六味地黃丸對2型糖尿病伴胰島素抵抗并發(fā)周圍神經(jīng)病變大鼠的抗氧化作用

胡明財， 何建華， 劉 劍， 秦超超， 李曉冰*

(1.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 瀘州 646000； 2.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川 瀘州 646000； 3.瀘州醫(yī)學院藥理教研室，四川 瀘州 646000)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等各種致病因子作用于機體導致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的一系列代謝紊亂綜合征。2型糖尿病是糖尿病中最常見類型，目前大量的研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病病因是復雜的遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，由于糖脂代謝紊亂造成的“葡萄糖毒性”和“脂毒性”造成機體嚴重的氧化應激損傷引發(fā)各種并發(fā)癥，其中以周圍神經(jīng)病變最常見[1-2]。六味地黃丸是治療腎陰不足的基本方，目前對六味地黃丸藥理作用研究取得了許多新的進展，發(fā)現(xiàn)其具有降血壓、降血脂、降血糖等多種藥理作用[3]。本實驗以2型糖尿病伴胰島素抵抗大鼠模型作為主要研究對象，觀察六味地黃丸是否具有抗氧化作用,以此探討六味地黃丸防治糖尿病及周圍神經(jīng)病變的可能機制及途徑。

1 材料

1.1 藥物與試劑 鏈脲佐菌(STZ)，批號為120112(美國Sigma公司)；六味地黃丸，批號120142(宛西制藥股份有限公司)；糖末寧顆粒，批號20120903(遼寧奧達制藥有限公司)；膽固醇，批號120920；膽酸鈉，批號120920(上海藍季科技發(fā)展有限公司)；SOD生化試劑盒，批號121016(南京建成生物工程研究所)；MDA生化試劑盒，批號121016(南京建成生物工程研究所)；放射免疫法胰島素分析藥盒，批號201207(由北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司)。

1.2 儀器 FA1604N電子天平,0.1 mg,上海民橋精密科學儀器有限公司生產(chǎn)。羅氏活力型血糖儀(ACCU-CHEK? Active)Ⅰ型(德國羅氏)；ACCU-CHEK?公司血糖測試條，條碼編號20110205。

1.3 動物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量130～150 g,SPF級，購自重慶滕鑫比爾實驗動物研究所，許可證號為SCXK(渝)2007-0006。

2 方法

2.1 模型的建立與分組給藥

2.1.1 2型糖尿病伴胰島素抵抗大鼠模型的建立 大鼠80只適應喂養(yǎng)7 d后，隨機分為空白對照組和造模組。對照組喂養(yǎng)普通飼料，用高脂高糖飼料飼喂造模組(2.5%膽固醇、10%豬油、20%蔗糖、1%膽酸鈉，其余66.5%為基礎飼料)飼養(yǎng)8周；8周后空腹12 h，按照劑量20 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ,臨用前配制，溶于0.1 mol/L、pH 4.2的無菌檸檬酸緩沖液)，對照組注入等容量檸檬酸緩沖液。72 h后檢測所有大鼠的空腹血糖值(Fasting blood glucose,FBG)與空腹胰島素值(fasting insulin，F(xiàn)INS)，計算每只大鼠的胰島素抵抗指數(shù)(IRI=FBG×FINS/22.5)。

2.1.2 動物的分組及給藥 造模成功的大鼠，按完全隨機原則分為2型糖尿病模型組、糖末寧對照組、六味地黃丸中劑量(LWD Middle-dose,為人體等效劑量)、六味地黃丸低劑量(LWD low-dose，1/2倍等效劑量)、六味地黃丸高劑量(LWD high-dose，2倍等效劑量)組5組,并設空白對照組，每組大鼠10只。成模大鼠穩(wěn)定一周后開始灌胃給藥。稱取大鼠體質(zhì)量并標記后按人體與大鼠體表面積比值表換算出大鼠的等效劑量[4]：(A g/70 kg)×[0.09×(X)2/3/1.722](A為臨床人體劑量，X為大鼠體質(zhì)量)。各干預組灌胃相應藥物，空白對照組及模型組灌胃等容積生理鹽水。每日1次，連續(xù)8周。

2.2 指標的測定

2.2.1 大鼠空腹血糖及空腹胰島素的測定 給藥8周后空腹12 h，稱定質(zhì)量，尾靜脈取血后羅氏血糖儀測空腹血糖?？崭挂葝u素按試劑盒說明的程序采用放免法測定。

2.2.2 大鼠血SOD活力及MDA水平的測定 按照劑量20 mg/kg腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定大鼠于手術(shù)臺上，剪開腹正中皮膚，暴露腹主動脈，采血并分離血清，檢測血總SOD、血MDA。具體操作按試劑盒說明進行。

2.2.3 大鼠坐骨神經(jīng)組織病理檢查 采血后固定大鼠并切取左腿坐骨神經(jīng)標本，組織固定采用10%甲醛，之后再常規(guī)脫水并用石蠟包埋切片，切片厚度5 μm，光學顯微鏡觀察HE染色之后的大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)及髓鞘細胞形態(tài)。

3 結(jié)果

3.1 2型糖尿病伴胰島素抵抗大鼠造模結(jié)果 各造模組大鼠空腹血糖明顯高于空白對照組(P<0.01)，各造模組大鼠與空白對照組相比，胰島素抵抗指數(shù)明顯升高，有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，見表1。

表1 造模組與空白對照組大鼠空腹血糖、胰島素及胰島素抵抗指數(shù)

3.2 藥物干預后大鼠空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)的影響 藥物干預后，六味地黃丸高劑量組和糖末寧組與模型組相比，大鼠FBG以及IRI明顯降低(P<0.01)，見表2。

表2 藥物干預后大鼠空腹血糖、胰島素及胰島素抵抗指數(shù)

3.3 藥物對大鼠血SOD及MDA的影響 模型組大鼠與空白對照組相比血總SOD明顯降低(P<0.01)。六味地黃丸高、中劑量組與模型組相比血總SOD明顯升高(P<0.01)，模型組大鼠與空白對照組相比血MDA明顯升高(P<0.01)。六味地黃丸高劑量組與模型組相比血MDA明顯降低(P<0.01)，六味地黃丸作用與糖末寧組相比無明顯差異(P>0.05)，見表3。

表3 藥物對大鼠血總SOD、血MDA作用的影響

3.4 坐骨神經(jīng)組織病理檢查 大鼠坐骨神經(jīng)組織病理觀察結(jié)果顯示：空白對照組神經(jīng)纖維形態(tài)規(guī)整，纖維密度分布較密，神經(jīng)髓鞘細胞形態(tài)正常，神經(jīng)纖維無脫髓鞘現(xiàn)象；模型組神經(jīng)纖維數(shù)量減少，纖維分布稀疏，神經(jīng)髓鞘細胞有變性腫脹、壞死缺失，髓鞘板層與神經(jīng)纖維分離現(xiàn)象顯著，有脫髓鞘現(xiàn)象。糖末寧組與六味地黃丸高劑量組神經(jīng)纖維形態(tài)較規(guī)整，多數(shù)纖維分布較密，髓鞘細胞形態(tài)基本正常，脫髓鞘現(xiàn)象較少；六味地黃丸中劑量組、低劑量組神經(jīng)纖維數(shù)量顯著減少，神經(jīng)髓鞘細胞有變性腫脹、壞死缺失嚴重，髓鞘板層與神經(jīng)纖維分離現(xiàn)象顯著，有顯著脫髓鞘現(xiàn)象。

4 討論

糖尿病是一種嚴重危害人類健康的常見慢性病，是由遺傳和環(huán)境因素互相作用引起的血糖水平增高為特征的代謝性疾病。2型糖尿病是最常見的一類，主要特點是血糖高、肥胖和胰島素抵抗[5]。本實驗采用高脂高糖飼料飼喂，再低劑量注射STZ誘導2型糖尿病大鼠模型的早期生理和生化特點與人類2型糖尿病高度相似，是研究藥物對2型糖尿病干預療效較理想的動物模型。機體在高糖、高脂等代謝異常情況下，通過酶或非酶反應系統(tǒng)導致線粒體內(nèi)糖氧化、脂肪氧化、體內(nèi)蛋白質(zhì)糖基化修飾反應、醛糖還原反應等生化反應生成大量的自由基產(chǎn)物，這些氧自由基會導致機體產(chǎn)生一系列的氧化應激反應[6]，氧化、損傷各種細胞和組織代謝分子。當SOD被氧化或者糖基化，可導致SOD活性下降，機體抗氧化能力減弱，而氧化應激產(chǎn)物如脂質(zhì)過氧化終末產(chǎn)物MDA的水平則會明顯升高[7]，導致線粒體活性氧的增加，進而激活細胞代謝的多元醇通路，增加蛋白質(zhì)的非酶糖化，啟動PKC信號傳導通路，激活己糖胺代謝途徑，這些代謝通路或信號通路的激活，能直接損傷血管內(nèi)皮細胞導致血管病變，損傷神經(jīng)髓鞘細胞引起中樞或者周圍神經(jīng)纖維脫髓鞘病變，因此氧化應激導致的線粒體內(nèi)活性氧的增加可能是包括周圍神經(jīng)病變在內(nèi)的各種糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生的始動環(huán)節(jié)[8-10]。被譽為“補陰方藥之祖”的六味地黃丸，由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、丹皮、茯苓 6味中藥組成，其治療糖尿病及糖尿病并發(fā)癥的臨床應用已有悠久的歷史。隨著人們對六味地黃丸藥理作用研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其具有一定治療糖尿病的效果。

本實驗結(jié)果表明模型組大鼠空腹血糖、胰島素抵抗指數(shù)明顯高于對照組；提示2型糖尿病大鼠伴胰島素抵抗大鼠模型復制成功,而神經(jīng)組織病理檢查結(jié)果也提示模型大鼠并發(fā)神經(jīng)病變。六味地黃丸高劑量組能降低大鼠血糖水平和減輕胰島素抵抗從而改善糖尿病癥狀。同時六味地黃丸尚可增加血液SOD活力，減少MDA的生成從而減輕機體的氧化應激損傷，保護神經(jīng)組織。因此，六味地黃丸防治糖尿病及周圍神經(jīng)病變的可能機制之一與其具有的抗氧化作用有關(guān)。

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