卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞在2D和3D培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)特性的比較

貢 震，蘇亦平，徐寒子，孫志華，吳 強(qiáng)

二維細(xì)胞培養(yǎng)(two dimensional cell culture, 2DCC)系統(tǒng)目前仍是惡性腫瘤生物學(xué)研究及治療學(xué)評(píng)價(jià)最常用的體外平臺(tái)。然而，由于體內(nèi)生長(zhǎng)的實(shí)體瘤是一個(gè)三維的細(xì)胞群，在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與微環(huán)境之間存在著廣泛的相互作用和相互影響，因而2DCC系統(tǒng)并不能真實(shí)模擬腫瘤的實(shí)際發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸情況。隨之，三維細(xì)胞培養(yǎng)( three dimensional cell culture, 3DCC)應(yīng)運(yùn)而生[1]。本項(xiàng)研究選擇Matrigel膠作為3DCC的支撐系統(tǒng)，對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3在2DCC和3DCC系統(tǒng)中的生長(zhǎng)特性進(jìn)行了觀察，現(xiàn)報(bào)告分析如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 胎牛血清購于杭州四季青公司，RPMI1640為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品，Matrigel為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，CCK-8試劑盒購于日本Dojindo公司，Brdu檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒購于南京凱基公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院吳步初博士惠贈(zèng)。2DCC系統(tǒng)下，細(xì)胞生長(zhǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640全培養(yǎng)液中，于37 ℃恒溫、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每2～3天換液/傳代1次。3DCC系統(tǒng)下，先將Matrigel置于4 ℃過夜，后將其與完全培養(yǎng)液以1∶2稀釋后鋪板(120 μl/孔，24孔板)，37℃孵育15～30 min；收集2DCC系統(tǒng)下消化所得SK-OV-3細(xì)胞，重懸細(xì)胞于全培養(yǎng)液中，并接種至上述預(yù)包被Matrigel的培養(yǎng)板上(3 000細(xì)胞+250 μl全培養(yǎng)液/孔)，培養(yǎng)10～30 min，加入含10%Matrigel的預(yù)冷全培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 2DCC或3DCC系統(tǒng)下培養(yǎng)的SK-OV-3細(xì)胞，在倒置像差顯微鏡下以Nikon相機(jī)定期、隨機(jī)拍照，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.4 細(xì)胞生長(zhǎng)檢測(cè) 接種細(xì)胞2 000、3 000、10 000細(xì)胞/孔于96孔培養(yǎng)板，如前述方法培養(yǎng)，每組設(shè)6個(gè)平行孔，并設(shè)無細(xì)胞對(duì)照孔，72 h后每孔加10 μl CCK-8，孵育4 h上酶標(biāo)儀測(cè)450 nm吸光度(A)；繪制工作曲線，參照工作曲線計(jì)算相對(duì)細(xì)胞數(shù)。

1.5 細(xì)胞增殖檢測(cè) 接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，同前述條件培養(yǎng)，加入Brdu后8～10 h酶解、收集、固定，石蠟包埋，病理科制備石蠟切片，按Brdu免疫組化試劑盒說明書操作，光鏡下觀察。細(xì)胞核染為棕色的即為陽性細(xì)胞。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè) 接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，同前述條件培養(yǎng)后酶解、收集細(xì)胞，加預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過夜，離心棄去固定液，以50 μg/ml的PI染液及RNase 37 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌、重懸，400目的篩網(wǎng)過濾1次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞株在不同培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)形態(tài)的觀察 在2DCC系統(tǒng)中接種SK-OV-3細(xì)胞6～8 h后，大部分細(xì)胞呈圓形貼壁狀，部分細(xì)胞已鋪展；細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)2～3 d后細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合，可見細(xì)胞簇。在3DCC系統(tǒng)中，接種后立即觀察也呈透亮圓形，2～3 d后可觀察到部分細(xì)胞出現(xiàn)分裂相，5～7 d后可多細(xì)胞球樣體(multi-cellular spheroid, MCS)形成，此后1～2周內(nèi)MCS逐漸增大至一定程度后再無明顯變化。

2.2 細(xì)胞株在不同培養(yǎng)系統(tǒng)中的生長(zhǎng)情況 SK-OV-3細(xì)胞在2DCC和3DCC系統(tǒng)中的生長(zhǎng)情況如圖1所示：2 000或3 000細(xì)胞/孔：接種于96孔板后培養(yǎng)3 d，在2DCC系統(tǒng)下生長(zhǎng)速度均顯著高于3DCC系統(tǒng)；而10 000細(xì)胞/孔組在2DCC系統(tǒng)下生長(zhǎng)速度則顯著低于3DCC系統(tǒng)。

圖1 SK-OV-3在2DCC和3DCC系統(tǒng)中生長(zhǎng)的對(duì)比

2.3 細(xì)胞株在不同培養(yǎng)系統(tǒng)中的增殖情況 Brdu為5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶(T)在細(xì)胞增殖的DNA合成期摻入正在復(fù)制的DNA分子；而后利用抗Brdu單克隆抗體，IHC染色，顯示增殖細(xì)胞[2]。結(jié)果顯示，在空白對(duì)照組(加入Brdu單抗對(duì)照抗體)均未見棕黃色的陽性細(xì)胞(見圖2A-B)，而2DCC(見圖2C)或3DCC(見圖2D)培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)組均可見棕黃色的陽性細(xì)胞，且2DCC系統(tǒng)明顯高于3DCC系統(tǒng)。

圖2 SK-OV-3在2DCC和3DCC系統(tǒng)中的增殖(×400)(A：2DCC對(duì)照組，B：3DCC對(duì)照組；C：2DCC實(shí)驗(yàn)組；D：3DCC實(shí)驗(yàn)組)

2.4 細(xì)胞株在不同培養(yǎng)系統(tǒng)中周期分布 以PI單染-流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SK-OV-3細(xì)胞經(jīng)2DCC和3DCC系統(tǒng)培養(yǎng)后細(xì)胞周期分布情況，測(cè)定結(jié)果如圖4所示：SK-OV-3細(xì)胞在2DCC中培養(yǎng)， S/G2-M期細(xì)胞比例為(53.7±5.8)%，顯著高于在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中S/G2-M期細(xì)胞比例[(40.9±2.0)%，P<0.05]，而G0/G1期細(xì)胞比例為(43.5±8.1)%，略低于在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中G0/G1期細(xì)胞比例(46.9±2.3)%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 SK-OV-3細(xì)胞在2DCC和3DCC系統(tǒng)中生長(zhǎng)的周期分布

3 討論

卵巢癌是常見婦科惡性腫瘤之一，在女性生殖道腫瘤中占第3位，同時(shí)也是婦科腫瘤中致死率最高的腫瘤[3]。限于對(duì)卵巢癌的生物學(xué)研究尚不深入；同時(shí)新的治療方法雖不斷涌現(xiàn)[4]，但尚缺乏客觀可靠的評(píng)價(jià)依據(jù)，因此，發(fā)展卵巢癌生物學(xué)研究及治療學(xué)評(píng)價(jià)的研究平臺(tái)即具有現(xiàn)實(shí)意義。

目前，對(duì)于實(shí)體瘤的體外研究，仍然采用以單層細(xì)胞培養(yǎng)為主的2DCC系統(tǒng)。然而，活體中幾乎所有實(shí)體瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)都基于由胞外基質(zhì)構(gòu)建的3D微環(huán)境。大量的研究表明微環(huán)境對(duì)細(xì)胞行為及生理機(jī)能都有重要影響，生長(zhǎng)在2D環(huán)境下的貼壁生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞，由于缺乏微環(huán)境的支持與影響，必將失去一些原有的特性與能力。

3DCC系統(tǒng)的開發(fā)與成功應(yīng)用，為腫瘤的生物學(xué)研究及治療學(xué)評(píng)價(jià)提供了新的手段。3DCC系統(tǒng)可概括為在含基質(zhì)蛋白的半固體膠中或人工合成的微孔支架中培養(yǎng)細(xì)胞，使細(xì)胞能夠在三維空間中增殖，如同體內(nèi)的組織一樣，形成一定的立體結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)在研究腫瘤生物學(xué)特性中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。這是因?yàn)檩^之2DCC，在3DCC系統(tǒng)中能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞間以及細(xì)胞與基質(zhì)間的相互聯(lián)系，能夠更好的模擬復(fù)雜的體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境[5]。

腫瘤多細(xì)胞球體MCS培養(yǎng)模型是發(fā)展最早、同時(shí)也是最為成熟的3DCC培養(yǎng)模型[6]。腫瘤組織由于腫瘤細(xì)胞結(jié)合緊密，支持物質(zhì)難以進(jìn)入組織內(nèi)部，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分配不均，使實(shí)體瘤內(nèi)、外細(xì)胞的生長(zhǎng)存在差異。2DCC培養(yǎng)系統(tǒng)中，腫瘤細(xì)胞均勻接受支持物質(zhì)，生長(zhǎng)活躍。而MCS是由多個(gè)腫瘤細(xì)胞組成的球狀聚集體，在MCS系統(tǒng)中，靠近中心的細(xì)胞，能夠直接接觸培養(yǎng)基、氧氣，細(xì)胞生長(zhǎng)活躍；而越靠近周邊的細(xì)胞，氧氣、支持物質(zhì)越少，代謝終產(chǎn)物越多，生長(zhǎng)越為緩慢。MCS這種異質(zhì)性的細(xì)胞結(jié)合以及球樣體建立的物質(zhì)梯度極類似于體內(nèi)實(shí)體瘤微環(huán)境。因此，和腫瘤單細(xì)胞相比，MCS是研究實(shí)體瘤的更好模型。

本研究采用Matrigel為細(xì)胞培養(yǎng)支撐體系[7]，觀察了人卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3在此系統(tǒng)下的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示SK-OV-3在培養(yǎng)5～7 d后即可見MCS形成，提示3DCC系統(tǒng)成功建立。

我們進(jìn)一步對(duì)比了SK-OV-3細(xì)胞在兩系統(tǒng)中的生長(zhǎng)速度，發(fā)現(xiàn)低密度接種SK-OV-3細(xì)胞于3DCC系統(tǒng)，其生長(zhǎng)速度顯著低于在2DCC系統(tǒng)培養(yǎng)中的生長(zhǎng)速度，這可能與3DCC生長(zhǎng)方式本身相關(guān)，即相互接觸的細(xì)胞可能較早即抑制了彼此的生長(zhǎng)；營(yíng)養(yǎng)和代謝物質(zhì)在3DCC培養(yǎng)情況下的梯度變化對(duì)生長(zhǎng)也有抑制作用。而高密度接種于3DCC系統(tǒng)結(jié)果剛好相反，其生長(zhǎng)速度顯著高于2DCC系統(tǒng)，這可能與2DCC系統(tǒng)已達(dá)全接觸抑制，而3DCC系統(tǒng)可以提供更多的生長(zhǎng)空間，尚未達(dá)全接觸抑制；這也與形態(tài)學(xué)中的觀察結(jié)果相符。

在觀察卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞增殖及周期的研究中，我們同樣將3DCC系統(tǒng)與2DCC系統(tǒng)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：增殖的SK-OV-3細(xì)胞在2DCC系統(tǒng)中明顯增多；S/G2-M期細(xì)胞比例顯著高于在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中S/G2-M期細(xì)胞比例。因此，我們認(rèn)為SK-OV-3在3DCC系統(tǒng)中生長(zhǎng)受限，可能與其在3DCC系統(tǒng)下細(xì)胞增殖受抑、周期阻滯有關(guān)。

綜上所述，通過采用Matrigel作為細(xì)胞體外培養(yǎng)的支撐體系，我們成功建立了卵巢癌細(xì)胞在體外的3DCC系統(tǒng)，從而為卵巢癌的研究提供了新的更好的體外研究平臺(tái)。3DCC對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有較大的影響，而這可能與其在3DCC系統(tǒng)下增殖受抑、周期阻滯有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Smith BH,Gazda LS,Conn BL,et al.Three-dimensional culture of mouse renal carcinoma cells in agarose macrobeads selects for a subpopulation of cells with cancer stem cell or cancer progenitor properties[J].Cancer Res,2011,71(3):716-724.

[2] Webster AF,Williams A,Recio L,et al.Bromodeoxyuridine(BrdU) treatment to measure hepatocellular proliferation does not mask furan-induced gene expression changes in mouse liver[J].Toxicology,2014,323:26-31.

[3] Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics, 2012[J].CA Cancer J Clin,2012,62(1):10-29.

[4] Banerjee S,Kaye S.The role of targeted therapy in ovarian cancer[J].Eur J Cancer,2011,47(Suppl 3):S116-130.

[5] Maltman DJ,Przyborski SA.Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses[J].Biochem Soc Trans,2010,38(4):1072-1075.

[6] Lin RZ,Chang HY.Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research[J].Biotechnol J,2008,3(9-10):1172-1184.

[7] Sodunke TR,Turner KK,Caldwell SA,et al.Micropatterns of Matrigel for three-dimensional epithelial cultures[J].Biomaterials,2007,28(27):4006-4016.