肖光文，汪雪濤，喬亞峰，鄒尚平，葉振東

2.臨澧縣人民醫(yī)院檢驗科，常德 415200；

3.梅州市人民醫(yī)院檢驗科，梅州 514031；

Email：270591805＠qq.com

隨著抗菌藥物使用而出現(xiàn)的細菌耐藥性問題越來越嚴重，NDM－1超級細菌[1]越來越受到醫(yī)學界的關(guān)注。鮑曼不動桿菌作為構(gòu)成超級細菌的重要細菌之一，對其耐藥問題的研究越來越被臨床所重視。亞胺培南、美羅培南等碳氫霉烯類抗菌藥物是臨床治療多重耐藥鮑曼不動桿菌感染療效最好的藥物之一。隨著該類藥物在臨床上的廣泛運用，近年來耐藥率有升高的趨勢。鑒于目前鮑曼不動桿菌的耐藥現(xiàn)狀，對梅州地區(qū)臨床分離的耐碳氫霉烯類鮑曼不動 桿 菌 （Carbapenem－resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB）的耐藥情況及耐藥機制進行研究。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 2012年1－12月從梅州地區(qū)1家三級醫(yī)院，4家二級醫(yī)院門診和住院病人的各類臨床標本中分離無重復的鮑曼不動桿菌703株，其中CRAB 210株。

1.2 質(zhì)控菌株 大腸埃希氏菌（ATCC25922），銅綠假單胞菌（ATCC27853）。

1.3 主要儀器與試劑 基因擴增儀、電泳儀為美國Bio－rad公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為法國VL公司產(chǎn)品；藥敏試驗用藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品，MH培養(yǎng)基為杭州天和公司提供。DNA分子標準、PremiX Taq酶等PCR試劑購自日本TaKaPa公司。引物設(shè)計由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列分析由北京諾賽基因組研究中心完成。

1.4 藥敏試驗 按臨床微生物學操作規(guī)程對標本進行接種培養(yǎng)后，藥敏試驗采用紙片擴散法進行，部分醫(yī)院采用自動化儀器進行。實驗結(jié)果嚴格按照2010年版美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）判斷標準執(zhí)行。

1.5 耐碳氫霉烯表型的篩選 用改良的Hodge試驗檢測碳氫霉烯酶，根據(jù)文獻[2]按照CLSI推薦方法進行。將濃度為1.5×108CFU／mL的大腸埃希菌ATCC25922按照10倍稀釋后涂布于M－H平板，中央貼上亞胺培南（10μg）藥敏紙片，接種環(huán)調(diào)取待檢菌自紙片外緣向平板邊緣劃線接種，過程中注意勿劃破平板。35。C培養(yǎng)18h，亞胺培南抑菌圈處出現(xiàn)矢狀生長現(xiàn)象的為產(chǎn)碳氫霉烯酶菌株。

1.6 用PCR法分析主要碳氫霉烯酶基因 煮沸法提取細菌DNA：將培養(yǎng)18h的待檢菌單個菌落于500μL TE buffer中，沸水浴10min，10 000r／min離心5min，取2μL上清作DNA模板。PCR擴增反應(yīng)體系為：反應(yīng)體系共50μL，其中每條引物1 μL，MgCl25μL，dNTP 4μL，Tag酶0.5μL，模板2 μL，H2O 37μL。反應(yīng)條件為：94。C預變性5min；94。C變性1min，55。C退火1min，72。C延伸1min，30個循環(huán)；72。C延伸10min。檢測不同類型的碳氫霉烯基因的反應(yīng)條件可能不同，以文獻報道為參考。所用引物見表1。PCR產(chǎn)物在含有EB為1.5%的瓊脂糖凝膠上100V恒壓電泳50min后，用凝膠成像系統(tǒng)進行觀察并拍照。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后在GenBank進行同源查詢工具分析。

表1 碳氫霉烯酶基因PCR引物序列及擴增片段長度Tab.1 Primer sequences for PCR and expected product size of carbapenemase

1.7 采用重復序列聚合酶鏈反應(yīng)（ERIC－PCR）分析同源性 引物設(shè)計為 ERIC－F，5′－3′：ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC，ERIC－R，5′ － 3′：AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。ERIC－PCR體系的組成和反應(yīng)條件：總反應(yīng)體系為50μL，dNTP 4μL，模板DNA 2μL，Tap酶0.25μL，10×緩沖液 5μL，ERIC－F 1μL，ERIC－R 1μL，H2O 36.75μL；預變性95。C5min，循環(huán)變性95。C45s，退火42。C30s，延伸72。C1min，40個循環(huán)后，72。C延伸10min。取5μL產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果并判斷同源性。

2 結(jié) 果

2.1 藥物敏感性試驗結(jié)果210株CRAB對抗菌藥物的藥敏結(jié)果見表2。

表2 210株CRAB對抗菌藥物的敏感率（%）Tab.2 Drug susceptibility rates of 210strains of CRAB（%）

2.2 碳氫霉烯酶表型篩選結(jié)果 在CRAB的210菌株中，采用改良Hodge試驗得到陽性菌株163株（77.62%），陰性菌株47株（22.38%）。在163株陽性菌株中，同時對美羅培南和亞胺培南耐藥的為158株，僅對美羅培南耐藥的為2株，僅對亞胺培南耐藥的為3株。

圖1 CRAB的改良Hodge試驗結(jié)果Fig.1 Results of modified Hodge test of CRAB

2.3 用PCR法分析主要碳氫霉烯基因結(jié)果 210個菌株中，Bla－OXA－51的檢出率為最高為94.29%（198／210），其中碳氫霉烯酶表型陽性163株菌株全部檢出Bla－OXA－51。Bla－OXA－23的檢出率次之為78.57%（165／210），其中碳氫霉烯酶表型陽性菌株有158株檢出 Bla－OXA－23，另外7株 Bla－OXA－23檢出菌株為表型陰性。Bla－VIM的檢出率為4.29%（9／210），全部為碳氫霉烯酶表型陽性。Bla－IMP、Bla－OXA－24、Bla－OXA－58均未被檢出。BLAST 分析結(jié)果顯示：Bla－OXA－23擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA測序表面序列長度為502bp，經(jīng)比對其序列符合率為99.9%；Bla－VIM擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA測序表面序列長度為756bp，經(jīng)比對其序列符合率為99.6%；Bla－OXA－51擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA測序表面序列長度為359bp，經(jīng)比對其序列符合率為99.8%。（見圖2）

圖2 部分 Bla－OXA－23、Bla－VIM、Bla－OXA－51PCR 擴增結(jié)果Fig.2 Representative PCR electropherogram of Bla－OXA－23，Bla－VIM and Bla－OXA－51

2.4 ERIC－PCR分析同源性結(jié)果 210株CRAB ERIC－PCR分型結(jié)果顯示，主要有7個型別，其中A型97株，A1型53株，A2型44株；B型44株，B1型40株，B2型20株；其他為C型6株，D型7株，E型9株，F(xiàn)型6株，H型25株。（見圖3）

圖3 部分CRAB的ERIC－PCR結(jié)果Fig.3 ERIC－PCR result of parts of the CRAB

3 討 論

近年來，隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上的廣泛運用，對其耐藥的細菌越來越多，且往往對臨床很多常用抗菌藥物也耐藥而成為泛耐藥株，鮑曼不動桿菌就是這些細菌的典型代表之一。這種耐藥往往導致臨床患者住院時間的延長而加重患者的經(jīng)濟及心理負擔，甚至嚴重的可引起患者的死亡[3]。本研究對梅州地區(qū)臨床CRAB對常規(guī)藥物的研究表明：CRAB對常規(guī)藥物除多粘菌素B外，對其他的抗菌藥物的耐藥率都在60%以上。其中對頭孢哌酮／舒巴坦和多西環(huán)素的耐藥率在60%左右外，其余14種耐藥率都超過了80%，磺胺甲噁唑甚至是100%耐藥。這比2010年中國CHINET對臨床分離的鮑曼不動桿菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)[4]明顯增高。說明鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥容易出現(xiàn)多重耐藥甚至泛耐藥。近年來，多粘菌素B治療多重耐藥，特別是對鮑曼不動桿菌取得了較好的療效，引起了臨床的關(guān)注。本研究表明多粘菌素B對CRAB敏感率達到99.52%，可以作為本地區(qū)治療CRAB的重要藥物。

目前，多重耐藥鮑曼不動桿菌主要的耐藥機制有：產(chǎn)生碳氫霉烯酶，藥物主要外排系統(tǒng)的過度表達，外膜孔蛋白的改變及與青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）的親和力下降等[5]。細菌耐藥性的產(chǎn)生往往是一種或幾種機制共同作用所致[6]，CRAB的耐藥機制尤以質(zhì)粒或染色體介導的各類碳氫霉烯酶明顯重要。本研究中，163株（77.62%）的菌株采用改良的Hodge試驗呈陽性結(jié)果，說明這些菌株可以產(chǎn)生碳氫霉烯酶。而47株（22.38%）呈現(xiàn)陰性，但基因檢測有 檢 出 Bla－OXA－51 及 Bla－OXA－23，提 示 改 良Hodge試驗檢測碳氫霉烯酶有漏檢現(xiàn)象，這可能是不同菌株產(chǎn)生碳氫霉烯酶對碳青霉烯類抗生素水解能力的差異導致出現(xiàn)的矢狀生長區(qū)域大小不同。這與雷紅等[7]報道的改良Hodge試驗（亞胺培南紙片法）陽性率為66.7%接近。

碳氫霉烯酶主要有A、B、D 3類β內(nèi)酰胺酶，其中A和D類均為絲氨酸酶，前者主要存在于腸桿菌科細菌中，鮑曼不動桿菌主要見于后者。D類β內(nèi)酰胺酶即OXA酶，可以滅活碳青霉烯類抗生素，不動桿菌中發(fā)現(xiàn)的主要有 OXA－21、OXA－23～OXA－27、OXA－40、OXA－58 等[8]，可 分 為 4 組，分 別 以O(shè)XA－23、OXA－24、OXA－51、OXA－58為代表。B類為金屬β內(nèi)酰胺酶目前檢出率低于OXA酶，但對碳氫霉烯類抗生素的水解活性是其10～1 000倍[9]，主要有IMP型、VIM 型和SIM 型，不動桿菌中發(fā)現(xiàn)的主要為IMP型和VIM型。所以本研究選取了 OXA－23、OXA－24、OXA－51、OXA－58、IMP和VIM 6個基因進行檢測。結(jié)果顯示，Bla－OXA－51檢出率最高為 94.29%，其次為 Bla－OXA－23 為78.57%，Bla－VIM 的 檢 出 率 為 4.29%，Bla－IMP、Bla－OXA－24、Bla－OXA－58均未被檢出。提示梅州地區(qū)鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥主要由OXA－51型和OXA－23型酶引起，這與國內(nèi)梁偉[2]的報道是一致的，而低于孫立穎[10]的報道。Bla－VIM的檢出率為4.29%，說明梅州地區(qū)2012年出現(xiàn)了產(chǎn)VIM型金屬β內(nèi)酰胺酶型鮑曼不動桿菌的感染，經(jīng)追查為同一家醫(yī)院的住院病人，據(jù)此我們可以推斷有可能來自同一耐藥菌株的克隆傳播。

對耐藥菌株進行基因同源性分析，從流行病學角度對有效抑制耐藥菌株的擴散具有重要的意義。本研究對210株CRAB進行ERIC－PCR分型發(fā)現(xiàn)，主要有7種基因型，流行株以A型、B型和H型為主，其他型為散發(fā)流行。A型、B型一直是臨床上比較常見的基因型[11]，在本地區(qū)各醫(yī)院都有分布。對H型的追蹤發(fā)現(xiàn)，主要出現(xiàn)在3～5月份一家醫(yī)院的ICU 科，且全部為 Bla－OXA－51、Bla－OXA－23陽性，說明該院在3～5月ICU科暴發(fā)了H型株的流行。當發(fā)暴發(fā)流行后，立即啟動了緊急措施進行了有效控制，隨后幾個月的監(jiān)測表明該次暴發(fā)得到了有效的控制。

綜上所述，梅州地區(qū)CRAB對臨床常用抗菌藥物的耐藥現(xiàn)象比較嚴重，OXA型碳氫霉烯酶是本地區(qū)耐藥的重要機制，并伴隨也克隆株的流行。所以，對本地區(qū)醫(yī)院CRAB監(jiān)測，預防其暴發(fā)流行已經(jīng)刻不容緩。

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