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    川南地區(qū)漢族人群D1S80基因座多態(tài)性分析

    2014-03-31 08:16張?zhí)斓さ?/span>
    中國醫(yī)藥科學(xué) 2014年1期

    張?zhí)斓さ?/p>

    [摘要] 目的 了解川南地區(qū)漢族人群D1S80位點(diǎn)群體遺傳多態(tài)性。方法 采用PCR結(jié)合聚丙烯酰胺PAGE電泳及高靈敏度銀染技術(shù),即Amp-FLP方法對川南地區(qū)120名漢族無血緣關(guān)系個(gè)體D1S80位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果 在所調(diào)查的120名無關(guān)個(gè)體樣本中,觀察到D1S80基因座有18個(gè)等位基因,基因頻率分布在0.004166667~0.1958333333之間,雜合度為0.7869,個(gè)體識別力為0.87,非父排除率為0.8152,其基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡法則。結(jié)論 D1S80基因座的PCR分型具有較好的準(zhǔn)確性和靈敏度,為法醫(yī)學(xué)個(gè)體識別和親權(quán)鑒定、遺傳病基因鏈鎖分析等的研究及應(yīng)用提供了川南地區(qū)有用的遺傳信息。

    [關(guān)鍵詞] D1S80位點(diǎn);VNTR;遺傳多態(tài)性;川南地區(qū)

    [中圖分類號] Q786 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616(2014)01-09-03

    人類基因組中存在許多具有高度多態(tài)性的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeat,VNTR)。D1S80是以16bp為重復(fù)單元的VNTR位點(diǎn),是進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個(gè)體識別和親權(quán)鑒定、遺傳病基因鏈鎖分析等研究的良好遺傳標(biāo)記之一[1-3]。D1S80位點(diǎn)的遺傳信息雖然在我國漢族其他地區(qū)已有報(bào)道[3-5],但是川南地區(qū)漢族人群D1S80位點(diǎn)群體遺傳資料并不清楚。現(xiàn)應(yīng)用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,Amp-Flp),即PCR結(jié)合高分辨PAGE電泳及高靈敏度銀染技術(shù)[1],首次對四川南部地區(qū)120名漢族無血緣關(guān)系個(gè)體D1S80

    1 材料與方法

    1.1 樣本收集與DNA提取

    收集川南瀘州地區(qū)漢族無關(guān)個(gè)體外周血樣本120名樣本,均于2012年6月~2013年3月在瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科收集,EDTA抗凝,用蛋白酶消化和酚/氯仿法提取DNA[6-7]。紫外分光光度計(jì)測定OD260和OD280值,并確定樣本濃度及純度[7-8]。

    1.2 主要儀器及試劑

    基因擴(kuò)增儀(德國EPP224-Eppendorf 5331型),電泳系統(tǒng)(美國BIO-RAD Powerpac Basic),凝膠圖像成像儀(美國BIO-RAD),蛋白酶K,2×Taq master mix,dNTP,丙烯酰胺。擴(kuò)增D1S80位點(diǎn)的引物序列為(DS80R: 5-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3,D1S80L: 5-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3)。

    1.3 PCR擴(kuò)增

    用20μL體系,含DNA樣本3.5μL約10ng,2μL引物,10μL的2×Taq master mix,4.5μL的ddH2O。擴(kuò)增條件為:先95℃預(yù)變性1min 30s,再94℃變性40s,65℃退火30s,72℃延伸40s,共完成35個(gè)循環(huán),然后72℃延伸5min,最后置4℃保溫。

    1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

    先用1.5%的瓊脂糖凝膠水平電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,根據(jù)條帶亮度決定下一步的垂直聚丙烯酰胺電泳中所加入的樣本量。然后,用凝膠板大小160mm×200mm×0.75mm,凝膠濃度5%,作垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳緩沖液1×TAE,150V恒壓電泳70~90min,銀染顯帶。銀染結(jié)果在凝膠圖像成像儀(BIO-RAD)上分析并照相。并將D1S80位點(diǎn)等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測序,建立分型標(biāo)準(zhǔn)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    基因頻率按照直接計(jì)數(shù)法測定,用x2檢驗(yàn)比較基因型分布資料的觀察值及理論值,判斷是否符合Hardy-Weinberg平衡,雜合度(H),個(gè)體識別力(DP)的計(jì)算參照《法醫(yī)物證學(xué)》[9],非父排除率(PE)的計(jì)算參照文獻(xiàn)[10]的方法計(jì)算。

    2 結(jié)果

    我們收集川南瀘州地區(qū)漢族無關(guān)個(gè)體外周血樣本120名,用蛋白酶消化和酚/氯仿法提取DNA,用紫外分光光度計(jì)測定OD260和OD280值,發(fā)現(xiàn)樣本DNA濃度及純度好。然后對這些無血緣關(guān)系個(gè)體完成了D1S80基因座多態(tài)性PCR和PAGE電泳分析。代表性電泳結(jié)果如下圖1所示(圖1)。

    M:DNA分子量標(biāo)記DL600(顯示400和500bp片段);

    下標(biāo)26/31為一無關(guān)個(gè)體的兩個(gè)等位基因的分型大小,其他個(gè)體的等位基因分型亦在下標(biāo)中注明

    在所調(diào)查的120名瀘州地區(qū)漢族無親緣關(guān)系個(gè)體樣本中,共觀測到D1S80基因座有18個(gè)等位基因,基因頻率分布在0.004166667~0.1958333333之間(表1),其頻率以D1S80*23(0.195833333)最高。雜合度為0.7869,個(gè)體識別力為0.87,非父排除率PE為0.8152。

    3 討論

    隨著遺傳學(xué)研究的不斷深入和人類基因組計(jì)劃的完成,人們發(fā)現(xiàn)人類基因組中存在大量具有高度多態(tài)性的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列[1-3]。其中D1S80是以16bp為重復(fù)單元的VNTR位點(diǎn),定位于染色體1p,其核心序列為GNNGACCACCGGNAAG。對這些可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列和短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)多態(tài)性分析是非常必要的。從我們對川南地區(qū)120名漢族無血緣關(guān)系個(gè)體D1S80基因座多態(tài)性進(jìn)行的研究表明,該位點(diǎn)的PCR分型具有較好的準(zhǔn)確性和靈敏度(圖1)。在所調(diào)查的120名瀘州地區(qū)漢族無親緣關(guān)系個(gè)體樣本中,共觀測到D1S80基因座有18個(gè)等位基因,基因頻率分布在0.004166667~0.1958333333之間,其頻率以D1S80*23(0.195833333)最高。雜合度為0.7869,個(gè)體識別力為0.87,非父排除率PE為0.8152。endprint

    雖然國內(nèi)有不同的學(xué)者在多個(gè)不同地區(qū)漢族、或者不同民族的無血緣關(guān)系人群中,進(jìn)行了D1S80位點(diǎn)的多態(tài)性遺傳學(xué)分析[2,4-5,11-15],但我們是首次對川南地區(qū)漢族人群的分析。在這里,我們調(diào)查了川南地區(qū)漢族人群120名漢族無血緣關(guān)系個(gè)體,對D1S80基因座的分析結(jié)果表明,該基因座多態(tài)信息含量大,雜合度、個(gè)人識別力高,排除非父的幾率高,有利于從實(shí)踐上提高本地區(qū)相關(guān)鑒定的準(zhǔn)確性和有效性。從而為法醫(yī)學(xué)個(gè)體識別和親權(quán)鑒定、遺傳病基因連鎖分析等的研究及應(yīng)用提供了對川南地區(qū)非常有用的遺傳信息,豐富了D1S80多態(tài)性信息,是對我國漢族人群D1S80遺傳信息的非常重要的補(bǔ)充。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] Budowle B,Chakraborty R,Giusti AM,et al.Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE[J].Am J Hum Genet,1991,48(1):137-144.

    [2] Yajun Deng,Bofeng Zhu,Chunmei Shen.Genetic polymorphism analysis of 15 STR loci in Chinese Hui ethnic group residing in Qinghai province of China[J].Mol Biol Rep,2011,38(4):2315-2322.

    [3] K?seler A,?ztürk O,Atalay A.Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Hb D-Los Angeles carriers[J].Mol Biol Rep,2012,39(12):10747-10750.

    [4] 馮哲,張雁征,楊穎,等.用Amp-FLP方法分析在江浙滬漢族人群DIS80位點(diǎn)多態(tài)性[J].遺傳,1996,18(4):5-18.

    [5] 謝小東,王勛陵,孫紅兵,等.甘肅漢族人群D1S80基因座多態(tài)性分析[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2000,15(2):93-94.

    [6] JJ Fu,LY Li,GX Lu.Relationship between microdeletion on Y chromosome and patients with idiopathic azoospermia and severe oligozoospermia in the Chinese[J].Chin Med J,2002,115(1):72-75.

    [7] 傅俊江.精編醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2012:61-63.

    [8] Junjiang Fu,Luquan Yang,Md.Asaduzzaman Khan,et al.Genetic characterization and authentication of Lonicera japonica Thunb.by using improved RAPD analysis[J].Mol Biol Rep,2013,40(10):5993-5999.

    [9] 侯一平.法醫(yī)物證學(xué)[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:11-23.

    [10] 賈靜濤.DNA分析中的統(tǒng)計(jì)方法[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,1995,10(3):188-191.

    [11] 楊電一,劉超,彭汝標(biāo),等.南方漢族、黎族人群15個(gè)STR基因座頻率調(diào)查[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2002,18(4):207-212.

    [12] 汪萍,朱少建,劉超,等.廣西地區(qū)3個(gè)少數(shù)民族15個(gè)STR基因座的遺傳多態(tài)性[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2003,18(5):299-300.

    [13] 張曉紅,李平,翁瑋霞,等.新疆喀什地區(qū)維吾爾族18個(gè)STR基因座的遺傳多態(tài)性[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(6):451-455.

    [14] 李海燕,臺運(yùn)春,陸惠玲,等.中國漢族人群15個(gè)STR基因座的等位基因頻率調(diào)查[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2004,19(6):330-333.

    [15] 李德林,程寶文.云南漢族D1S80位點(diǎn)基因頻率分布調(diào)查[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1997,18(3):26-29.

    (收稿日期:2013-09-06)endprint

    雖然國內(nèi)有不同的學(xué)者在多個(gè)不同地區(qū)漢族、或者不同民族的無血緣關(guān)系人群中,進(jìn)行了D1S80位點(diǎn)的多態(tài)性遺傳學(xué)分析[2,4-5,11-15],但我們是首次對川南地區(qū)漢族人群的分析。在這里,我們調(diào)查了川南地區(qū)漢族人群120名漢族無血緣關(guān)系個(gè)體,對D1S80基因座的分析結(jié)果表明,該基因座多態(tài)信息含量大,雜合度、個(gè)人識別力高,排除非父的幾率高,有利于從實(shí)踐上提高本地區(qū)相關(guān)鑒定的準(zhǔn)確性和有效性。從而為法醫(yī)學(xué)個(gè)體識別和親權(quán)鑒定、遺傳病基因連鎖分析等的研究及應(yīng)用提供了對川南地區(qū)非常有用的遺傳信息,豐富了D1S80多態(tài)性信息,是對我國漢族人群D1S80遺傳信息的非常重要的補(bǔ)充。

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    [4] 馮哲,張雁征,楊穎,等.用Amp-FLP方法分析在江浙滬漢族人群DIS80位點(diǎn)多態(tài)性[J].遺傳,1996,18(4):5-18.

    [5] 謝小東,王勛陵,孫紅兵,等.甘肅漢族人群D1S80基因座多態(tài)性分析[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2000,15(2):93-94.

    [6] JJ Fu,LY Li,GX Lu.Relationship between microdeletion on Y chromosome and patients with idiopathic azoospermia and severe oligozoospermia in the Chinese[J].Chin Med J,2002,115(1):72-75.

    [7] 傅俊江.精編醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2012:61-63.

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    [9] 侯一平.法醫(yī)物證學(xué)[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:11-23.

    [10] 賈靜濤.DNA分析中的統(tǒng)計(jì)方法[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,1995,10(3):188-191.

    [11] 楊電一,劉超,彭汝標(biāo),等.南方漢族、黎族人群15個(gè)STR基因座頻率調(diào)查[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2002,18(4):207-212.

    [12] 汪萍,朱少建,劉超,等.廣西地區(qū)3個(gè)少數(shù)民族15個(gè)STR基因座的遺傳多態(tài)性[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2003,18(5):299-300.

    [13] 張曉紅,李平,翁瑋霞,等.新疆喀什地區(qū)維吾爾族18個(gè)STR基因座的遺傳多態(tài)性[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(6):451-455.

    [14] 李海燕,臺運(yùn)春,陸惠玲,等.中國漢族人群15個(gè)STR基因座的等位基因頻率調(diào)查[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2004,19(6):330-333.

    [15] 李德林,程寶文.云南漢族D1S80位點(diǎn)基因頻率分布調(diào)查[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1997,18(3):26-29.

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    雖然國內(nèi)有不同的學(xué)者在多個(gè)不同地區(qū)漢族、或者不同民族的無血緣關(guān)系人群中,進(jìn)行了D1S80位點(diǎn)的多態(tài)性遺傳學(xué)分析[2,4-5,11-15],但我們是首次對川南地區(qū)漢族人群的分析。在這里,我們調(diào)查了川南地區(qū)漢族人群120名漢族無血緣關(guān)系個(gè)體,對D1S80基因座的分析結(jié)果表明,該基因座多態(tài)信息含量大,雜合度、個(gè)人識別力高,排除非父的幾率高,有利于從實(shí)踐上提高本地區(qū)相關(guān)鑒定的準(zhǔn)確性和有效性。從而為法醫(yī)學(xué)個(gè)體識別和親權(quán)鑒定、遺傳病基因連鎖分析等的研究及應(yīng)用提供了對川南地區(qū)非常有用的遺傳信息,豐富了D1S80多態(tài)性信息,是對我國漢族人群D1S80遺傳信息的非常重要的補(bǔ)充。

    [參考文獻(xiàn)]

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    [3] K?seler A,?ztürk O,Atalay A.Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Hb D-Los Angeles carriers[J].Mol Biol Rep,2012,39(12):10747-10750.

    [4] 馮哲,張雁征,楊穎,等.用Amp-FLP方法分析在江浙滬漢族人群DIS80位點(diǎn)多態(tài)性[J].遺傳,1996,18(4):5-18.

    [5] 謝小東,王勛陵,孫紅兵,等.甘肅漢族人群D1S80基因座多態(tài)性分析[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2000,15(2):93-94.

    [6] JJ Fu,LY Li,GX Lu.Relationship between microdeletion on Y chromosome and patients with idiopathic azoospermia and severe oligozoospermia in the Chinese[J].Chin Med J,2002,115(1):72-75.

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    [8] Junjiang Fu,Luquan Yang,Md.Asaduzzaman Khan,et al.Genetic characterization and authentication of Lonicera japonica Thunb.by using improved RAPD analysis[J].Mol Biol Rep,2013,40(10):5993-5999.

    [9] 侯一平.法醫(yī)物證學(xué)[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:11-23.

    [10] 賈靜濤.DNA分析中的統(tǒng)計(jì)方法[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,1995,10(3):188-191.

    [11] 楊電一,劉超,彭汝標(biāo),等.南方漢族、黎族人群15個(gè)STR基因座頻率調(diào)查[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2002,18(4):207-212.

    [12] 汪萍,朱少建,劉超,等.廣西地區(qū)3個(gè)少數(shù)民族15個(gè)STR基因座的遺傳多態(tài)性[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2003,18(5):299-300.

    [13] 張曉紅,李平,翁瑋霞,等.新疆喀什地區(qū)維吾爾族18個(gè)STR基因座的遺傳多態(tài)性[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(6):451-455.

    [14] 李海燕,臺運(yùn)春,陸惠玲,等.中國漢族人群15個(gè)STR基因座的等位基因頻率調(diào)查[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2004,19(6):330-333.

    [15] 李德林,程寶文.云南漢族D1S80位點(diǎn)基因頻率分布調(diào)查[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1997,18(3):26-29.

    (收稿日期:2013-09-06)endprint

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