實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠血清S-100B蛋白變化及其臨床意義

朱德生 謝沖 李世旭 管陽太

S-100B蛋白是一種主要存在于中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的特異性蛋白，正常情況下該蛋白在細(xì)胞外液中含量很少[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)：S-100B蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育成平行關(guān)系，生理狀態(tài)下腦組織S-100B 蛋白在胚胎第14 天時有微弱的表達，成年后相對穩(wěn)定，健康成人血漿含量極低，基礎(chǔ)水平常為<0.02 μg/L[3]。當(dāng)發(fā)生中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞受損如腦脊髓炎、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)、腦卒中等疾病時，膠質(zhì)細(xì)胞的完整性受到破壞，S-100B蛋白從細(xì)胞內(nèi)大量外流至細(xì)胞外液中，如血-腦脊液屏障受損后，血液中S-100B蛋白大量增加[4-6]。國外研究結(jié)果顯示血清S-100B蛋白是顱腦損傷的血液生化標(biāo)志物[7-8]。

本實驗觀察了大鼠接受抗原乳劑免疫前及免疫后血清S-100B蛋白值的動態(tài)變化，分析了血清S-100B蛋白值與實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE )病情的相關(guān)性，旨在探討血清S-100B在中樞神經(jīng)脫髓鞘疾病中的臨床意義。

1 材料和方法

1.1實驗動物雌性Wistar大鼠10只， 6～8周齡，體重150～200 g，SPF級，購自南京君科生物工程有限公司，為無特定病原體動物，動物飼養(yǎng)于室溫(24±2)℃的環(huán)境中，維持光-暗12 h循環(huán)交替，并給以充足的食料和潔凈飲水。將實驗動物隨機分為EAE模型組與對照組，每組5只。

1.2方法

1.2.1EAE模型制備：將卡介苗加入不完全福氏佐劑中制備成完全福氏佐劑；將豚鼠新鮮脊髓加入完全福氏佐劑中，用注射器抽打至油包水狀態(tài)，制成誘導(dǎo)EAE的抗原乳劑；經(jīng)大鼠雙后肢足墊皮下注射抗原乳劑，注射劑量為0.5 mL/只；免疫當(dāng)天(即第0 h)和第48 h分別給予大鼠足背皮下注射(0.2 mL /只)百日咳桿菌(1×1010個/mL)。對照組大鼠：雙后肢足墊及足背皮下均注射等量生理鹽水。共設(shè)8個實驗觀察時間節(jié)點，即免疫前(第0天)以及免疫后第4、8、12、16、20、24、28天。免疫大鼠造模成功后常出現(xiàn)活動減少、體重減輕、尾巴無力或肢體癱瘓等癥狀，按國際通用Benson評分標(biāo)準(zhǔn)，通過評估大鼠臨床神經(jīng)功能間接反映EAE模型的成功制備。

1.2.2臨床神經(jīng)功能評分：按Benson評分標(biāo)準(zhǔn)對實驗大鼠臨床嚴(yán)重性進行評分。Benson評分標(biāo)準(zhǔn)：0 分：無任何臨床癥狀；1 分：尾部張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙；2 分：雙后肢無力，被動翻身后可以恢復(fù)；3 分：雙后肢癱瘓，被動翻身后不能恢復(fù)，但給予刺激后可以挪動；4 分：雙后肢癱瘓，前肢癱瘓或肌力減弱伴尿便失禁；5 分：瀕死狀態(tài)或死亡。癥狀介于兩者標(biāo)準(zhǔn)之間者以±0.5分計。計算各組動物評分的均值。

1.2.3血清S-100B水平檢測：采用30 g/L戊巴比妥按體重45 mg/kg腹腔麻醉大鼠，消毒尾部皮膚并取血4～5 mL，標(biāo)本于室溫靜置 2 h或 4℃過夜后離心20 min(2000～3000 r/min)，仔細(xì)收集1 mL上清即刻檢測，若未及時檢測，可將標(biāo)本放于-20℃保存，避免反復(fù)凍融，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法進行測定。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入 S-100B、生物素化的抗鼠 S-100B 抗體、HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 S-100B 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長下測定其吸光度〔D(λ)〕值，并計算樣品濃度。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距〔Md(QU)〕表示，采用Mann-WhitneyU檢驗；符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較采用成組設(shè)計重復(fù)測量方差分析，兩兩比較采用成組設(shè)計方差分析(Bonferroni法)，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗；臨床神經(jīng)功能評分與血清S-100B值的相關(guān)性采用線性相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠臨床神經(jīng)功能評分比較具體結(jié)果見表1。對照組大鼠無臨床癥狀，EAE模型組大鼠在免疫后第12～28天時出現(xiàn)活動減少、尾部或后肢無力等肢體殘疾癥狀。與對照組比較，EAE模型組于第0、4、8天時臨床神經(jīng)功能評分無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，第12、16、20、24、28天時臨床神經(jīng)功能評分增高(P<0.01)。

表 1 各組大鼠免疫后不同時間臨床評分比較 〔Md(QU)〕

表 2 實驗組與對照組大鼠血清S-100B蛋白值比較

注：與EAE模型組第0天和第4天比較，*P<0.05；與EAE模型組第8天和第16天比較，#P<0.05

2.2兩組大鼠血清S-100B蛋白變化對照組與EAE模型組間血清S-100B蛋白值總體比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=1320.291，P<0.01)。與對照組比較，EAE模型組第0天時血清S-100B蛋白水平無變化(P>0.05)，余時間點血清S-100B蛋白值增高(P<0.01)。對照組組內(nèi)各時間點之間血清S-100B蛋白值水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.442，P=0.868)，EAE模型組組內(nèi)各時間點之間血清S-100B蛋白值水平比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=121.814，P<0.01)。EAE模型組第8天血清S-100B值較第4天升高(P<0.05)，第12天時達高峰(P<0.05)，隨著EAE病程發(fā)展，第12～28天時血清S-100B水平均維持于高水平。具體結(jié)果見表2。

2.3臨床神經(jīng)功能評分與血清S-100B值的相關(guān)性臨床神經(jīng)功能評分與血清S-100B值呈正相關(guān)(r=0.959，P<0.01)。見圖1。

圖1EAE模型組臨床神經(jīng)功能評分與血清S-100B值相關(guān)性散點圖

3 討論

EAE是中樞神經(jīng)脫髓鞘疾病——MS的經(jīng)典動物模型，以中樞神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞壞死、髓鞘脫失為主要病理特征[9]。在中樞神經(jīng)脫髓鞘疾病動物模型研究中，常采用Benson評分標(biāo)準(zhǔn)對EAE大鼠進行臨床神經(jīng)功能評分，評估中樞神經(jīng)脫髓鞘病變導(dǎo)致肢體功能障礙的嚴(yán)重性。本實驗研究結(jié)果顯示，EAE模型組大鼠經(jīng)抗原乳劑免疫后第12～28天時臨床神經(jīng)功能評分較對照組增高，表明EAE模型組大鼠成功誘導(dǎo)為EAE大鼠后出現(xiàn)肢體功能障礙，并間接反映中樞神經(jīng)脫髓鞘損傷。

國外研究結(jié)果顯示，S-100B蛋白半衰期短，生物半衰期為1～2 h，通過腎臟代謝快，當(dāng)持續(xù)存在中樞神經(jīng)脫髓鞘病變時才能檢測到血清S-100B值的異常[10-11]；2013年有研究報道中樞神經(jīng)炎性反應(yīng)越嚴(yán)重，血清S-100B值會越高[12]；血清S-100B值的升高可以反映腦白質(zhì)變性疾病或因癲癇、腦外傷等因素誘發(fā)的中樞神經(jīng)脫髓鞘病變的嚴(yán)重程度[13-15]。本研究結(jié)果顯示：對照組與EAE模型組之間血清S-100B蛋白值總體比較有統(tǒng)計學(xué)差異，提示血清S-100B值增高可反映EAE大鼠中樞神經(jīng)脫髓病變；EAE模型組在第8天時即可觀察到血清S-100B值顯著升高，在第12天與第20天時血清S-100B值達最高，并持續(xù)異常至觀察的第28天，表明EAE模型組大鼠從第8天開始發(fā)生嚴(yán)重的中樞神經(jīng)脫髓鞘病變，并在12天與第20天時病變達最嚴(yán)重狀態(tài)。研究證實血清S-100B值可反映中樞神經(jīng)脫髓鞘病變的持續(xù)時間與嚴(yán)重程度，可作為監(jiān)測中樞神經(jīng)脫髓鞘病變的血液生化指標(biāo)。

國內(nèi)外研究顯示：中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生膠質(zhì)細(xì)胞損傷、血管通透性增加的早期階段即可檢測到血清S-100B蛋白值的增高[16-17]；2012年國外有報道將血清S-100B蛋白用于中樞神經(jīng)損傷性疾病的早期鑒別，同時發(fā)現(xiàn)當(dāng)于疾病早期觀察到血清S-100B值升高時則可提示其預(yù)后不良[6，18]。近年有研究顯示，只有當(dāng)中樞神經(jīng)脫髓鞘病變累積到一定程度時，肢體才會出現(xiàn)功能障礙，臨床神經(jīng)功能評分才會發(fā)生到變化[19]。本實驗研究結(jié)果顯示：與對照組比較，EAE模型組血清S-100B值在第4天時升高，而臨床評分在第12天時出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異；臨床神經(jīng)功能評分與血清S-100B值的相關(guān)性線性分析顯示兩者之間呈正相關(guān)。因此，臨床評分與血清S-100B均可反映EAE的病情變化，但血清S-100B值比臨床評分能更早地反映EAE的中樞神經(jīng)脫髓鞘病變。

綜上所述，血清S-100B 蛋白是具有潛力的血液生化標(biāo)記物，可早期反映EAE大鼠中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷、神經(jīng)髓鞘脫失的病變。血液S-100B蛋白的測定，對于探討中樞神經(jīng)脫髓鞘疾病的發(fā)病機制、病情評估及治療監(jiān)測等方面有著重要的臨床意義。

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