雞傳染性法氏囊病毒常用檢測技術概述

趙青梅 （山西省平遙縣畜牧中心 031100）

雞傳染性法氏囊病毒常用檢測技術概述

趙青梅 （山西省平遙縣畜牧中心 031100）

雞傳染性法氏囊病(IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一種主要危害雛雞的免疫抑制性傳染病。本病發(fā)病率高，發(fā)生本病的雞場，常常出現新城疫、馬立克氏病等疫苗接種的免疫失敗，這種免疫抑制現象常使發(fā)病率和死亡率急劇上升。因此快速準確地檢測雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)，對正確診斷、預防雞傳染性法氏囊病，降低養(yǎng)殖戶的經濟損失十分重要。本文將就雞傳染性法氏囊病病毒常用的檢測技術進行分類介紹。

1 雞傳染性法氏囊病毒分離

取病雞的法氏囊或脾臟，研碎后加入滅菌生理鹽水，制成混懸液，離心取上清液，加適量雙抗，通過絨毛尿囊膜途徑接種9～11日齡SPF雞胚。3～5d后雞胚出現死亡，胚體充血、出血、肝臟有斑點狀壞死和出血斑。取絨毛尿囊膜或尿囊液與雞傳染性法氏囊病陽性血清進行中和試驗鑒定，或在Vero細胞上連續(xù)傳至第4代，接種后第5天出現明顯的細胞病變。

2 電子顯微鏡直接檢查雞傳染性法氏囊病病毒

取病死雞法氏囊用4%戊二醛和1%鋨酸雙固定后，再按常規(guī)乙醉系列脫水，環(huán)氧丙烷過濾，618或812樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和棕檬酸鉛染色做常規(guī)電鏡標本，電子顯微鏡下觀察，可見晶格狀排列、近似六角形、二十面體立體對稱的IBDV。

3 血清學方法

3.1 瓊脂擴散試驗(AGP) 瓊脂擴散試驗主要用于檢測血清中的抗體或抗原。取病死雞的法氏囊或肝臟，研磨制備成混懸液，與IBDV標準陽性血清進行AGP。

3.2 免疫熒光檢測技術 熒光抗體染色技術(FAT)是基于抗原抗體反應原理，將熒光染料如FITC標記到特異性抗體上，熒光抗體與病料中病毒或分離的病毒反應，通過熒光顯微鏡觀察做出判斷[1]，分為直接免疫熒光和間接免疫熒光，常用作初次診斷。

3.3 免疫電泳檢測技術 （1）對流免疫電泳技術(CIET)，是一種在免疫雙擴散的基礎上發(fā)展起來的一種加速了免疫擴散的檢測技術，其靈敏、漸變準確迅速。（2）火箭免疫電泳技術(RIEP)，是一種在電場力的作用下，使得抗原通過含有抗體的瓊脂凝膠時，與相應的抗體形成抗原抗體復合物，并在兩者比例適當部位沉淀下來的檢測技術。

4 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是將抗原或抗體吸附到固相載體上利用標記酶反應測定抗體或抗原含量的一種檢測方法，該方法敏感特異、操作簡便、易于重復，是目前最常用的一種免疫檢測方法。吳紅專等標記單抗M22制備了單抗ELISA試劑盒，大量臨床樣本的檢測表明該試劑盒檢測準確性與病毒分離鑒定結果基本一致。1981年Howie首次應用ELISA進行IBDV的檢測，此法是檢測IBDV的特異、敏感、快速和重復性好的一種方法。Marquardt等和劉源遠建立了間接ELISA定量檢測IBDV抗體。剛松堂等[2]建立了雙抗體夾心法，此法靈敏度是AGP 的200倍。黃金海等[3]建立了免疫過氧化物酶單層試驗( IPMA) 來檢測雞血清中IBDV抗體。伊嵐等[4]建立了斑點—酶聯免疫吸附試驗(Dot-EL ISA) 檢測雞血清中IBDV 抗體，檢出的陽性率為100%，具有特異性強、靈敏性高、重復性好、直觀性強等優(yōu)點，可用于IBDV母源抗體及雞群接種疫苗后特異性抗體的檢測。

5 單抗技術

Snyder等[5]最先對用單抗技術檢測IBDV抗原進行系統(tǒng)研究，證明單抗技術不僅具有常規(guī)ELISA方法的各種優(yōu)點，而且能夠利用中和單抗區(qū)分不同的血清型和亞型。日本學者Nakamura等[6]利用聚苯乙烯微球聯接單抗對IBDV抗原進行檢測，結果更敏感、快速，室溫下用玻片作凝集反應，5min便出結果，既可定性又可定量。Snyder等[7]還利用中和單抗免疫酶組化法直接檢測到組織中IBDV的抗原漂移，并鑒別出了群特異性和型特異性中和位點。另外，Mundt等[8]利用單抗技術與其它方法相結合還從IBDV感染細胞中鑒定出該病毒的一種新蛋白成分VP5。T ure等[9]也利用單抗Do t-ELISA對不同毒株IBDV抗原檢測進行了詳細研究，并指出非中和性單抗可以和IBDV的各個毒株發(fā)生反應，而中和性單抗卻不具備這一點，因此從抗原檢測的角度看，前者更優(yōu)于后者。王成明等[10]用其建立的中和單抗作雙夾心ELISA對病雞囊中IBDV的檢出率為100%。劉濱東等[10]報道，他們建立的8株針對vp2的單抗中，有4株具有良好的診斷和治療作用。陶素華等[11]報道，他們利用堿性磷酸酶-抗酶橋聯酶標顯色技術(APAAP)聯接單抗對感染細胞的IBDV進行檢測獲得滿意結果。隨后又用同位素標記單抗對來源于6個省市的7株IBDV進行了抗原表位變化的測定[12]。

6 病毒中和實驗

病毒與特異性血清作用后失活或部分失活，從而喪失或降低其對易感細胞的感染性，結合病理觀察或熒光染色技術等作出診斷。

7 分子生物學檢測技術

7.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術 PAGE技術是研究蛋白質的一種重要方法，它主要是利用蛋白質分子量的差異將不同的蛋白質在電泳介質中區(qū)分開，通過染色對目的蛋白作出鑒定。在IBD 的診斷中，此法不僅可檢出病毒特異性蛋白，而且可以區(qū)分出毒株間的差異。

7.2 蛋白質印漬(Westernblot)技術 Westernblot是將PAGE與抗體標記技術結合起來對特異性蛋白質進行檢測的一種先進方法。它不僅可能測得病毒蛋白的種類、分子量等特性，而且還可借助特異性抗體或單抗對病毒蛋白的免疫學特性進行研究。Fachey等[13]首先用此法對IBDV 的免疫原性進行了鑒定。

7.3 核酸探針技術 核酸探針技術也叫核酸雜交技術，該技術是在特異性核酸片段上標記放射性同位素或生物素制備探針，利用分子雜交技術進行檢測的一種診斷方法。是80年代發(fā)展起來的一種新的分子生物學診斷技術，90年代用于診斷IBDV。這種方法的最大優(yōu)點是特異性強，靈敏度高，尤其適用于IBDV的早期診斷。

7.4 聚合酶鏈式反應(PCR)技術 聚合酶鏈反應(PCR)具有高度靈敏、特異、快速等特點，能從僅含1個拷貝的樣品中檢出目的核酸，而且對被檢樣品預處理要求不高，因此特別適合于含毒量極少的感染組織診斷，包括早期感染的診斷。Davis等[14]最早將PCR技術應用于IBD的診斷，用PCR技術從未經純化的污染囊和糞便中直接檢出了IBDV。王永山等于1994年就正式報道了用反轉錄PCR (RT-PCR)檢測IBDV的方法，可以檢出10fg的病毒RNA。

7.5 熒光定量PCR技術 熒光定量PCR(Fluorescent quantitative PCR)，是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。此定量方法的應用基礎是Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性及雙標記熒光探針的發(fā)現，它融合了PCR及DNA探針雜交優(yōu)點，能直接檢測PCR擴增過程中信號的變化，可對核酸進行相對及絕對定量。在PCR反應早期，產生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產生進入指數期、線性期和最終的平臺期，因此可以在PCR反應處于指數期的某一點上來檢測PCR產物量，并且由此來推斷模板最初含量。目前常用的TaqMan探針法相比較SYBR Green Ⅰ染料法更為特異準確。

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