環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其應(yīng)用

趙麗娟, 周 潔, 高 誠(chéng)

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 揚(yáng)州 225009; 2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心, 上海 201203)

·綜 述·

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其應(yīng)用

趙麗娟1,2, 周 潔2, 高 誠(chéng)2

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 揚(yáng)州 225009; 2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心, 上海 201203)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)是一種新的核酸擴(kuò)增法。該方法在一定溫度下一步即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。由于其擴(kuò)增效率極高、反應(yīng)簡(jiǎn)單快速、高特異性和反應(yīng)結(jié)果只需肉眼觀察的特點(diǎn)，LAMP法已廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌等的定性定量檢測(cè)和臨床疾病的診斷。本文介紹了LAMP方法的原理及其在微生物分子檢測(cè)方面的應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP); 核酸擴(kuò)增; 基因檢測(cè)

2000年日本學(xué)者Notomi等[1]發(fā)明一種新型的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法(即LAMP 法)。LAMP方法針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物, 利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63℃左右)保溫30～60 min,即可完成核酸的擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增效率極高，可在15～60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)109～1010倍的擴(kuò)增。與常規(guī)PCR相比，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法是一種不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過(guò)程，且簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的全新的核酸擴(kuò)增方法[2]。

1 LAMP技術(shù)的原理

LAMP技術(shù)針對(duì)靶基因設(shè)定的6個(gè)不同的區(qū)域設(shè)計(jì)了4種特異引物，包括一對(duì)內(nèi)引物(FIP和BIP)和一對(duì)外引物(F3和B3)。FIP(forward inner primer)3′端含有與F2c互補(bǔ)的F2區(qū)段，在5′端含有與F1c相同序列的區(qū)段; BIP(backward inner primer)3′端含有與B2c互補(bǔ)的B2區(qū)段，在5′端含有與B1c相同序列的區(qū)段; F3(forward outer primer)含有與目標(biāo)DNA上的F3序列相同的區(qū)段; B3(backward outer primer)含有與目標(biāo)DNA上的B3序列相同的區(qū)段。其擴(kuò)增原理是根據(jù)這4條特殊引物，配合Bst DNA聚合酶的作用，在等溫條件(63℃左右)DNA開(kāi)始合成。利用可以產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)的引物和Bst DNA聚合酶的鏈置換合成活性，靶序列兩端引物結(jié)合處循環(huán)不斷地產(chǎn)生環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)。當(dāng)一個(gè)引物向雙鏈DNA 的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈解離變成單鏈，引物在恒溫條件下不斷引發(fā)新鏈的合成，靶基因因此得到高效擴(kuò)增。反應(yīng)可分為擴(kuò)增循環(huán)起始結(jié)構(gòu)形成階段和擴(kuò)增循環(huán)階段[3]。

為使反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步縮短, 可在體系中加入環(huán)引物(Loop Primer F/B)。LAMP環(huán)引物是指在啞鈴狀結(jié)構(gòu)的5′末端的環(huán)狀單鏈部分(B1區(qū)段與B2區(qū)段之間, 或者F1區(qū)段與F2區(qū)段之間)導(dǎo)入具有互補(bǔ)序列的環(huán)引物(分別為環(huán)引物B和F), 就能增加DNA合成的起點(diǎn)。環(huán)引物的加入，使含環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單鏈都能用作擴(kuò)增起點(diǎn)，稱(chēng)為L(zhǎng)AMP快速法。與傳統(tǒng)LAMP方法相比，LAMP快速法的擴(kuò)增時(shí)間更短。

2 LAMP技術(shù)的特點(diǎn)

LAMP技術(shù)相比其他技術(shù)有很多特點(diǎn)。4個(gè)引物對(duì)靶序列的6個(gè)特異序列區(qū)的識(shí)別，保證了LAMP擴(kuò)增的高度特等溫高效。LAMP在等溫條件下擴(kuò)增，條件單一，受非靶序列的影響小，并且其檢測(cè)極限很小，僅為幾個(gè)拷貝。確定了最適反應(yīng)溫度后，由于無(wú)需預(yù)先熱變性的優(yōu)勢(shì)，LAMP反應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)就可將靶序列擴(kuò)增至109倍[4]。儀器要求寬松，不需要PCR儀和其他檢測(cè)儀器，僅水浴鍋或其他恒溫儀器即能完成反應(yīng)。產(chǎn)物易檢測(cè)，只需肉眼觀察或濁度儀檢測(cè)沉淀濁度即能判斷擴(kuò)增與否。操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)不需要特殊試劑，比傳統(tǒng)PCR簡(jiǎn)單，反應(yīng)后無(wú)需電泳，操作人員無(wú)需額外培訓(xùn)。LAMP技術(shù)也存在缺陷。LAMP的擴(kuò)增是利用Best DNA聚合酶的鏈置換反應(yīng)，因?yàn)閷?duì)靶序列長(zhǎng)度有一定的要求，最適長(zhǎng)度在300～500 bp內(nèi)，無(wú)法進(jìn)行長(zhǎng)鏈DNA 的擴(kuò)增。由于反應(yīng)靈敏度高，擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量大, LAMP反應(yīng)很易造成氣溶膠污染。

3 LAMP技術(shù)的應(yīng)用

由于LAMP相比普通核酸擴(kuò)增方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)得到越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)人員的青睞。不僅如此，LAMP技術(shù)近年來(lái)已被多國(guó)廣泛應(yīng)用于病原體快速檢測(cè)，其試劑盒的研發(fā)也開(kāi)始變成新的趨勢(shì)。近年來(lái)LAMP技術(shù)又有新的發(fā)展和改進(jìn)，最新報(bào)道稱(chēng)聚乙二醇可加速LAMP反應(yīng)[5]，而其在微生物分子檢測(cè)方面的報(bào)道也不斷出現(xiàn)。本文重點(diǎn)列舉總結(jié)了一些國(guó)內(nèi)外成就以及一些最新進(jìn)展。

3.1 LAMP在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

Imai等[6]用RT-LAMP建立了一個(gè)實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)H5N1禽流感病毒的方法，實(shí)驗(yàn)對(duì)人類(lèi)和野生鳥(niǎo)類(lèi)咽拭子進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明RT-LAMP對(duì)H5亞型有更高的特異性，LAMP可作為一個(gè)監(jiān)測(cè)禽流感爆發(fā)的診斷工具。Duc等[7]設(shè)計(jì)了一套用RT-LAMP方法特異性擴(kuò)增H5N1禽流感病毒HA基因新的引物, 對(duì)比之前報(bào)道過(guò)的設(shè)計(jì)，RT-LAMP法有更好的敏感性和特異性。Zhang等[8]報(bào)道了一項(xiàng)人類(lèi)禽流感病毒HA基因和NA基因的RT-LAMP檢測(cè)方法。根據(jù)與WHO推薦的RT-PCR方法相比, RT-LAMP法更快速。其H7基因的檢測(cè)極限與RT-PCR相近，但其N(xiāo)9基因的檢測(cè)敏感性比RT-PCR高出102倍。陳蕾等[9]建立了豬瘟病毒RT-LAMP檢測(cè)法，靈敏度試驗(yàn)顯示RT-LAMP的靈敏度比RT-PCR高102倍，并進(jìn)行特異性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果均為陰性證明了RT-LAMP對(duì)豬瘟病毒的高度特異性。Yin等[10]針對(duì)豬瘟病毒E2基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-LAMP試驗(yàn)。結(jié)果表明RT-LAMP的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為均優(yōu)于常規(guī)RT-PCR，特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其不對(duì)其他豬病毒發(fā)生擴(kuò)增，特異性很高。Miren等[11]用RT-LAMP試劑盒法高效的檢測(cè)出諾瓦克病毒GI型和GII型, 對(duì)比證實(shí)了其高度的敏感性。Li等[12]證實(shí)用RT-LAMP方法檢測(cè)技術(shù)能基本克服目前在丙型肝炎病毒基因診斷方面存在的一些弊端，且與RT-PCR相比在可操作性和檢測(cè)時(shí)間及設(shè)備要求方面擁有更大的優(yōu)勢(shì)。Li等[13]用LAMP方法對(duì)淋巴囊腫病毒進(jìn)行快速檢測(cè)證實(shí)了其檢出極限與RT-PCR類(lèi)似，比普通PCR高出10倍，并認(rèn)為其或能進(jìn)行淋巴囊腫病毒潛在感染的檢測(cè)。黃鶴等[14]建立了羊痘病毒CaPV-LAMP的儀器和目測(cè)兩種方法，其檢測(cè)方法的最低檢測(cè)值為比OIE推薦的PCR方法高104倍，為羊痘病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段。Qiao等[15]成功建立了赤羽病毒的RT-LAMP檢測(cè)法。實(shí)驗(yàn)根據(jù)赤羽病毒核蛋白上的高保守片段設(shè)計(jì)引物，結(jié)果顯示LAMP具有很高的特異性和敏感性，檢測(cè)極限為5.0 TCID50/ml。Shen等[16]應(yīng)用RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)了番木瓜畸型花葉病毒，根據(jù)病毒CP保守序列設(shè)計(jì)引物，結(jié)果證實(shí)其敏感性比RT-PCR高出10倍。LAMP方法打破了此前沒(méi)有可用快速檢測(cè)番木瓜畸型花葉病毒方法的問(wèn)題。Dukes等[17]根據(jù)3D蛋白聚合酶區(qū)設(shè)計(jì)引物建立的了口蹄疫病毒的LAMP檢測(cè)法，并與RT-PCR作比較。敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用LAMP方法10個(gè)拷貝22min即可檢出，速度與靈敏度均高于RT-PCR，特異性實(shí)驗(yàn)證實(shí)該方法有很高的特異性，鑒于其快速高效，LAMP方法可用于野外病原的快速檢測(cè)。

3.2 LAMP在細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用

Maruyama等[18]率先將LAMP方法與原位雜交技術(shù)結(jié)合來(lái)檢測(cè)攜帶stx2基因的大腸埃希菌0157:H7，并應(yīng)用熒光抗體同步細(xì)胞鑒定。呂恒等[19]建立的基于顏色判定的大腸埃希菌O157:H7 LAMP檢測(cè)方法特異而靈敏，適用于大腸埃希菌O157:H7的快速檢測(cè)。朱杰儀等[20]建立了副豬嗜血桿菌LAMP方法。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了LAMP方法在恒溫條件下的高特異性，擴(kuò)增反應(yīng)在1h內(nèi)完成，靈敏度試驗(yàn)證實(shí)其比PCR方法敏感102倍。Mitarai等[21]證實(shí)了LAMP方法用臨床樣本檢測(cè)肺結(jié)核的可行性，直接從痰液中檢測(cè)得結(jié)核分枝桿菌的靈敏度很高。方法簡(jiǎn)單、快速，易操作，可作為一個(gè)檢測(cè)肺結(jié)核的主要方法，也能對(duì)其他檢測(cè)方法做出補(bǔ)足。Goto等[22]建立了金黃色葡萄球菌腸毒素4種基因型的LAMP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明與傳統(tǒng)PCR相比有相等的特異性和較高的靈敏度。證實(shí)LAMP技術(shù)是一種可應(yīng)用于臨床診斷來(lái)篩查和分型金黃色葡萄球菌腸毒素的方法。Han等[23]針對(duì)弧菌溶血素基因(vvhA)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和特異性和敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明無(wú)假陽(yáng)性或假陰性，特異性很高且比常規(guī)的PCR敏感10倍。Wei等[24]針對(duì)鼠疫耶爾森氏菌特有F1基因設(shè)計(jì)一套LAMP引物，為鼠疫炎耶爾森菌的檢測(cè)提供了新的發(fā)展方向，認(rèn)為L(zhǎng)AMP方法有望成為簡(jiǎn)易的常規(guī)檢測(cè)手段，尤其適用于基層檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)及現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)。Yang等[25]針對(duì)沙門(mén)氏菌的兩個(gè)不同蛋白區(qū)域設(shè)計(jì)引物，同時(shí)用兩種LAMP和PCR方法檢測(cè)沙門(mén)氏菌，結(jié)果表明兩種LAMP方法都高度敏感，是PCR方法的102倍。對(duì)比顯示，兩種LAMP方法都能在帶殼蛋中快速精確檢測(cè)出沙門(mén)氏菌血清型, 并有望列入蛋的沙門(mén)氏菌檢測(cè)程序。

3.3 LAMP在寄生蟲(chóng)測(cè)中的應(yīng)用

Isaia等[26]對(duì)弓形蟲(chóng)B1和TgOWP基因進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，并結(jié)合免疫熒光試驗(yàn)和PCR，結(jié)果顯示LAMP靈敏度極高，證實(shí)LAMP在弓形蟲(chóng)檢測(cè)方面快速特異和靈敏的優(yōu)越性。Hiroka等[27]對(duì)純化后的瘧原蟲(chóng)SPECT2基因進(jìn)行LAMP擴(kuò)增, 并利用LAMP方法成功檢測(cè)出一只易被顯微鏡漏檢的僅攜帶一個(gè)卵囊的按蚊, 證實(shí)了LAMP方法的高靈敏性。Wang等[28]根據(jù)瑟氏泰勒蟲(chóng)P33基因設(shè)計(jì)引物, 建立了LAMP檢測(cè)方法, 結(jié)果顯示LAMP的靈敏度和陽(yáng)性檢出率均高于常規(guī)PCR。Matovu 等[29]利用LAMP和PCR方法對(duì)錐蟲(chóng)進(jìn)行比較檢測(cè)。結(jié)果表明PCR方法的用時(shí)是LAMP方法的5倍。Nkouawa 等[30]建立了人類(lèi)鏈狀帶絳蟲(chóng)的LAMP檢測(cè)方法。Sako等[31]用LAMP方法，從寄生蟲(chóng)組織和人類(lèi)排泄物中成功檢測(cè)和區(qū)分了人類(lèi)鏈狀帶絳蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)、牛帶絳蟲(chóng)和亞洲帶絳蟲(chóng)，表明LAMP方法很適合臨床樣本的檢測(cè)。

3.4 LAMP在真菌測(cè)中的應(yīng)用

Ludwig等[32]對(duì)禾谷鐮孢菌的gaoA基因設(shè)計(jì)引物并建立LAMP檢測(cè)方法，靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LAMP法對(duì)純化后靶基因的檢測(cè)極限極低，并且特異性實(shí)驗(yàn)證明其只擴(kuò)增出禾谷鐮孢菌DNA，證實(shí)了LAMP法的高度特異性。

3.5 支原體的檢測(cè)

Saito等[33]建立了肺炎支原體的LAMP檢測(cè)方法，結(jié)果表明在陽(yáng)性樣本檢出率一致的情況下，LAMP法的檢出限值優(yōu)于RT-PCR法，證明了LAMP方法的高敏感性。Jiahe等[34]根據(jù)豬肺炎支原體mhp165基因設(shè)計(jì)引物并建立了LAMP快速檢測(cè)方法。靈敏度實(shí)驗(yàn)表明10fg DNA在30min內(nèi)即可被檢測(cè)到，LAMP技術(shù)加速并簡(jiǎn)化了豬肺炎支原體的檢測(cè)程序。

3.6 轉(zhuǎn)基因方面的應(yīng)用

Tao等[35]應(yīng)用LAMP方法分別針對(duì)外源性核酸HbsAg和hATIII設(shè)計(jì)一套引物來(lái)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因山羊。在加入SYBR Green后目測(cè)即可見(jiàn)結(jié)果，對(duì)比發(fā)現(xiàn)其比傳統(tǒng)PCR方法更敏感快速和簡(jiǎn)便，證實(shí)了LAMP是一種快速準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因山羊的方法。

4 小結(jié)與展望

LAMP技術(shù)以其高效快速的特點(diǎn)近年來(lái)發(fā)展迅速, 為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)提供了一個(gè)新途徑。由于其簡(jiǎn)單的操作和試劑盒的開(kāi)發(fā), 該技術(shù)很有可能在未來(lái)替代傳統(tǒng)核算擴(kuò)增方法, 由實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)展到實(shí)地, 更好地應(yīng)用于基層診斷檢測(cè)。LAMP技術(shù)本身尚存在缺陷,產(chǎn)物易造成污染以及假陽(yáng)性問(wèn)題還需改善?？偸?隨著LAMP技術(shù)的進(jìn)一步完善和成熟, 其必能在病原體基因檢測(cè)方面發(fā)揮重要作用并逐漸應(yīng)用于臨床。

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Loop-mediated Isothermal Amplification Technique and Its Application

ZHAO Lijuan1,2, ZHOU Jie2, GAO Cheng2
(1. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;2. Shanghai Laboratory Animal Research Center, Shanghai 201203, China)

Loop-mediated isothermal amplification(LAMP) is a novel nucleic acid amplification method.At a certain temperature, LAMP performed only one step to terminate the process. Due to its high efficiency, simplicity, rapidly, high specificity and theResultof LAMP is easily detected by naked eyes,LAMP has been widely applied in the qualitative and quantitative detection of viruses, bacteria and clinical diagnosis of disease. In this paper, we introduced the principle of LAMP and its applicability in molecular detection and diagnosis.

Loop-mediated isothermal amplification(LAMP); Nucleic acid amplification;Gene detection

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0162-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.018

2013-10-16

上海市科委基金項(xiàng)目(No.11140901002)

趙麗娟(1988-),女, 碩士研究生。研究方向: LAMP技術(shù)的應(yīng)用

周 潔, 女, 副研究員。E-mail: zhoujie0526@163.com