赤眼鱒Mx基因全長cDNA克隆及其經(jīng)GCRV攻毒后的組織表達分析

彭慧珍劉 敏劉巧林肖調(diào)義蘇建明許寶紅劉宇潔

赤眼鱒Mx基因全長cDNA克隆及其經(jīng)GCRV攻毒后的組織表達分析

彭慧珍1*劉 敏1*劉巧林1肖調(diào)義1蘇建明2許寶紅1劉宇潔1

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水生生物學(xué)實驗室, 長沙 410128; 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院, 長沙 410128)

為研究赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus)Mx蛋白(Myxovirus resistance protein)的功能, 采用簡并PCR和SMART RACE方法從赤眼鱒脾臟中克隆得到Mx基因全長cDNA, 并通過生物信息學(xué)方法分析其同源性,再利用實時熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測其在脾、肝、腸、腎等9個組織中的表達, 以及感染草魚呼腸孤病毒(Reovirus of Grass carp) GCRV-104后不同時間點赤眼鱒Mx的時空表達規(guī)律。結(jié)果表明: 赤眼鱒Mx基因cDNA序列(ScMx)全長2325 bp, 包含5′-UTR 40 bp, 3′-UTR 371 bp和ORF 1884 bp, 共編碼627個氨基酸, 其編碼的Mx蛋白分子量約為70.9 kD, 理論等電點 pI 為 8.25, 具有脊椎動物Mx蛋白共有的結(jié)構(gòu)特征; 赤眼鱒Mx與鯽魚Mx3同源性最高; Mx在赤眼鱒脾、肝、腸、腎等9個組織中均有表達, 其中肝臟中的相對表達量最高, 脾臟次之, 腸組織中的表達量最低; 經(jīng)GCRV-104病毒感染刺激后, ScMx在肝和脾組織中的表達量顯著上調(diào), 均在48h到達峰值, 分別為對照組的10倍(肝)和5倍(脾), 且在這兩個組織中的表達模式相似,均表現(xiàn)為先升高后下降的波動型變化趨勢。研究表明ScMx參與了赤眼鱒抗GCRV-104病毒的免疫反應(yīng)。

赤眼鱒; Mx基因; 全長cDNA; 組織表達

Mx蛋白(Myxovirus resistance protein)最早于1962年在近交小鼠系 A2G的研究中發(fā)現(xiàn)并命名。1988年, Meier等在大鼠中發(fā)現(xiàn)有 3個不同的分型Mx1、Mx2、Mx3[1]。隨后在人、豬、馬、牛、羊、雞、鴨、魚等其他物種中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了Mx蛋白的存在[2]。Mx蛋白是一類由干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的 GTP酶活性蛋白, 大多被認為具有廣譜抗病毒功能。對多種RNA病毒和DNA病毒有抑制作用。

魚類的Mx蛋白被認為具有部分抗病毒活性。大西洋鮭(Salmo salar) Mx1蛋白被證實對傳染性胰壞死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus genus, IPNV)有明顯的抑制作用[3]。Robertsen用抑制性消減cDNA文庫的方法發(fā)現(xiàn)出血性敗血癥病毒(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)能誘導(dǎo)分離自虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的白細胞中Mx和其他免疫球蛋白的表達[4]。但也有研究表明大西洋鮭的Mx1對貧血病毒(Infectious Salmon Anaemia Virus, ISAV) 7i 編碼的蛋白沒有抑制作用[5]。

近年來, 研究者已在多種魚類上發(fā)現(xiàn)了Mx蛋白,如草魚(Ctenopharyngodon idella)[6]、鱖(Siniperca chuasti)[7]、石斑魚(Epinephelus coioides)[8]、虹鱒[9]、斑點叉尾(Ictalurus punctatus)[10]、大西洋鮭[11]、稀有鯽(Gobiocypris rarus)[12]、鯽(Carassius auratus)[13]、尖吻鱸(Lates calcarifer)[14]等。

赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus)作為一種優(yōu)質(zhì)的淡水經(jīng)濟魚類, 在養(yǎng)殖過程中表現(xiàn)出較強的適應(yīng)性和抗病力, 但對其免疫方面的研究卻鮮有報道[15],更未見赤眼鱒 Mx基因的相關(guān)報道。本研究以赤眼鱒為研究對象, 克隆其Mx基因的cDNA全長, 并對該基因在赤眼鱒中的組織表達規(guī)律及經(jīng)草魚呼腸孤病毒(Reovirus of grass carp) GCRV-104感染刺激后赤眼鱒肝臟和脾臟組織中 ScMx的表達模式進行了探討, 為進一步研究赤眼鱒 Mx蛋白的功能和其他后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用赤眼鱒為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)基地養(yǎng)殖的1+齡魚, 體重為(90±10) g。運回實驗室后, 置于室內(nèi)水族箱中暫養(yǎng)一星期后, 挑選健康的赤眼鱒作為實驗材料。

GCRV-104由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所提供, 草魚腎臟組織細胞CIK培養(yǎng)下病毒滴度經(jīng)測定為TCID50=108.710。

1.2 方法

總RNA提取 采集的組織在液氮下研磨成粉末狀, 加入 RNAiso Plus試劑(TaKaRa)按操作說明提取組織的總 RNA。1%的瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白儀檢測總RNA的質(zhì)量和濃度。RNA樣品置于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

cDNA模板合成 用于片段擴增的cDNA模板(普通cDNA模板)按照BioTeke superRTKit (Bio-Teke)合成備用; 5′-RACE Ready cDNA和3′-RACE Ready cDNA的制備根據(jù) SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)的操作要求合成備用;熒光定量(Real-Time PCR)用 cDNA 模板使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Ta-KaRa)合成備用。

RT-PCR擴增及ScMx序列分析 所有引物均在上海生工合成(表1)。通過比對已知魚類的Mx基因序列, 找到其相對保守序列, 并根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計一對Mx片段1擴增引物MxF和MxR。再以片段1及與其同源性最高的鯽魚和稀有鯽的3′端保守區(qū)域設(shè)計兩條特異性引物3S1和3S2及一條簡并引物3R擴增出Mx基因片段2。最后基于兩段片段的拼接結(jié)果分別設(shè)計5′端特異性引物(5W和5N)和3′端特異性引物(3W和3N)用于RACE-PCR。Mx片段1和Mx片段2均用健康赤眼鱒脾臟的cDNA模板擴增。Mx片段1 PCR反應(yīng)體系如下: 10×Ex PCR buffer 2.5 μL, dNTP Mixture 2.0 μL, MxF2 (10 μmol/L) 1.0 μL, MxR2 (10 μmol/L) 1.0 μL, cDNA 2 μL, Ex Taq DNA Polymerase (5 U/μL) 0.5 μL, 加 H2O補充體積至25 μL。反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min; 94 ℃30s, 58 ℃ 40s, 72 ℃ 2min, 35個循環(huán); 72℃延伸7min。Mx片段2采用巢式PCR反應(yīng)擴增, 反應(yīng)體系如下: 10×Ex PCR buffer 2.5 μL, dNTP Mixture 2.0 μL, 3S1 (10 μmol/L) 1.0 μL, 3R (10 μmol/L) 1.0 μL, cDNA 2 μL, Ex Taq DNA Polymerase (5 U/μL) 0.5 μL, 加ddH2O補充至25 μL。第一輪反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min; 94 ℃ 30s, 55 ℃ 40s, 72 ℃ 2min, 35個循環(huán); 72℃延伸7min。第二輪PCR以第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍后取1 μL為模板, 將3S1引物替換為3S2, 其他條件同第一輪擴增。5′RACE和3′RACE擴增分別以 5′-RACE Ready cDNA和 3′-RACE Ready cDNA為模板, 實驗流程參照 SMARTTMRACE試劑盒進行。此外, 我們也進行了赤眼鱒Mx ORF序列的驗證, 以赤眼鱒脾臟cDNA為模板, 用引物ScMxORF3和ScMxORF4進行PCR, 擴增了包含ScMx ORF的cDNA序列, 產(chǎn)物測序后與拼接序列完全相同。

Real-Time PCR 表達分析 用 Real-Time PCR檢測赤眼鱒 ScMx的組織表達及經(jīng) GCRV-104病毒感染刺激后赤眼鱒肝臟和脾臟組織的免疫應(yīng)答。對于組織表達實驗, 隨機取 4條魚, 分別提取脾、肝、腸、腎、頭腎、心、腦、鰓和肌肉9個組織的總RNA并按上述步驟獲得cDNA模板; 對于GCRV-104病毒刺激實驗, 設(shè)置實驗組和對照組, 試驗時水溫為 28—30℃。實驗組每尾魚注射 0.2 mL GCRV-104病毒液, 對照組每尾魚注射等體積的PBS緩沖液。在0、6、12、24、48、72、96、120h 8個時間點分別取四條魚的肝臟和脾臟組織, 并按上述步驟制備其cDNA模板。根據(jù)ScMx的全長序列設(shè)計Real-Time PCR引物QT-MxF和QT-MxR, 并設(shè)計β-actin引物作為內(nèi)參, Real-Time PCR反應(yīng)在iCycler iQTM5熒光定量 PCR 儀上進行。根據(jù)TransStartTMTop Green qPCR SuperMix (全式金)試劑盒說明書進行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為25 μL, 包含12.5 μL的2×TransStartTMTop Green qPCR SuperMix, 0.5 μL的Passive Reference Dye Ⅲ , 1 μL模板, 0.6 μL的引物 (10 μmol/L) 和10.4 μL的滅菌雙蒸水。每個樣品設(shè)置三個重復(fù), 以蒸餾水代替模板作為陰性對照。反應(yīng)程序參照試劑盒說明書,退火溫度為61 ℃ , 用2–△△Ct法分析其相對表達值。用SAS9.2軟件對結(jié)果進行顯著性分析, P＜0.05表示差異顯著, P＜0.01表示差異極顯著。

表1 本研究中所用引物的名稱及序列Tab. 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 赤眼鱒ScMx全長cDNA序列及其分析

赤眼鱒ScMx cDNA全長為2325 bp, GenBank中的序列號為 KC249972。其中包括 40 bp的5′-UTR、1884 bp的ORF和371 bp的3′-UTR, 共編碼 627個氨基酸。在 PolyA上游 19 bp有典型的mRNA加尾信號“AATTAAA”。預(yù)測的Mx蛋白相對分子量為70.9 kD, 理論等電點為8.25, 為弱堿性蛋白。序列比對分析結(jié)果表明赤眼鱒 Mx基因編碼區(qū)中含有一個三聯(lián)體 GTP結(jié)合區(qū)域“GDQSSGKS”、“DLPG”、“TKPD”和一個發(fā)動蛋白簽名序列“LPRGTGIVTR”, 以上基序在已知物種的 Mx蛋白中普遍存在。對氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示, 赤眼鱒Mx蛋白N端包含一個發(fā)動蛋白GTP酶結(jié)合區(qū)域(Dynamin, GTPase domain, 19—265aa),發(fā)動蛋白的中央核心結(jié)構(gòu)域(Dynamin central domain)位于236—523aa, C端為發(fā)動蛋白的GTP酶效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(Dynamin, GTPase effector domain, 538—627aa)(圖1)。PSORTⅡ程序預(yù)測表明赤眼鱒Mx蛋白存在一明顯的核定位信號序列NLS(PKRR, 601— 604aa)(圖2)。

圖1 Mx編碼蛋白Smart功能域預(yù)測Fig. 1 The prediction of functional domains of Mx by Smart software

2.2 赤眼鱒ScMx蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測與系統(tǒng)進化分析

使用SWISS-MODEL在線程序?qū)Τ嘌埙VMx的氨基酸序列進行三級結(jié)構(gòu)同源建模, 參與模型構(gòu)建的氨基酸范圍為18—625aa, 參考模板為人MxA(基因登錄號為 3szrA), 目標蛋白序列與參考模板序列比對的同源性為47.783%, 且模型評估E值為0, 說明蛋白三級模型結(jié)構(gòu)可靠。用Rasmol 2.7分析軟件制作其3D結(jié)構(gòu)圖(圖3), 圖A顯示的是按蛋白質(zhì)的N端到C端氨基酸殘基依次顯示為紅、橙、 黃、綠、藍; 圖B中紅、黃、藍、白分別表示α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和其他殘基。該模型中總共包括21個α螺旋、11個 β折疊、50個轉(zhuǎn)角和 420個氫鍵。其中ScMx的509—540位點包含3個β折疊(圖3B中箭頭所示)。

將推導(dǎo)的ScMx蛋白的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列在NCBI中進行BLAST同源比對, 結(jié)果表明ScMx與鯽魚Mx3(AAP68827.1)和稀有鯽Mx(ABL61237.1)的相似性最高, 分別為 93%和90%。與其他鯉科魚類(斑馬魚和草魚)Mx相似率較高, 為 70%—88%。與其他物種的相似率在 50%—53%。采用Mega5.0的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4),從進化樹上可看出赤眼鱒 Mx與鯽 Mx3首先聚類,再依次與鯉形目的稀有鯽、草魚、斑馬魚的 Mx聚為一個分支 A。大西洋鮭、石斑魚、大菱鲆、歐洲鰻鱺等鱸形目、鯡形目其他魚類Mx聚為另外一個分支B。鳥綱的雞、鴨Mx聚為一個分支C。哺乳類動物人和老鼠Mx聚為分支D。進化樹反映的親緣關(guān)系與物種的進化地位基本一致。

2.3 赤眼鱒ScMx組織表達特征

采用RT-qPCR分析了赤眼鱒ScMx的組織表達特征, 先對ScMx和β-actin引物的擴增效率進行了檢測, 兩者擴增效率基本相同, 溶解曲線為單一峰,證明所設(shè)計引物適合 2–△△Ct法分析基因相對表達量。熒光定量PCR組織表達結(jié)果(圖5)顯示, 赤眼鱒ScMx mRNA在脾臟、肝臟、腸、腎臟、頭腎、心臟、鰓、腦和肌肉中均有表達。其中肝臟中表達量最高,脾臟中次之, 其次是心臟和鰓組織, 腸組織中最低。肝臟、脾臟、心臟和鰓組織中的相對表達量顯著高于其他組織(P＜0.05)。

圖2 ScMx cDNA全序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 Full-length cDNA of ScMx and its deduced amino acid sequence

2.4 GCRV病毒感染刺激后赤眼鱒ScMx的免疫應(yīng)答病毒GCRV-104感染刺激后0、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h(同時以注射PBS后的各時間點為對照), 熒光定量 RT-PCR檢測了赤眼鱒 ScMx在肝臟和脾臟中的相對表達量。結(jié)果(圖6)表明: 與注射 PBS緩沖液的對照組相比, 肝臟和脾臟中的ScMx的相對表達量上調(diào), 在兩個組織中的表達模式類似, 均表現(xiàn)為先上升后下降的的波動型變化趨勢,并在48h時達到峰值, 分別為對照組的10倍(肝)和5.5倍(脾)。肝和脾在攻毒后48h相對表達量均極顯著高于其他各時間點(P＜0.01)。同時, 這兩個組織在攻毒后的各個時間點的相對表達量也極顯著高于對照組(P＜0.01)。(表2)。

圖3 赤眼鱒Mx蛋白三級結(jié)構(gòu)同源模型Fig. 3 The homologous model of tertiary structure of ScMx

圖4 基于部分物種Mx蛋白氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進化樹Fig. 4 The NJ phylogenetic tree based on the amino acid sequences of Mx proteins of some species

圖5 熒光定量PCR檢測赤眼鱒ScMx mRNA組織表達Fig. 5 Expression analysis of ScMx by RT-qPCR in different tissues

3 討論

圖6 感染草魚呼腸孤病毒后赤眼鱒Mx基因的時空表達特征Fig. 6 Expression pattern of ScMx after infected by GCRV-104

表2 肝臟和脾臟在攻毒后在不同時間點以及與對照組之間的時序表達差異Tab. 2 The expression of ScMx in the liver and spleen at each time point after GCRV-104 infection

赤眼鱒屬于鯉科雅羅魚亞科赤眼鱒屬, 與同屬雅羅魚亞科的草魚外形酷似而被稱為野草魚。近年來, 赤眼鱒作為一種優(yōu)質(zhì)的淡水經(jīng)濟魚類, 被越來越多的研究者所關(guān)注[15]。本研究通過RACE技術(shù)克隆得到赤眼鱒Mx基因的全長cDNA序列, 熒光定量PCR分析其在人工感染草魚呼腸孤病毒后各組織中表達量的變化規(guī)律。序列分析表明, 由赤眼鱒 Mx cDNA推導(dǎo)的蛋白包含N端發(fā)動蛋白GTP酶結(jié)合區(qū)域、發(fā)動蛋白的中央核心結(jié)構(gòu)域和C端的發(fā)動蛋白GTP酶效應(yīng)區(qū)(GTPase effector domain, GED), 是典型的發(fā)動蛋白家族成員[16]。氨基酸同源性 Blast分析表明赤眼鱒Mx與鯽魚Mx3的相似率最高, 與其他鯉科魚類 Mx的相似率次之, 與其他物種的相似率較低。以人、小鼠、雞、鴨和部分魚類 Mx構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與同源比對的結(jié)果相類似, 鯉科魚類Mx聚為一支, 其他魚類Mx聚為另一分支, 與雞、鴨和人、鼠聚成的另外兩個分支親緣關(guān)系較遠, 其結(jié)果與物種的進化地位相一致。

在人、鼠、豬、牛等哺乳動物和雞、鴨等禽類中發(fā)現(xiàn)了Mx蛋白的不同亞型, 如人MxA和MxB, 大鼠Mx1、Mx2和Mx3, 小鼠Mx1和Mx2, 豬[17]對流感病毒和水泡性口炎病毒有活性的 Mx1 (76 kD)和無此活性的Mx2 (73 kD)等。魚類Mx蛋白也有數(shù)量不等的多種亞型: 斑馬魚(Danio rerio)[18]7種; 斑點叉尾[19]5種; 虹鱒[9]、大西洋鮭[20]、金頭鯛(Sparus aurata)[21]、橫帶石鯛(Oplegnathus fasciatus)[22]、鯽(金魚)[13]、草魚[23]分別有 3種; 大西洋大比目魚(Hippoglossus hippoglossus)[24]和 大 菱 鲆 (Scophthalmus maximus)[25]中分別發(fā)現(xiàn)了 2種; 日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)[26]、塞內(nèi)加爾鰨(Solea senegalensis)[27]、稀有鯽[28]、鱖[7]、點帶石斑魚[8]、尖吻鱸[14]等中分別只發(fā)現(xiàn)1種。本研究中僅從赤眼鱒中克隆得到一種 Mx基因, 其推導(dǎo)的氨基酸序列與鯽Mx3和稀有鯽Mx的同源性最高。在三級結(jié)構(gòu)同源建模時, Swiss-Model給出的參考序列為人MxA (3szrA), 同源性為47.783%。彭麗敏等[23]發(fā)現(xiàn)草魚的Mx1、Mx2和Mx3(CiMx1、CiMx2和CiMx3)三級結(jié)構(gòu)的區(qū)別僅在于氨基酸509-540位點: CiMx1為2個β折疊、CiMx2為1個α螺旋、CiMx3為2個α螺旋。本研究中的赤眼鱒Mx三級結(jié)構(gòu)顯示在該位點為3個β折疊(圖3B中白色箭頭所示), 與草魚的三個亞型中CiMx1的結(jié)構(gòu)最接近。赤眼鱒中是否和其他魚類一樣存在其他的Mx亞型有待進一步研究發(fā)現(xiàn)。

不同物種 Mx基因在健康個體中表達情況有所不同。肖志廣等[24]發(fā)現(xiàn)未經(jīng)干擾素誘導(dǎo)的ICR小鼠中, Mx1在脾、肺、肝、心、腎中均有表達, 在肌肉中不表達。Lee等[25]RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Mx主要在健康牙鲆中的腎、腸、腦、鰓、腹膜腔液等處表達, 而在血液白細胞、肝、肌肉和黏液中僅微量表達。彭麗敏等通過半定量 RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)草魚 Mx1、 Mx2、Mx3在健康草魚的肝胰腺、脾臟、鰾、前腸、中腸、后腸、腦、血液、皮膚等15個組織中均有表達, 其中鰓和頭腎中的表達量最高, 眼、肌肉和皮膚中的表達量較低。在本研究中, 熒光定量PCR結(jié)果顯示 Mx基因在健康赤眼鱒的肝、脾、腸、鰓、頭腎、肌肉中均有表達。其中肝和脾中表達量最高,心、鰓中次之, 腸中表達量最少。魚類Mx能經(jīng)Poly I:C、細菌和多種病毒誘導(dǎo)表達。南亞野鯪(Labeo rohita)經(jīng)Ploy I:C誘導(dǎo)后, 鰓、肝、腎、腸、心、脾、皮膚和血液中 Mx基因的表達量顯著提高。其中以肝組織中變化最明顯(為對照組的 600倍), 其次為腎(200倍)、脾(200倍)、心(180倍)、鰓(50倍)、皮膚(50倍)和血液(40倍)。腸組織中最低, 但與對照組相比有顯著地提高[26]。大黃魚(Pseudosciaena crocea)經(jīng)副溶血弧菌感染2d后頭腎和血液中Mx基因表達顯著高于對照組, 其他各時(4h、1d、4d、8d、12d、16d)與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異[27]。Bravo等[28]感染諾達病毒(Nodavirus, NV)后金頭鯛肝組織中 Mx基因的表達量增加。注射大菱鲆紅體病虹彩病毒(Turbot Reddish Body Iridovirus, TRBIV)后, 大菱鲆Mx基因在所研究的頭腎、脾臟、鰓、肌肉4個組織中均上調(diào)表達, 其組織中的最大表達量分別出現(xiàn)在感染后的第1、第4和第5天[29]。草魚經(jīng)GCRV感染后, 脾組織中Mx 12h時顯著高于對照組, 48h時急劇下降, 72h略微上升。頭腎組織中Mx 12h時顯著高于對照組, 48h和72h時急劇下降。鰓組織中12h和 24h顯著上調(diào), 并且一直持續(xù)到 72h(實驗結(jié)束)[23]。稀有鯽人工感染GCRV后鰓中Mx基因的表達在12h顯著升高, 直到感染后140h持續(xù)保持高水平表達[12]。在本實驗中, 赤眼鱒經(jīng)人工感染草魚呼腸孤病毒后, 肝和腎組織中 Mx表達量變化的趨勢一致, 整體表現(xiàn)為先升高后下降, 在 48h出現(xiàn)表達量的最高峰。這一結(jié)果與尹湘艷[30]用Poly I:C感染褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)及夏軍[29]注射TRBIV至大菱鲆活體后 Mx表達量的結(jié)果相似, 不同的是出現(xiàn)峰值的時間不同。這可能和免疫刺激源的不同及不同物種對外界免疫應(yīng)答反應(yīng)速度不一有關(guān), 具體原因有待進一步研究討論。赤眼鱒在感染GCRV后, Mx基因是上調(diào)表達的, 說明赤眼鱒 Mx可能與赤眼鱒抗病毒途徑緊密相關(guān)。這種免疫相關(guān)性與已報道研究結(jié)果是一致的[23,26—30]。而在感染后6h即迅速上調(diào)則可能預(yù)示著赤眼鱒通過Mx蛋白免疫應(yīng)答病毒刺激較其他魚類更為敏捷。以上結(jié)果表明赤眼鱒 Mx可能在赤眼鱒抗草魚呼腸孤病毒的免疫過程中發(fā)揮了重要作用。

[1] Meier E, Fah J, Grob M S, et al. A famiIy of interferon induced MX related mRNAs encodes cytoplasmic and nuclear proteins in rat cells [J]. Journal of Virology, 1988, 62: 2386—2393

[2] Xin T T, Wang H M, He H B. Advance in the antiviral research on Mx gene [J]. China Animal Husbandry and Veterinary, 2012, 39(5): 173—175 [辛婷婷, 王洪梅, 何洪彬. Mx基因的抗病毒研究進展. 中國畜牧獸醫(yī), 2012, 39(5): 173—175]

[3] Larsen R, Rkenes T P, Robertsen B. Inhibition of infectious pancreatic necrosis virus replication by Atlantic salmon Mx1 protein [J]. Journal of Virology, 2004, 78(15): 7938—7944

[4] Robertsen B. Expression of interferon and interferon-induced genes in salmonids in response to virus infection, interferon-inducing compounds and vaccination [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2008, 25(4): 351—357

[5] Mcbeath A J A, Collet B, Paley R, et al. Identification of an interferon antagonist protein encoded by segment 7 of infectious salmon anaemia virus [J]. Virus Research, 2006, 115(2): 176—184

[6] Liu L, Liu P, Jin J L, et al. Cloning and sequence analysis of antiviral Mx gene full-length cDNA from grass carp (Ctenopharyngodon indellus) and its eukaryotic expression vector construction [J]. Journal of Shanghai Ocean University, 2012, 21(4): 502—508 [劉莉, 劉鵬, 金佳麗,等. 草魚抗病毒基因Mx全長cDNA的克隆、序列分析與真核表達載體構(gòu)建. 上海海洋大學(xué)學(xué)報, 2012, 21(4): 502—508]

[7] Wu H F, Bai J J, Lao H H, et al. Cloning and sequencing of the full-length cDNA of Mx protein from Mandarinfish [J]. Virologica Sinica, 2004, 19(3): 271—275 [吳海峰, 白俊杰,勞海華, 等. 鱖魚Mx蛋白全長cDNA的克隆和序列分析.中國病毒學(xué), 2004, 19(3): 271—275]

[8] Chen Y M, Su Y L, Lin J H, et al. Cloning of an orange-spotted grouper (Epinephelus coioides) Mx cDNA and characterisation of its expression in response to nodavirus [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2006, 20(1): 58—71

[9] Trobridge G D, Chiou P P, Leong J A. Cloning of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) Mx2 and Mx3 cDNAs and characterization of trout Mx protein expression in salmon cells [J]. Journal of Virology, 1997, 71(7): 5304—5311

[10] Plant K P, Thune R L. Cloning and characterisation of a channel catfish (Ictalurus punctatus) Mx gene [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2004, 16(3): 391—405

[11] Robertsen B, Trobridge G, Leong J A. Molecular cloning of double-stranded RNA inducible Mx genes from atlantic salmon [J]. Developmental & Comparative Immunology, 1997, 21(5): 397—412

[12] Sun J G, Zhu Z Y, Wang Y P. Up-regulating expressions of toll-like receptor 3 and Mx genes in gills by grass carp reovirus in rare minnow, Gobiocypris rarus [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2008, 32(5): 728—734 [蘇建國, 朱作言, 汪亞平. 草魚呼腸孤病毒上調(diào)稀有鯽鰓中 TLR3和Mx基因的表達. 水生生物學(xué)報, 2008, 32(5): 728—734]

[13] Zhang Y, Zhang Q, Xu D, et al. Identification of antiviral-relevant genes in the cultured fish cells induced by UV-inactivated virus [J]. Chinese Science Bulletin, 2003, 48(6): 581—588

[14] Wu Y C, Chi S C. Cloning and analysis of antiviral activity of a barramundi (Lates calcarifer) Mx gene [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2007, 23(1): 97—108

[15] Liu Q L, Xiao T Y, Liu M, et al. Research progress of Squaliobarbus curriculus biology [J]. Fisheries Science, 2012, 31(11): 687—691 [劉巧林, 肖調(diào)義, 劉敏, 等. 赤眼鱒生物學(xué)研究進展. 水產(chǎn)科學(xué), 2012, 31(11): 687—691]

[16] Peng L M. Molecule cloning and expression features of Mx genes in grass carp, Ctenopharyngodon idella [D]. Thesis for Master of Science. Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling, 2012 [彭麗敏. 草魚Mx基因的克隆及表達特征的研究. 碩士學(xué)位論文, 西北農(nóng)林科技大學(xué), 楊陵, 2012]

[17] Yuan S K, Wang J Y, Xie H F, et al. Advance in candidate genes of porcine disease resistance [J]. Chinese Journal of Animal Science, 2007, 43(15): 50—52 [袁樹楷, 王金勇, 謝和芳, 等. 豬抗病育種候選基因研究進展. 中國畜牧雜志, 2007, 43(15): 50—52]

[18] Altmann S M, Mellon M T, Distel D L, et al. Molecular and functional analysis of an interferon gene from the zebrafish, Danio rerio [J]. Journal of Virology, 2003, 77(3): 1992—2002

[19] Plant K P, Thune R L. Genomic organisation of the channel catfish Mx1 gene and characterisation of multiple channel catfish Mx gene promoters [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2008, 24(5): 575—583

[20] Robertsen B, Trobridge G, Leong J A. Molecular cloning of double-stranded RNA inducible Mx genes from Atlantic salmon (Salmo salar L.) [J]. Developmental & Comparative Immunology, 1997, 21(5): 397—412

[21] Fernandez-Trujillo M A, Novel P, Manchado M, et al. Three Mx genes with differential response to VNNV infection have been identified in Gilthead seabream (Sparus aurata) [J]. Molecular Immunology, 2011, 48(9—10): 1216—1223

[22] Zenke K, Kim K H. Molecular cloning and expression analysis of three Mx isoforms of rock bream, Oplegnathus fasciatus [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2009, 26(4): 599—605

[23] Peng L, Yang C, Su J. Protective roles of grass carp (Ctenopharyngodon idella) Mx isoforms against grass carp reovirus [J]. PLoS One, 2012, 7(12): e52142

[24] Xiao Z G, Liu X M, Wang L, et al. Cloning and tissue expression of Mx1 gene in ICR Mouse [J]. Progress in Veterinary Medicine, 2011, 32(4): 23—28 [肖志廣, 劉曉敏,王麗, 等. ICR小鼠Mx1基因的克隆及組織表達. 動物醫(yī)學(xué)進展, 2011, 32(4): 23—28]

[25] Lee J Y, Hirono I, Aoki T. Cloning and analysis of expression of Mx cDNA in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus [J]. Developmental & Comparative Immunology, 2000, 24(4): 407—415

[26] Samanta M, Ba M, Swain B, et al. Molecular cloning and characterization of toll-like receptor 3, and inductive expression analysis of type I IFN, Mx and pro-inflammatory cytokines in the Indian carp, rohu (Labeo rohita) [J]. Molecular Biology Reports, 2013, 40(1): 225—235

[27] Xie F J. Cloning and analysis of disease-resistance genes from large yellow croaker [D]. Thesis for Master of Science. Jimei University, Xiamen, 2007 [謝芳靖. 大黃魚抗病功能基因的克隆與分析. 碩士學(xué)位論文. 集美大學(xué), 廈門, 2007]

[28] Bravo J, Real F, Padilla D, et al. Effect of lipopolysaccharides from Vibrio alginolyticus on the Mx gene expression and virus recovery from gilthead sea bream (Sparus aurata L.) experimentally infected with Nodavirus [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2013, 34(1): 383—386

[29] Xia J. Molecular cloning and expression analysis of IRF-3 and IRF-7 in turbot, Scophthalmus maximus [D]. Thesis for Master of Science, China Ocean University, Qingdao, 2011 [夏軍. 大菱鲆干擾素調(diào)節(jié)因子 3(IRF-3)和干擾素調(diào)節(jié)因子 7(IRF-7)基因克隆與表達分析. 碩士學(xué)位論文, 中國海洋大學(xué), 青島, 2011]

[30] Yin X Y. Molecular cloning and expression analysis of IRF-3 and IRF-7 in Japanese Flounder, Paralichthys olivaceus [D]. Thesis for Master of Science. China Ocean University, Qingdao, 2010 [尹湘艷. 褐牙鲆干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)和干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF-7)的全長 cDNA克隆與表達分析. 碩士學(xué)位論文. 中國海洋大學(xué), 青島, 2010]

MOLECULAR CLONING AND TISSUE EXPRESSION ANALYSIS OF Mx GENE IN SQUALIOBARBUS CURRICULUS

PENG Hui-Zhen1, LIU Min1, LIU Qiao-Lin1, XIAO Tiao-Yi1, SUN Jian-Ming2, XU Bao-Hong1and LIU Yu-Jie1
(1. Laboratory of Hydrobiology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. College of animal veterinary and medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Mx protein, a GTP-enzyme active protein induced by interferon, exhibits broad-spectrum antiviral activity. As member of economically fresh water fish with superior quality, Squaliobarbus curriculus has the highest fitness and disease resistance; however, studies on its immunity are limited. In the current study, we amplified a full-length cDNA of Mx (ScMx) from the spleen by using degenerate PCR and SMART RACE, and conducted homology analysis and tissue expression analysis of ScMx mRNA in different tissues including liver, spleen, intestine, gill, kidney, head kidney, heart, brain and muscle. Furthermore, we investigated the temporal expression levels of ScMx in the liver and spleen after GCRV-104 infection. The results indicated that the full-length of ScMx gene was 2325 bp consisted of 40 bp 5′-UTR, 371 bp 3′-UTR and 1884 bp ORF encoding 627 amino acids. The theoretical molecular weight and isoelectric point (PI) of ScMx were 70.9 kD and 8.25, respectively. ScMx shared the most homology with Carassius aruatus Mx3. ScMx was broadly expressed in all tested tissues. After infected with GCRV-104, the ScMx expression levels in the liver and spleen showed a tendency of fluctuation: the relative expression of ScMx increased reached the peak at 48h after the viral infection, and then decreased. The infection significantly induced the expression of ScMx (P＜0.05). These results suggested that ScMx may play an important role in the immune response of Squaliobarbus curriculus against GCRV-104 infection.

Squaliobarbus curriculus; Mx gene; Full-length cDNA; Tissue expression analysis

Q344+.1

A

1000-3207(2014)06-0993-09

10.7541/2014.147

2013-01-14;

2014-04-12

國家科技支撐計劃(2011AA011404); 國家自然科學(xué)基金面上項目(31272652)資助

彭慧珍(1981—), 女, 湖南長沙人; 博士; 主要研究方向為水生動物健康養(yǎng)殖。E-mail: phz2011cn@163.com劉敏(1988—), 女, 湖南常德人; 碩士; E-mail: 283141785@qq.com *共同第一作者

肖調(diào)義, 主要研究方向為水生動物遺傳育種。E-mail: tyxiao1128@163.com