恒河猴H5N1禽流感病毒性肺炎模型建立及其發(fā)病機(jī)制

黎東明，賴天文，鄧少嫦，吳 東，張 鈺，陳 敏，呂瑩瑩，吳 斌

禽流感是由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的一類(lèi)人獸共患傳染性疾病或疾病綜合征。1997年，香港首次發(fā)生了高致病性禽流感(High Pathogenic Avian Influenza,HPAI)H5N1病毒直接感染人事件。至2012年，WHO公報(bào)顯示H5N1亞型AIV在全球已造成了610人感染，其中360人死亡，確診患者的死亡率大約60%[1-2]。H5N1病毒逐漸從亞洲蔓延至歐洲大部分國(guó)家以及非洲部分國(guó)家，共計(jì)56個(gè)國(guó)家和地區(qū)，近期一些研究結(jié)果表明H5N1禽流感病毒可以通過(guò)變異、重組而能在人群中傳播，從而嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康，引人關(guān)注[3]。因此，深切探討病毒的發(fā)病機(jī)制是必要的。

人感染H5N1病毒的一個(gè)主要病理特點(diǎn)是彌漫性肺泡損傷。嚴(yán)重的病毒性肺炎是高致病性H5N1病毒感染最常見(jiàn)的并發(fā)癥，也是引起死亡一個(gè)因素[4]。目前，在哺乳動(dòng)物中(如小鼠，雪貂)對(duì)病毒性肺炎進(jìn)行了大量的研究[5]，但這些結(jié)論不能直接外推至人類(lèi)。

為此，我們用H5N1 病毒感染恒河猴，建立非致死性流感病毒性肺炎模型，從臨床癥狀、病毒復(fù)制、病理變化及免疫反應(yīng)進(jìn)行全面系統(tǒng)考察，為深入了解人感染H5N1病毒的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 中國(guó)恒河猴5只，年齡2.5～3周歲，平均體重(3.4 ± 0.2)kg，由廣東省高要市康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，隨機(jī)編為1～5號(hào)。染毒前，均用ELISA方法檢測(cè)血清中H5N1禽流感病毒特異抗體均陰性，并提前進(jìn)入生物三級(jí)安全實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)飼養(yǎng)5d后飼養(yǎng)于生物安全實(shí)驗(yàn)室的負(fù)壓隔離器中。樣品處理均在生物安全柜中操作。

1.2病毒制備 A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究室惠贈(zèng)并經(jīng)中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定。經(jīng)多次在雞胚中傳代增殖，將血凝效價(jià)為1∶256的病毒液分裝，置-80℃貯存?zhèn)溆?，于?dòng)物實(shí)驗(yàn)前測(cè)TCID50為10-4.825/mL。

1.3病毒接種 實(shí)驗(yàn)前恒河猴麻醉后將體溫芯片植入其頸部后方、肩胛骨上方的背中線位置，用數(shù)據(jù)收集器掃描芯片來(lái)測(cè)量猴的體溫，觀察是否出現(xiàn)流感相關(guān)癥狀和體征，每天2次。感染前按照0.2 mL/kg氯胺酮肌肉注射麻醉恒河猴后，經(jīng)鼻向1～4號(hào)恒河猴滴入H5N1病毒液2 mL。用同樣的方法給5號(hào)恒河猴注射等量的生理鹽水，作為非感染對(duì)照組。1～5號(hào)猴分別在染毒后第1 d、3 d、6 d、14 d、1 d經(jīng)頸動(dòng)脈插管放血的方法剖殺。

1.4血液學(xué)和流感的特異抗體檢測(cè) 在感染后第0 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、10 d、12 d和14 d，用EDTA-k2抗凝管從貴要靜脈抽取2 mL外周血標(biāo)本。用細(xì)胞動(dòng)力學(xué)1200分析儀 (Abbott Laboratories,IL) 進(jìn)行外周血液分析。檢測(cè)流感病毒特異性抗體，用受體破壞酶進(jìn)行預(yù)處理(消除紅血球凝聚抑制劑)，然后用血清凝集抑制或血清中和試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

1.5病毒分離及滴定 病毒分離：取材包括氣管支氣管淋巴結(jié)、肺、心、肝，腎，大腦及小腦。取材后，標(biāo)本經(jīng)焦磷酸二乙酯(DEPC)水處理的離心管分裝，于-80 ℃保存。取定量組織2 g，加入玻璃研磨器中研磨做組織勻漿，隨后加入5倍量的滅菌生理鹽水(含200 μg/mL鏈霉素、200 U青霉素)，制成乳劑后移入滅菌試管中，以5 000 r/min (離心半徑8 cm)離心10 min，取上清液接種雞胚。參照Yoshimoto[6]的方法進(jìn)行病毒的雞胚接種擴(kuò)增和病毒血凝效價(jià)測(cè)定。

病毒滴定：將濃度為1×105個(gè)/mL的MDCK細(xì)胞加入96孔板，每孔200 μL，細(xì)胞形成單層后，用維持液稀釋病毒，按10倍遞減，從病毒材料原液至10-9，每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞對(duì)照加維持液，放入37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。倒置生物顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：正常IvlDCK細(xì)胞星多邊形，分布均勻，細(xì)胞間排列緊密：細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)表現(xiàn)為細(xì)胞收縮、變圓，聚集成團(tuán)。采用Reed-Mueneh 法[7]計(jì)算半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCID50)，表示病毒的毒力。

1.6細(xì)菌分離和致病性分析 稱(chēng)取肺組織0.1 g加入PBS緩沖液1 mL做細(xì)胞均質(zhì)。取100 μL 接種在瓊脂平板，在37 ℃有氧條件下孵化48 h后，選擇典型的菌落并在Luria-Bertani肉湯培養(yǎng)。隨后在6 w大的 BALB/c小鼠腹腔內(nèi)接種100 μL的擴(kuò)增細(xì)菌。用16S rRNA 序列鑒定細(xì)菌的種類(lèi)。

1.7病理及免疫組化 取材后，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色。按照文獻(xiàn)描述的免疫組化方法對(duì)切片行病毒抗原染色[8]。第一抗體為A型流感基質(zhì)蛋白特異性單克隆抗體 (Serotec Ltd.,Oxford,UK)，稀釋濃度為1∶100，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，陽(yáng)性細(xì)胞染色呈棕褐色。

2 結(jié) 果

2.1臨床癥狀 感染前，恒河猴狀態(tài)良好，無(wú)禽流感相關(guān)癥狀和體征。染毒后第1 d開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)熱，食欲下降，精神狀態(tài)下降，活動(dòng)度明顯減少，呼吸急促，鼻孔扇動(dòng)，張口呼吸。感染后1～3 d最為嚴(yán)重，第6 d后逐漸減輕，第14 d時(shí)恢復(fù)正常。白細(xì)胞總數(shù)在感染后第1 d達(dá)到高峰，到第6 d開(kāi)始下降，到14 d恢復(fù)正常。淋巴細(xì)胞數(shù)分別在感染后第1 d，6 d下降。5號(hào)猴未出現(xiàn)上述變化。在實(shí)驗(yàn)期間無(wú)恒河猴死亡。觀察結(jié)果表明A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1)能有效感染恒河猴并出現(xiàn)典型的臨床癥狀，感染后第14 d恢復(fù)(圖1)。

2.2禽流感病毒侵襲機(jī)體的特點(diǎn) 病毒分離及病毒滴定的結(jié)果分別見(jiàn)表1及表2。除1，2號(hào)恒河猴肺組織中分離出病毒外，其它恒河猴的肺、氣管支氣管淋巴結(jié)、心、肝、脾、腎、腦未分離出病毒。

2.3病理改變 見(jiàn)圖2。

2.4免疫組化 見(jiàn)圖3、表1。

圖1臨床癥狀及外周血白細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞變化

從恒河猴感染前1 d到感染后第14d監(jiān)測(cè)體溫和呼吸(圖A 和B)；外周血在恒河猴感染后0 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、10 d、12 d和14 d采集 (圖C和D)。不同顏色曲線代表不同的恒河猴(見(jiàn)圖A表示)。

Fig.1Changesofclinicalsymptoms,peripheralwhitebloodcellandTlymphocyte

The temperature and respiration of the rhesus from -1 day to 14 day after infection (A and B).

The changes of numbers of peripheral white blood cell and T lymphocyte after infection (C and D).

Peripheral blood was collected at 0,12 hours,1,2,3,4,6,10,12 and 14 days after infection.

Different color curves represent differents rhesus (A).

表1 感染后恒河猴組織樣品的病毒分離及免疫組化

3 討 論

本研究中成功建立了實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)恒河猴發(fā)生非致死的流感病毒肺炎的動(dòng)物模型。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)恒河猴感染H5N1病毒，表現(xiàn)為急性起病，發(fā)熱，呼吸急促，活動(dòng)度明顯減少，食欲下降。感染H5N1禽流感病毒的恒河猴在肺組織觀察到病理變化。H5N1禽流感病毒急性感染期，肺組織病理表現(xiàn)為滲出及壞死性間質(zhì)性肺炎，彌漫性肺泡損傷。免疫組織化學(xué)、病毒分離結(jié)果表明H5N1禽流感病毒只能在下呼吸道復(fù)制，提示H5N1禽流感病毒具有致命性但可能不易發(fā)生人傳染人。

表2 呼吸道組織病毒滴定(log10 EID50/mL)

Note: / not found.

圖2病理變化

A 感染后1 d，肺組織實(shí)變嚴(yán)重，大量紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)及纖維素滲出 (HE,×100)；B 感染后第3 d，病變最為嚴(yán)重，肺組織實(shí)變嚴(yán)重，可見(jiàn)大量紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞侵潤(rùn)及纖維素滲出 (HE,×100)；C 感染后第6 d，肺泡壁增厚，II型肺泡上皮增生 (HE,×400)；D 感染后第14 d，肺組織恢復(fù)期表現(xiàn)，肺泡結(jié)構(gòu)恢復(fù)，肺泡內(nèi)和間質(zhì)的炎癥滲出物已部分被吸收，無(wú)出血 (HE,×200)；E 細(xì)支氣管 上皮細(xì)胞壞死脫落，脫落至基底細(xì)胞層或基底膜，支氣管腔中有壞死脫落的上皮細(xì)胞 (HE,×400)；F心臟 心肌細(xì)胞間結(jié)締組織輕度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(HE,×200)；G腎臟 腎間質(zhì)毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，間質(zhì)水腫(HE,×400)；H脾臟淋巴小結(jié)生發(fā)中心明顯，體液免疫活躍表現(xiàn)(HE,×400)；I肝臟肝竇增寬，肝細(xì)胞腫大、嗜酸性變性、空泡變性 (HE,×400)。

Fig.2Pathologicalchange

A--The 1st day after infection,pulmonary consolidation was serious,many red blood cell,inflammatory cell and cellulose effusion were observed;

B--The 3rd day after infection,pathological changes was the most serious,many red blood cell,inflammatory cell and cellulose effusion were observed (HE,×100);

C--The 6th day after infection,there were alveolar wall thickening and type Ⅱ alveolar epithelium cell proliferation;

D--The 14th day after infection,pulmonary consolidation and alveolus structures recovered,and inflammation effusion was partly absorbed and there was no hemorrhage (HE,×200).

E--Bronchioles and epithelial cells neorobiosis and desquamate to Basal cell layer or basilar membrane,neorobiosis epithelial cells in bronchial lumen were observed (HE,×400);

F--Heart,lymphocytes infiltration in connective tissue between myocardial cell were observed (HE,×200);

G--Kidney,there was telangiectasis,hyperemia and interstitial edema in renal interstitium (HE,×400);

H--Spleen,lymphatic nodule germinal center was obvious and humoral immunity was active (HE,×400);

I--Hepatic sinusoid widened and there were hepatocyte tumefaction,acidophilia degeneration and vacuolar degeneration.

圖3免疫組化

A 5號(hào)恒河猴(對(duì)照猴)的肺組織未發(fā)現(xiàn)H5N1病毒抗原；B 1號(hào)恒河猴(感染后第1 d)肺組織H5N1病毒抗原表達(dá)陽(yáng)性(箭頭)；C 2號(hào)恒河猴(感染后第3 d)肺組織H5N1病毒抗原表達(dá)陽(yáng)性；D 3號(hào)恒河猴(感染后第6 d)肺組織H5N1病毒抗原呈局部表達(dá)；E 4號(hào)恒河猴(感染后第14 d)肺組織未發(fā)現(xiàn)H5N1病毒抗原；F 2號(hào)恒河猴肺泡Ⅱ型細(xì)胞呈陽(yáng)性染色；G 3號(hào)恒河猴肺巨噬細(xì)胞呈陽(yáng)性染色。(圖A～E 免疫組化×400；圖F～G 免疫組化×200)

Fig.3Immunohistochemisty

A--H5N1 viral antigens was not found in lung tissue of rhesus no. 5;

B--Rhesus no. 1 (1st day after infection),H5N1 viral antigens was positive;

C--Rhesus no. 2 (3rd day after infection),H5N1 viral antigens was positive;

D--Rhesus no. 3 (6th day after infection),H5N1 viral antigens was positive;

E--Rhesus no. 4 (14th day after infection) ,there was no H5N1 viral antigens in lung tissue;

F--Rhesus no. 2,type Ⅱ alveolar epithelium cell was positive staining;

G--Rhesus no. 3,macrophage was positive staining;

Figures A to E (×400); Figures F,G (×200).

1997年在香港發(fā)生H5N1病毒直接感染人事件后，許多問(wèn)題仍未清楚，尤其是那些有關(guān)為何這種病毒的致病性如此強(qiáng)。在本實(shí)驗(yàn)中，免疫組化結(jié)果表明病毒沒(méi)有在肺外器官?gòu)?fù)制，這與之前在H5N1感染獼猴模型和人類(lèi)研究中有限的可用數(shù)據(jù)一致。因此，結(jié)果提示病毒主要在恒河猴肺組織復(fù)制，未發(fā)生病毒血癥或侵染肺外組織，H5N1感染的患者出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征不一定伴有肺外器官病毒復(fù)制。然而，H5N1感染的患者是否有肺外器官病毒復(fù)制的確切證據(jù)仍然很少。

識(shí)別受感染的靶細(xì)胞，對(duì)研究病毒傳播起重要作用，但在實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物模型和人類(lèi)病例中產(chǎn)生了矛盾的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)以免疫組化的方法，發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞和II型肺泡細(xì)胞有病毒抗原的陽(yáng)性染色，而不在氣管及支氣管的纖毛上皮。結(jié)果與以往報(bào)道的H5N1病毒能在食獼猴氣管及支氣管上皮復(fù)制的結(jié)果相反[9]。 但本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)與之前對(duì)人類(lèi)病例研究的結(jié)果一致，即II型肺泡細(xì)胞是H5N1病毒復(fù)制的主要場(chǎng)所，而不是氣管及支氣管的纖毛上皮[10]。H5N1病毒在呼吸道復(fù)制的部位是決定病毒傳播的一個(gè)重要因素。通過(guò)病毒對(duì)唾液酸識(shí)別和結(jié)合活性的研究發(fā)現(xiàn)，禽流感病毒和人流感病毒分別識(shí)別唾液酸不同結(jié)構(gòu)的糖鏈作為受體，禽流感病毒優(yōu)先結(jié)合于唾液酸2-3半乳糖(α-2,3 Gal)，人流感病毒優(yōu)先結(jié)合于唾液酸2-6 半乳糖(α-2,6 Gal)，而且這種識(shí)別的特異性非常強(qiáng)[11]。Shinya等[12]報(bào)道人呼吸道組織切片從鼻腔至終末呼吸細(xì)支氣管主要表達(dá)唾液酸α-2,6-Gal受體，除鼻腔黏膜個(gè)別上皮細(xì)胞偶爾表達(dá)唾液酸α-2,3-Gal受體外，其他部位缺乏唾液酸α-2,3-Gal受體，相反，下呼吸道的呼吸細(xì)支氣管與肺泡之間連接部的非纖毛立方細(xì)胞以及肺泡細(xì)胞表達(dá)唾液酸α-2,3-Gal受體為主；同時(shí)人流感和禽流感病毒結(jié)合與感染實(shí)驗(yàn)支持上述流感病毒受體分布特點(diǎn)，表明禽流感病毒可在人下呼吸道感染、復(fù)制。

臨床資料表明[13-14]，人禽流感輕癥病例的外周血淋巴細(xì)胞無(wú)明顯降低，而嚴(yán)重病例多數(shù)出現(xiàn)血液學(xué)的改變，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞降低。本實(shí)驗(yàn)對(duì)恒河猴感染禽流感病毒后的外周血白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化分析發(fā)現(xiàn)：外周血白細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞出現(xiàn)短暫的下降，于第6 d后逐漸恢復(fù)到正常水平。淋巴細(xì)胞數(shù)與病情密切相關(guān)，外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量過(guò)低或降幅過(guò)大都提示預(yù)后不良，尤其是出現(xiàn)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行性下降時(shí)，提示病情較嚴(yán)重。

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