自噬及自噬相關(guān)蛋白在帕金森病模型大鼠黑質(zhì)紋狀體中的表達(dá)及意義

劉斌 孫靜 張晉霞 毛文靜 馬原源 呂超男 成曉華 畢樹(shù)立

帕金森病(Parkinson disease, PD) 是一種常見(jiàn)的中老年神經(jīng)退行性疾病，以中腦黑質(zhì)紋狀體中多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性減少及路易小體(lewy body) 形成為主要病理特征[1]。PD的病因及發(fā)病機(jī)制目前仍未完全明了。自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過(guò)程[2]，一方面自噬的啟動(dòng)可能有助于維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)，減少繼發(fā)損傷，清除已經(jīng)被損傷的細(xì)胞器而保護(hù)神經(jīng)元，另一方面過(guò)度激活可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，稱為自噬性細(xì)胞死亡。近年來(lái)自噬及自噬溶酶體途徑在神經(jīng)變性疾病中的作用越來(lái)越受到關(guān)注[3-4]。本研究采用頸背部皮下注射魚(yú)藤酮制作PD模型，觀察自噬及自噬相關(guān)蛋白Beclin1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)在PD模型大鼠黑質(zhì)紋狀體中的表達(dá)及變化，進(jìn)一步探討自噬在PD發(fā)病中的作用。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量250～300 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司供給，合格證號(hào)SCXK(京)2013-0013。在河北聯(lián)合大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室自由進(jìn)食喂養(yǎng)，室溫控制在(23±2)℃，自然光照，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)2周。將大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和模型組，每組又分為模型制備后4、8 d兩個(gè)亞組，各亞組15只大鼠，其中6只用于免疫組織化學(xué)法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白，6只用于Western blotting法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白，3只用于透射電鏡觀察。

1.2主要試劑和儀器魚(yú)藤酮、大鼠Beclin 1抗體、大鼠LC3抗體、BCA蛋白測(cè)定試劑盒、免疫組化檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司，高速臺(tái)式離心機(jī)為上海安亭科學(xué)儀器廠制造，透射電子顯微鏡為日本HITACHI公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1PD模型制備：采用頸背部皮下注射魚(yú)藤酮制備PD大鼠模型[5]。模型組：每天給予頸背部皮下注射魚(yú)藤酮葵花油乳化液(按體質(zhì)量2.0 mg/kg)。假手術(shù)組：每天給予頸背部皮下注射葵花油(按體質(zhì)量2.0 mg/kg)。正常組：不給予任何處理。行為學(xué)評(píng)分：將大鼠行為變化分6個(gè)等級(jí)記分[6]：1分，大鼠出現(xiàn)拒捕行為減弱、豎毛、毛色變黃變臟、弓背、主動(dòng)活動(dòng)減少；2分，有1分的表現(xiàn)，且主動(dòng)活動(dòng)減少明顯，并有震顫；4分，有2分的表現(xiàn)，且步態(tài)不穩(wěn)；6分，向單側(cè)斜臥，單側(cè)前肢和/或后肢癱瘓，行走困難、進(jìn)食困難；8分，單側(cè)肢體，前肢和/或后肢完全癱瘓，四肢拘攣，體質(zhì)量大幅度減輕，不能進(jìn)食；10分，瀕死狀態(tài)或死亡。選取評(píng)分2～6分的大鼠作為PD造模成功大鼠。各組均于模型制備后4 d和8 d采取標(biāo)本。

1.3.2電鏡觀察：用10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛按體質(zhì)量0.3 mL/100 g對(duì)大鼠進(jìn)行深度麻醉，以4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛-2.5%(質(zhì)量濃度)戊二醛灌注固定，斷頭取腦，按《大鼠腦立體定位圖譜》冠狀切取腦組織(1 mm3) 數(shù)塊，放入2.5%(質(zhì)量濃度)戊二醛中固定，制成超薄切片，在透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)變化。

1.3.3Western-blotting蛋白印記法：用10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛(按體質(zhì)量0.3 mL/100 g)對(duì)大鼠進(jìn)行深度麻醉。斷頭后于冰上開(kāi)顱取腦，PBS漂洗殘余血，分離出新鮮組織置于15 mL離心管中，組織勻漿機(jī)12000 r/min(離心半徑=3 cm)勻漿15 s，加入4℃預(yù)冷的組織裂解液，振蕩混勻，4℃作用30 min，細(xì)胞懸液4℃低溫離心12000 r/min(離心半徑=3 cm)離心10 min，留取上清液4℃保存。蛋白定量后分裝，用PBS調(diào)蛋白濃度一致(750 μg/mL)，加入等體積的上樣緩沖液，沸水中煮至少5 min。等量蛋白樣品(每個(gè)泳道50 μg)經(jīng)10%(質(zhì)量濃度)SDS-PAGE電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)移緩沖液(甘氨酸5.8 g，Tris 2.9 g，SDS 0.37 g，800 mL重蒸餾水溶解后加入200 mL甲醇)。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜放入封閉液中封閉，然后加入稀釋好的一抗 (1∶1000) 4℃孵育過(guò)夜。PBS洗膜，加人相應(yīng)稀釋好的二抗(羊抗兔，1∶2000)，37℃反應(yīng)1 h，洗膜，以ECL顯色，膠片曝光顯影，采用用Image J分析Beclin1、LC3蛋白表達(dá)情況。

1.3.4免疫組織化：用10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛麻醉后暴露心臟，經(jīng)左心室快速灌注鹽水100 mL，持續(xù)灌注4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛-PBS 100 mL，斷頭取腦，固定過(guò)夜，選擇4 μm厚度連續(xù)切片，顯微鏡下觀察組織微觀結(jié)構(gòu)變化。具體操作按試劑說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。Beclin1、LC3免疫組化陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：光學(xué)顯微鏡下，胞漿呈棕黃色，核呈淺藍(lán)色或紫藍(lán)色。選擇各組大鼠黑質(zhì)不重疊的6個(gè)視野，400倍鏡下進(jìn)行Beclin1、LC3陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1電鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。正常組大鼠黑質(zhì)紋狀體中神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，核膜完整，染色質(zhì)分布均勻，核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量及結(jié)構(gòu)正常，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常，4 d、8 d組均未見(jiàn)自噬體。假手術(shù)組大鼠黑質(zhì)紋狀體中神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，偶見(jiàn)極少線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)擴(kuò)張，4 d、8 d組均未見(jiàn)自噬體。模型組4 d時(shí)，大鼠黑質(zhì)紋狀體中神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)染色質(zhì)邊集，溶酶體數(shù)量增多，線粒體腫脹、空泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，可見(jiàn)自噬小體；8 d時(shí)，自噬體、溶酶體數(shù)量顯著增多。

2.2免疫組化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2和表1。模型組大鼠黑質(zhì)紋狀體中Beclin1和LC3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較正常組和假手術(shù)組明顯增多 (均P<0.01)，假手術(shù)組大鼠黑質(zhì)紋狀體中Beclin1和LC3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)與正常組比較雖有增多趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。模型組大鼠8 d亞組Beclin1和LC3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)高于4 d亞組(均P<0.05)。

圖1透射電鏡觀察各組大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)(×20 000)

圖2各組大鼠黑質(zhì)紋狀體Beclin1和LC3陽(yáng)性細(xì)胞比較(免疫組化×400)

注：與正常組和假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組4 d亞組比較，△P<0.05

表 2 各組大鼠黑質(zhì)紋狀體Beclin1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)

注：與正常組和假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組4 d亞組比較，△P<0.01

注：括號(hào)內(nèi)為相對(duì)分子質(zhì)量

圖3各組大鼠紋黑質(zhì)狀體Beclin1蛋白Western blotting結(jié)果

注：括號(hào)內(nèi)為相對(duì)分子質(zhì)量

圖4各組大鼠紋黑質(zhì)狀體LC3Ⅱ/LC3Ⅰ Western blotting結(jié)果

2.3Westernblotting檢測(cè)模型組大鼠黑質(zhì)紋狀體中Beclin1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值較正常組和假手術(shù)組增多 (均P<0.01)，假手術(shù)組大鼠黑質(zhì)紋狀體中Beclin1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值與正常組比較雖有增多趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。 模型組8 d亞組大鼠黑質(zhì)紋狀體中Beclin1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值較4 d 亞組增加(均P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2和圖3、4。

3 討論

自噬是一種由溶酶體介導(dǎo)的降解過(guò)程，在維持細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的合成、降解平衡和細(xì)胞成分的有序再利用中發(fā)揮重要的作用[7]。在營(yíng)養(yǎng)匱乏或疾病狀態(tài)下，自噬可被激活，出現(xiàn)特征性的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，自噬體通過(guò)微管系統(tǒng)運(yùn)輸至溶酶體并融合形成自噬溶酶體，并進(jìn)行多種酶消化及降解的過(guò)程，降解產(chǎn)物釋放入胞漿并被細(xì)胞再利用[8-10]。自噬現(xiàn)象發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵是自噬體的形成，電子顯微鏡是檢測(cè)自噬體的直接方法。本研究通過(guò)在電鏡下觀察各組大鼠黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，PD模型組黑質(zhì)紋狀體中出現(xiàn)自噬體，呈圓形，大多位于細(xì)胞核旁，溶酶體數(shù)量增多，8 d時(shí)自噬體、溶酶體數(shù)量比4 d時(shí)明顯增多，表明自噬與PD的發(fā)病及發(fā)展過(guò)程有關(guān)。這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[11-12]。

Beclin-l作為自噬的重要基因之一，是調(diào)控自噬的關(guān)鍵因子[13]。Beclin-1作為自噬標(biāo)記物，已成為檢測(cè)自噬活性的重要方法。LC3是在高等真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第1種自噬體膜蛋白，是自噬的關(guān)鍵蛋白， 分為I型和Ⅱ型，在自噬發(fā)生過(guò)程中，I型LC3經(jīng)泛素樣加工修飾，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成Ⅱ型LC3并聚集到自噬體膜上[14]，其含量的多少與自噬體數(shù)量的多少呈正相關(guān)。采用Western blotting法測(cè)定LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值是一種評(píng)價(jià)自噬活性簡(jiǎn)單易行的辦法。本研究采用免疫組化法和Western blotting法檢測(cè)Beclin1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，結(jié)果均顯示PD模型組大鼠黑質(zhì)紋狀體中Beclin1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值較正常組和假手術(shù)組明顯增加；與正常組比較，假手術(shù)組大鼠黑質(zhì)紋狀體中Beclin1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值略增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組8 d亞組大鼠Beclin1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值高于4 d亞組(P<0.05)，進(jìn)一步表明自噬參與了PD的發(fā)病、發(fā)展過(guò)程。

綜上所述，PD模型大鼠黑質(zhì)紋狀體中自噬活性被激活，自噬參與了PD的發(fā)病、發(fā)展過(guò)程。PD和細(xì)胞自噬關(guān)系的研究有助于對(duì)PD分子機(jī)制的進(jìn)一步了解，為PD的治療提供新的策略。

[1]Ali SF, Binienda ZK, Imam SZ, et al. Molecular aspects of dopaminergic neurodegeneration:gene- environment interaction in parkin dysfunction[J]. Int J Environ Res Public Health, 2011, 8: 4702-4713.

[2]劉斌,唐靜,袁敏,等.血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)自噬及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3的表達(dá)[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,34:940-945.

[3]Levine B, Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease[J]. Cell, 2008, 132:27-42.

[4]Pan T, Kondo S.The role of autophagy-lysosome pathway in neurodegeneration associated with Parkinson’s disease[J]. Brain, 2008, 131 (Pt 8):1969-1978.

[5]常宇濤,羅曉光,任艷,等.魚(yú)藤酮損傷大鼠黑質(zhì)致行為學(xué)及黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷[J].解剖科學(xué)進(jìn)展,2011,17:60-62.

[6]陳忻,張楠,趙暉,等.魚(yú)藤酮致帕金森病大鼠行為學(xué)與黑質(zhì)病理?yè)p傷的關(guān)系[J].中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志,2008,34:232-234.

[7]Shpilka T,Elazar Z.Shedding light on mammalian microautophagy[J].Dev Cell,2011,20:1-2.

[8]Mizushima N,Levine B,Cuervo A M,et al.Autophagy fights disease through cellular self-digestion[J] .Nature,2008,451(7182):1069-1075.

[9]Ravikumar B,Futter M,Jahreiss L,et al.Mammalian macroautophagy at a glance[J] .J Cell Sci,2009,122(Pt 11):1707-1711.

[10]He C,Klionsky D J.Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy[J].Annu Rev Genet,2009, 43:67-93.

[11]Lynch-Day MA, Mao K, Wang K, et al.The role of autophagy in Parkinson’s disease[J].Cld Spring Harb Perspect Med,2012,2:a009357.

[12]胡曉梅,郭斌,馬莎, 等.自噬在帕金森病發(fā)生發(fā)展中的作用[J].生命科學(xué),2013,25:73-77.

[13]Sun Q, Fan W, Zhong Q.Regulation of Beclin 1 in autophagy[J].Autophagy, 2009,5:713-716.

[14]Chen Y, Azad MB, Gibson SB.Methods for detecting autophagy and determining autophagy-induced cell death[J].Can J Physiol Pharmacol,2010,88:285-295.