、膠束和納米粒，在體外和動(dòng)物移植瘤模型中都表現(xiàn)出比非靶向納米抗腫瘤制劑和已上市藥物有更好的療效，其在臨床上的應(yīng)用效果值得期待。

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