質(zhì)譜技術(shù)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

杭亞平綜述，胡龍華，王小中審校

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006)

質(zhì)譜 (mass spectrometry，MS)作為一種分析手段已出現(xiàn)幾十年，1975年質(zhì)譜技術(shù)就已初步用于細(xì)菌的快速鑒定，但直到l988年基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)、電噴霧電離(ESI)等軟電離技術(shù)的出現(xiàn)才得到進(jìn)一步快速發(fā)展。MALDI分析時(shí)激光以脈沖方式使分子電離，恰好與TOF檢測(cè)器相匹配，組成了MALDI-TOF MS，很適合微生物多種生物大分子的分析[1]。最近，在MALDI-TOF MS基礎(chǔ)上引入了全細(xì)胞質(zhì)譜(WC-MS)[2]，進(jìn)一步縮短了細(xì)菌鑒定時(shí)間(最快僅1h)，使直接對(duì)來(lái)源于血液和尿液標(biāo)本的病原菌進(jìn)行分析和鑒定成為可能，這是目前其它細(xì)菌鑒定方法所無(wú)法比擬的。

MALDI-TOF MS的基本原理是將樣品與過(guò)量的小分子基質(zhì)的混合溶液點(diǎn)加在樣品的靶盤上,用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共晶體,基質(zhì)分子吸收能量與樣品解吸附并使其電離，樣品離子在TOF電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，通過(guò)檢測(cè)飛行時(shí)間確定離子的唯一質(zhì)荷比,串聯(lián)質(zhì)譜，形成不同高度波譜峰的質(zhì)譜圖。MALDI-TOF MS技術(shù)通過(guò)微生物蛋白質(zhì)表達(dá)譜中的特征譜峰來(lái)區(qū)分細(xì)菌的屬、種、株，甚至不同亞型。最后用標(biāo)準(zhǔn)菌株或來(lái)源分型明確的菌株建立的細(xì)菌質(zhì)譜圖庫(kù)或相關(guān)軟件將檢測(cè)結(jié)果與細(xì)菌庫(kù)進(jìn)行比較。模式匹配得出分?jǐn)?shù)，分值大于2.0鑒定到種；1.7～2.0之間鑒定到屬；小于1.7鑒定結(jié)果不可信，從而得到結(jié)果[1]。

1 MALDI-TOF MS的常規(guī)應(yīng)用

快速分離鑒定病原微生物，是臨床抗感染治療成功的關(guān)鍵。目前，大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室仍然采用傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定手段，如標(biāo)本接種、分離培養(yǎng)、革蘭染色、生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗(yàn)，這些方法不但費(fèi)時(shí)，且鑒定細(xì)菌能力有限，尤其對(duì)一些難生長(zhǎng)或生長(zhǎng)慢的細(xì)菌常常不能鑒定，即使自動(dòng)化鑒定儀也常會(huì)出現(xiàn)無(wú)法鑒定的細(xì)菌。MALDI-TOF MS與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法比較優(yōu)勢(shì)顯著，可實(shí)現(xiàn)對(duì)未知微生物的快速鑒定、分型、溯源以及毒力分析等，具有操作簡(jiǎn)便、測(cè)定速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)、信息直觀、易于自動(dòng)化、檢測(cè)范圍廣以及樣品的純度要求不高等優(yōu)點(diǎn)，將微生物的鑒定時(shí)間由以小時(shí)計(jì)算推進(jìn)到分鐘計(jì)算，逐漸被臨床實(shí)驗(yàn)室所采納，MALDI-TOF MS的出現(xiàn)或許將有可能取代一直以來(lái)傳統(tǒng)的微生物鑒定流程的主導(dǎo)地位，改變現(xiàn)有的臨床微生物鑒定模式。

1.1 MALDI-TOF MS對(duì)常見(jiàn)細(xì)菌的鑒定 對(duì)臨床大多數(shù)的標(biāo)本如鼻咽分泌物、咽拭子、尿液及血液等進(jìn)行微生物過(guò)夜分離培養(yǎng)，將其菌落進(jìn)行MALDI-TOF MS，一個(gè)樣本的分析時(shí)間只需幾秒鐘，并高通量檢測(cè)，整個(gè)鑒定周轉(zhuǎn)時(shí)間顯著縮短。MALDI-TOF MS能準(zhǔn)確鑒定一大類常見(jiàn)細(xì)菌，包括革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌，如葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、腸桿菌科細(xì)菌、非發(fā)酵革蘭陰性桿菌等。

Bright[3]等人利用212種細(xì)菌建立一個(gè)較為完善的細(xì)菌質(zhì)譜圖搜索引擎與應(yīng)用軟件MUSETM(the Manchester metropolitan university search engine)，在株種屬水平上的準(zhǔn)確率分別為79%、84%和89%。近年來(lái)，張明新等[4]復(fù)蘇560株臨床分離株，應(yīng)用MALDI-TOF MS與Vitek2鑒定結(jié)果比較，G+細(xì)菌鑒定符合率為94.6%；G-細(xì)菌鑒定符合率為96.7%；酵母菌鑒定符合率為95.0%，15株鑒定結(jié)果不符的菌株經(jīng)16S rDNA測(cè)序確認(rèn)，結(jié)果與MALDI-TOF MS鑒定符合率更高。

不動(dòng)桿菌屬已經(jīng)成為院內(nèi)感染的常見(jiàn)病原菌，且鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥及多重耐藥性嚴(yán)重，不同種之間不動(dòng)桿菌感染治療措施有所不同，目前臨床上通過(guò)表型、生化反應(yīng)鑒定得到的結(jié)果實(shí)際上是鮑曼不動(dòng)桿菌群。Kishii K等[5]應(yīng)用MALDITOF MS對(duì)123株臨床分離的不動(dòng)桿菌屬進(jìn)一步鑒定，能夠確認(rèn)到種的有106株(86.2%),其準(zhǔn)確率達(dá)84.0%，而16株(13.3%)只能鑒定到屬，該研究還顯示皮氏不動(dòng)桿菌的感染率超過(guò)了鮑曼不動(dòng)桿菌達(dá)到34.1%。MALDI-TOF MS對(duì)于常規(guī)方法無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分的復(fù)合菌的鑒定是很有意義的，臨床上很多復(fù)合菌如不動(dòng)桿菌、陰溝腸桿菌等，分類廣泛、亞群復(fù)雜，MALDI-TOF MS能把復(fù)合菌內(nèi)很多微生物鑒定到物種水平。

1.2 MALDI-TOF MS對(duì)難培養(yǎng)微生物 (苛養(yǎng)菌、微需氧菌、厭氧菌等)的鑒定 難培養(yǎng)微生物的鑒定一直是臨床微生物工作者面臨最棘手的問(wèn)題。由于其生長(zhǎng)慢、生化反應(yīng)不活躍，自動(dòng)化鑒定儀及API鑒定條都很難鑒定。MALDI-TOF MS彌補(bǔ)了微需氧菌及厭氧菌等難鑒定、培養(yǎng)要求苛刻的病原體的生化鑒定方面的不足。近年來(lái)我們已利用MALDI-TOF MS實(shí)現(xiàn)了對(duì)流感嗜血桿菌[6]、幽門螺桿菌[7]及厭氧菌[8]等微生物的鑒定，大大降低了這類難培養(yǎng)微生物鑒定的漏檢率并縮短所需時(shí)間，最大限度地滿足了臨床的需求。

1.3 MALDI-TOF MS對(duì)真菌的鑒定 真菌的分類鑒定一直是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，常規(guī)形態(tài)學(xué)方法雖然直觀、簡(jiǎn)便，但樣品前處理繁瑣、培養(yǎng)周期長(zhǎng)、時(shí)效性差，無(wú)法滿足臨床快速準(zhǔn)確診斷的要求。MALDI-TOF MS可用來(lái)鑒定酵母菌、酵母樣菌、絲狀型真菌，Marklein等[9]利用MALDI-TOF MS對(duì)250株臨床分離的念珠菌進(jìn)行鑒定，96%可準(zhǔn)確鑒定，van Veen S等[2]的鑒定結(jié)果也表明對(duì)酵母樣真菌的鑒定準(zhǔn)確率達(dá)85%。目前在絲狀真菌鑒定方面的報(bào)道較少，主要原因是絲狀真菌可表現(xiàn)出完全不同的表型影響蛋白圖譜形成、蛋白提取無(wú)標(biāo)準(zhǔn)程序及目前數(shù)據(jù)庫(kù)中參考圖譜有限。最近MALDI-TOF MS在絲狀真菌鑒定方面的應(yīng)用也有進(jìn)展，譬如曲霉菌和青霉菌[10]，常規(guī)鑒定絲狀真菌還需進(jìn)一步完善數(shù)據(jù)庫(kù)和建立分析前標(biāo)準(zhǔn)程序。

1.4 MALDI-TOF MS對(duì)結(jié)核及非典型分枝桿菌的檢測(cè) 結(jié)核及非典型分枝桿菌的營(yíng)養(yǎng)要求高、生長(zhǎng)緩慢、只能通過(guò)傳統(tǒng)的抗酸染色、羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)、PCR方法進(jìn)行鑒定，費(fèi)時(shí)、成本高、操作要求高及傳染性強(qiáng)。MALDI-TOF MS可以通過(guò)快速和準(zhǔn)確地獲取其特異的蛋白質(zhì)或全菌質(zhì)譜圖[11]，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)快速準(zhǔn)確得出結(jié)果，從而為分枝桿菌的種屬鑒定提供了一種快速、簡(jiǎn)便的方法。

1.5 MALDI-TOF MS對(duì)病毒的檢測(cè) 雖然MALDI-TOF MS在病毒鑒定方面的應(yīng)用還不普遍，但MALDI-TOF MS被證實(shí)是加快病毒鑒定的一種方法。目前，大多數(shù)的研究集中在通過(guò)MALDI-TOF MS分析病毒特征，分析一些有意義的蛋白，例如衣殼蛋白[12]或病毒融合蛋白[13]。不同的病毒變異體的融合蛋白影響病毒的毒力，進(jìn)而影響與宿主細(xì)胞的結(jié)合。

1.6 MALDI-TOF MS對(duì)細(xì)菌毒力因子的鑒定 在細(xì)菌毒力研究方面，MALDI-TOF MS對(duì)殺白細(xì)胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌檢測(cè)[14]的靈敏度為100%，特異性為90.6%，能在4448Da質(zhì)荷比質(zhì)譜峰處檢測(cè)到特異峰，該方法可快速完成金黃色葡萄球菌PVL的毒力鑒定。MALDI-TOF MS在真菌毒力方面也有很好的應(yīng)用，黃曲霉產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒株的質(zhì)譜圖存在顯著的差別，根據(jù)質(zhì)譜峰的不同，產(chǎn)毒黃曲霉菌株和非產(chǎn)毒黃曲霉菌株得以鑒別[15]。

2 質(zhì)譜的臨床應(yīng)用舉例

2.1 質(zhì)譜對(duì)菌血癥的診斷 近年來(lái)，菌血癥的發(fā)病率和致死率相當(dāng)高，快速準(zhǔn)確的血流感染病原菌鑒定對(duì)于臨床抗菌藥物的合理使用和病愈率的提高顯得至關(guān)重要。2010年首次報(bào)道了MALDITOF MS直接對(duì)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶進(jìn)行鑒定的應(yīng)用，使得直接對(duì)血液標(biāo)本的病原菌鑒定有了可能。隨后Stevenson[16]進(jìn)行了類似的工作，嘗試縮短培養(yǎng)時(shí)間(4～6h)或不經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)直接從標(biāo)本中應(yīng)用MALDI-TOF MS鑒定細(xì)菌。在212例血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中鑒定出170株(80.2%)，鑒定準(zhǔn)確率為95.3%，而且這種鑒定程序已經(jīng)被研發(fā)成了商業(yè)化的Bruke SepsiTyper Kit軟件包，取得了顯著的進(jìn)展。血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本直接用于細(xì)菌鑒定的研究比較普遍[17]，但是仍需要長(zhǎng)時(shí)間儀器報(bào)警及常規(guī)分析時(shí)間。與傳統(tǒng)的血培養(yǎng)金標(biāo)準(zhǔn)需要1～3d的增菌時(shí)間和1～2d的鑒定時(shí)間的檢測(cè)技術(shù)相比，MALDI-TOF MS可以在2～3h內(nèi)對(duì)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中致病菌進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，縮短了細(xì)菌分離培養(yǎng)時(shí)間，加快了病床周轉(zhuǎn)率，為臨床合理應(yīng)用抗生素治療提供了可靠的依據(jù)，減少了患者治療費(fèi)用。MALDI-TOF MS直接微生物鑒定對(duì)于不同種類的培養(yǎng)瓶鑒定準(zhǔn)確度均較好，而且對(duì)于單一細(xì)菌陽(yáng)性培養(yǎng)瓶的鑒定能力較強(qiáng)，但是對(duì)于葡萄球菌的鑒定率較低,可能無(wú)法或會(huì)忽略對(duì)混合菌的鑒定[18]。

2.2 質(zhì)譜對(duì)尿路感染(UTIs)的診斷 UTIs是人類常見(jiàn)感染性疾病，傳統(tǒng)的尿路感染診斷主要依賴于尿液分析、尿沉渣涂片革蘭染色鏡檢和細(xì)菌培養(yǎng)，但臨床更注重的是快速準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)，現(xiàn)如今利用MALDI-TOF MS的技術(shù)優(yōu)勢(shì)可以彌補(bǔ)常規(guī)方法的不足。有研究[19]對(duì)UTIs的220份尿液標(biāo)本進(jìn)行常見(jiàn)細(xì)菌MALDI-TOF MS直接鑒定，當(dāng)細(xì)菌數(shù)量大于105CFU/ml,鑒定到屬的一致率92.7%，鑒定到種的一致率為91.8%，尤其對(duì)于大腸埃希菌，準(zhǔn)確率達(dá)97.6%。檢測(cè)時(shí)間縮短到小于30min，提示MALDI-TOF MS能快速、準(zhǔn)確地鑒定尿液標(biāo)本中的病原菌。雖然應(yīng)用MALDI-TOF MS對(duì)多微生物標(biāo)本直接鑒定只可以告知存在微生物及其豐度，剛好符合絕大多數(shù)UTIs患者臨床診斷治療中所關(guān)注的重點(diǎn)，所以從各種情況來(lái)看，MALDI-TOF MS對(duì)尿液標(biāo)本直接檢測(cè)幾乎是UTIs的配套診斷檢測(cè)方法。

2.3 質(zhì)譜在細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用 MALDI-TOF MS可通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌針對(duì)不同抗菌藥物各種獲得性酶而明確其耐藥性。革蘭陰性桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的最主要原因是產(chǎn)ESBLs酶和碳青霉烯酶。MALDI-TOF MS依據(jù)β-內(nèi)酰胺酶的水解作用、監(jiān)測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素分子量的變化可以分析細(xì)菌的耐藥性，國(guó)內(nèi)外對(duì)碳青霉烯酶的研究熱點(diǎn)集中在攜帶 KPC、VIM、IMP、NDM 及 OXA革蘭陰性菌株上[20，21]。外膜蛋白與AmpC酶聯(lián)合是導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥重要原因，國(guó)內(nèi)研究[22]將MALDI-TOF MS應(yīng)用于外膜蛋白OmpK36缺失的檢測(cè)，相較于傳統(tǒng)的SDS-PAGE技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯。革蘭陰性桿菌親緣性較強(qiáng)、抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，MALDI-TOF MS對(duì)其耐藥性檢測(cè)效果較差，但此方法對(duì)葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果較好，尤其是耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)，主要通過(guò)檢測(cè)MRSA(PBP2a)蛋白表達(dá)的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)耐藥性的分析[23]。

MALDI-TOF MS對(duì)真菌藥敏試驗(yàn)的檢測(cè)也有了長(zhǎng)足的發(fā)展?；驹硎蔷暝诓煌幬餄舛葔毫ο碌鞍捉M表達(dá)差異，最后通過(guò)MALDI-TOF MS檢測(cè)蛋白譜的變化。在此基礎(chǔ)上監(jiān)測(cè)白色念珠菌蛋白質(zhì)的改變，顯示了MALDI-TOF MS測(cè)定藥物敏感試驗(yàn)的可行性[24]。另外，MALDI-TOF MS結(jié)合PCR方法可以檢測(cè)到核苷酸突變，Ikryannikova[25]研究組在此方面貢獻(xiàn)突出，檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌blaTEM基因的突變。但總體來(lái)說(shuō)，目前MALDITOF MS對(duì)細(xì)菌耐藥機(jī)制的檢測(cè)還比較困難。

3 質(zhì)譜目前仍存在的缺陷和展望

總之，MALDI-TOF MS技術(shù)可以快速、特異地鑒定常見(jiàn)細(xì)菌，以及很好地鑒定真菌、分枝桿菌、苛養(yǎng)菌及厭氧菌，利用其強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)改變了臨床微生物實(shí)驗(yàn)室感染性疾病診斷的傳統(tǒng)格局。然而，技術(shù)的不夠完善及臨床需求的不斷提高，MALDITOF MS也有局限性。

MALDI-TOF MS難定量、最初的儀器成本高、對(duì)抗生素耐藥性和耐藥機(jī)制的檢測(cè)能力有限，無(wú)法鑒定混合菌，而且對(duì)于報(bào)告的結(jié)果缺乏統(tǒng)一的驗(yàn)證和解釋。還有MALDI-TOF MS對(duì)不常見(jiàn)病原體缺乏相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，這就要求我們必須加快完善罕見(jiàn)菌數(shù)據(jù)庫(kù)的速度來(lái)滿足臨床的要求。在日常工作中，MALDI-TOF MS靈敏度還不高，對(duì)一些進(jìn)化過(guò)程中比較接近、蛋白表達(dá)相似的細(xì)菌的辨別有較大困難。比如，無(wú)法區(qū)分志賀菌和(或)O157大腸埃希菌與普通的大腸埃希菌，以及不能鑒別肺炎鏈球菌和輕型鏈球菌/口腔鏈球菌。另外微生物在不同環(huán)境條件下蛋白表達(dá)不同，所以MALDITOF MS要常規(guī)應(yīng)用于臨床必須要進(jìn)行前處理程序的標(biāo)化和評(píng)價(jià)，保證技術(shù)的重復(fù)性，將會(huì)擴(kuò)展MALDI-TOF MS在感染性疾病診斷的實(shí)際應(yīng)用。

[1]Emont S,Shah HN,Cherkaoui A,et al.Application and use of various mass spectrometry methods in clinical microbiology[J].Clin Microbiol Infect,2010,16(11):1604-1613.

[2]van Veen SQ,Claas EC,Kuijper EJ.High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories[J].JClin Microbiol,2010,48(3):900-907.

[3]Bright JJ,Claydon MA,Soufian M,et al.Rapid typing of bacteria using matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry and pattern recognition software[J].J Microbiol Methods,2002,48(2-3):127-138.

[4]張明新,朱敏,王玫,等.應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定常見(jiàn)細(xì)菌和酵母菌[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,34(11):988-992.

[5]Kishii K,Kikuchi K,Matsuda N,et al.Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for species identification of Acinetobacter strains isolated from blood cultures[J].Clin Microbiol Infect.2013 Aug 28.doi:10.1111/1469-0691.12376.

[6]Zhu B,Xiao D,Zhang H,et al.MALDI-TOF MSdistinctly differentiates nontypable Haemophilus influenza from Haemophilus haemolyticus[J].PLoSOne,2013,8(2):e56139.

[7]Ilina EN,Borovskaya AD,Serebryakova MV,et al.Application of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for the study of Helicobacter pylori[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2010,24(3):328-334.

[8]Fournier R,Wallet F,Grandbastien B,et al.Chemical extraction versus direct smear for MALDI-TOF mass spectrometry identification of anaerobic bacteria[J].Anaerobe,2012,18(3):294-297.

[9]Marklein G,Josten M,Klanke U,et a1.Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for fast and reliable identification of clinical yeast isolates[J].J Clin Microbiol,2009,47(9):2912-29l7.

[10]Hettick JM,Green BJ,Buskirk AD,et al.Discrimination of Aspergillus isolates at the species and strain level by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting[J].Anal Biochem,2008,380(2):276-281.

[11]Wang J,Chen WF,Li QX.Rapid identification and classification of Mycobacterium spp.using whole-cell protein barcodes with matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry in comparison with multigene phylogenetic analysis[J].Anal Chim Acta,2012,716:133-137.

[12]Colquhoun DR,Schwab KJ,Cole RN,et a1.Detection of norovirus capsid protein in authentic standards and in stool extracts by matrix-assisted laser desorption ionization and nanospray mass spectrometry[J].Appl Environ Microbiol,2006,72(4):2749-2755.

[13]Parker CE,Papac Dl,Tomer KB.Monitoring cleavage of fusion proteins by matrix-assisted laser desorption ionization/mass spectrometry:recombinant HIV-1ⅢB p26[J].Anal Biochem,1996,239(1):25-34.

[14]Bittar F,Ouchenane Z,Smati F,et a1.MALDI-TOF MS for rapid detection of staphylococcal Panton-Valentine leukocidin[J].Int J Antimicrob Agents,2009,34(5):467-470.

[15]Li TY，Liu BH，Chen YC.Characterization of Aspergillus spores by matrix-assisted laser desorption/ionazation time-of-flight mass spectrometry.Rapid Commun Mass Spectrom,2000,14(24):2393-2400.

[16]Stevenson L,Drake S,Murray P.Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry[J].J Clin Microbiol,2010,48(2):444-447.

[17]羅永慧,吳昌志,舒向榮.血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本直接細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)的評(píng)價(jià)[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2013,31(5):450-451.

[18]Romero-Gomez MP,Mingorance J.The effect of the blood culture bottle type in the rate of direct identification from positive cultures by matrix-assist ed laser desorption/ionization time-of-flight(MALDI-TOF)mass spectrometry[J].JInfect,2011,62(3):251-253.

[19]Ferreira L,Sanchez-Juanes F,Gonzalez-Avila M,et a1.Direct identification of urinary tract pathogens from urine samples by matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry[J].JClin Microbiol,2010,48(6):2110-2115.

[20]Sparbier K,Schubert S,Weller U,et al.Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry-based functional assay for rapid detection of resistance againstβ-lactam antibiotics[J].JClin Microbiol,2012,50(3):927-937.

[21]Kempf M,Bakour S,Flaudrops C,et al.Rapid detection of carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii using matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry[J].PLoSOne,2012,7(2):e31676.

[22]Cai JC,Hu YY,Zhang R,et al.Detection of OmpK36 porin loss in Klebsiella spp.by matrix-Assaisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry[J].J Clin Microbiol,2012,50(6):2179-2182.

[23]Du Z,Yang R,Guo Z.Identification of Staphylococcus aureus and determination of its methicillin resistance by matrix assisted laser deserption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Anal Chem,2002,74(21):5487-5491.

[24]Marinach C,Alanio A,Palous M,et a1.MALDI-TOF MS-based drug susceptibility testing of pathogens:the example of Candida albicans and fluconazok[J].Proteomics,2009,9(20):4627-4631.

[25]Ikryannikova LN,Shitikov EA,Zhivankova EN,et al.A MALDI-TOF MS-based minisequencing method for rapid detection of TEM-type extended-spectrum beta-lactamases in clinical strains of Enterobacteriaceae[J].JMicrobiol Methods,2008,75(3):385-391.