一種Guyenotia放射孢子蟲的形態(tài)和分子序列特征

孫海偉 習(xí)丙文 謝 駿,

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院, 無錫 210095; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無錫 214081)

放射孢子蟲(Actinospore)是黏體動(dòng)物(Myxozoan)生活史中寄生在環(huán)節(jié)動(dòng)物(Anneild)宿主體內(nèi)的重要階段。自Stolc[1]在顫蚓(寡毛類)中首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道放射孢子蟲以來, 在很長一段時(shí)間內(nèi)放射孢子蟲一直被認(rèn)為是與黏孢子蟲 (Myxospore) 親緣關(guān)系很近的獨(dú)立生物類群, 并隸屬于黏體動(dòng)物門(Myxozoa)放射孢子蟲綱(Actinosporea);同時(shí), 由于該類群未曾發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)或社會影響, 相關(guān)的報(bào)道和研究非常稀少。然而, 1984年, Wolf 和Markiw[2]對有關(guān)虹鱒“旋轉(zhuǎn)病”(Whirling disease, WD)病原腦黏體蟲(Myxobolus cerebralis)生活史的開創(chuàng)性研究, 發(fā)現(xiàn)了腦黏體蟲生活史存在魚和寡毛類(Tubifex tubifex)兩個(gè)替換宿主(Alternative host), 放射孢子蟲只是黏體動(dòng)物在寡毛類宿主體內(nèi)的一個(gè)生活階段。此后, 有關(guān)放射孢子蟲的研究日益增多和受到廣泛關(guān)注。在系統(tǒng)分類上, Kent等[3]建議將此前的射孢子蟲綱和黏孢子蟲綱合并, 放射孢子蟲綱作為黏孢子蟲綱的同物異名而禁制使用, 但建議保留了原放射孢子蟲綱 17個(gè)屬的名稱, 將其看作集合類群(Collective group)用以描述和劃分具有相似形態(tài)特征的放射孢子蟲。在魚類寄生蟲病害方面, 對發(fā)病水體放射孢子蟲的調(diào)查和鑒定成為掌握黏孢子蟲病感染、傳播的重要研究內(nèi)容[4]。目前, 來自匈牙利、美國、日本等國家的學(xué)者已開展了大量有關(guān)黏孢子蟲病發(fā)生地區(qū)放射孢子蟲區(qū)系調(diào)查, 報(bào)道了約 200余種類型的放射孢子蟲[4—6], 通過傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室感染方法鑒定出40余種魚體寄生黏孢子蟲所對應(yīng)的寡毛類寄生放射孢子蟲[6]。

黏孢子蟲是我國養(yǎng)殖魚類和野生魚類資源重要的寄生蟲病原, 已報(bào)道種類約600余種[7]。其中一些種類對我國魚類養(yǎng)殖造成非常嚴(yán)重的危害, 如引起鯉魚腸道巨囊病的吉陶單極蟲(Thelohanellus kitauei), 大量寄生在錦鯉鰓絲引起死亡的野鯉碘泡蟲(Myxobolus koi), 引起草魚腸道糜爛的餅形碘泡蟲(Myxobolus artus), 寄生在鯽魚咽部和肝臟引起大量死亡的洪湖碘泡蟲(Myxobolus honghuensis)和吳李碘泡蟲(Myxobolus wulii)等。然而, 我國黏孢子蟲病的研究大多致力于種類分類、組織病理和流行病學(xué)和藥物防治[8—10]。有關(guān)黏孢子蟲的感染、傳播、個(gè)體發(fā)生、生活史等缺乏詳細(xì)的研究, 特別是在黏孢子蟲的放射孢子階段的研究報(bào)道屈指可數(shù)。在2000年, 王桂堂和姚衛(wèi)建[11]在國內(nèi)首次報(bào)道了一種三突放射孢子蟲(Triactinomyxon)。此后, 翟艷花等[12,13]分別報(bào)道了2種放射孢子蟲(Triactinomyxon和Raabeia); Xi等[14]報(bào)道了在池塘黏孢子蟲調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)的3種放射孢子蟲(Raabeia, Aurantiactinomyxon和Guyenotia)。

在江蘇地區(qū)黏孢子蟲病高發(fā)池塘放射孢子蟲的區(qū)系調(diào)查過程中, 作者發(fā)現(xiàn)了多種放射孢子蟲。本文描述一種Guyenotia 類型放射孢子蟲形態(tài)特征, 并通過 18S rDNA序列克隆和比對發(fā)現(xiàn)該Guyenotia放射孢子蟲可能為一種魚體寄生楚克拉蟲在蘇氏尾鰓蚓寄生發(fā)育階段所對應(yīng)的放射孢子蟲。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2013年 5月中旬, 在江蘇常州地區(qū)一多年鯽魚養(yǎng)殖塘口, 用采泥器取塘底淤泥, 40目鋼篩篩除淤泥, 收集水蚯蚓。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

水蚯蚓的培養(yǎng) 將收集到的水蚯蚓帶回實(shí)驗(yàn)室, 將水蚯蚓分別轉(zhuǎn)移到稱量瓶中, 每個(gè)稱量瓶(50 mm×30 mm)中3—5條, 并加入約4 mL曝氣自來水, 室溫培養(yǎng)。

水蚯蚓 18S rDNA PCR擴(kuò)增 實(shí)驗(yàn)所用的提取DNA試劑盒為QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN)。切取水蚯蚓尾部一小段放入滅過菌的1.5 mL的離心管中, 按照說明書的步驟依次進(jìn)行提取基因組 DNA。水蚯蚓 18S rDNA PCR擴(kuò)增所用引物為ERIB1 (ACCTGGTTGATCCT GCCAG)和 ERIB10 (CCTCCGCAGGTTCACCTACGG)[15]。PCR反應(yīng)條件為: 94℃ 預(yù)變性5min, 94℃變性30s, 52℃退火30s, 72℃延伸60s, 循環(huán)30次, 最后72℃末端加尾7min。

放射孢子蟲的收集 每天在顯微鏡下觀察水體中是否有水蚯蚓釋放的放射孢子蟲, 一旦檢測到有放射孢子蟲, 將該組水蚯蚓進(jìn)一步單個(gè)培養(yǎng)在稱量瓶中, 以確定釋放放射孢子蟲的蚯蚓個(gè)體。在顯微鏡下觀察和記錄,并開始收集有放射孢子蟲的水樣, 直到蚯蚓不再釋放放射孢子蟲為止, 每次收集到的水樣裝入 50 mL的離心管中, 放到–80℃的冰箱中保存起來。

放射孢子蟲形態(tài)特征測量 在光學(xué)顯微鏡下觀察該放射孢子蟲的形態(tài), 并用圖森TAC-9.0C顯微攝像進(jìn)行拍照; 用顯微鏡測微尺對放射孢子蟲進(jìn)行測量。

放射孢子蟲18S rDNA PCR擴(kuò)增 將保存在–80℃的樣品取出融化后, 5000 r/min離心10min富集放射孢子蟲?；蚪M提取同樣嚴(yán)格按QIAamp DNA Micro Kit 試劑盒說明, 在加 Buffer AL 的時(shí)候提前加入 carrier RNA 1 ng。提取的基因組除一部分用于18S rDNA PCR 擴(kuò)增,其余部分放–20℃冰箱保存。放射孢子蟲18S rDNA采用巢氏PCR 方法擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)所用外引物為ERIB1和ERIB10;內(nèi)引物為 Myxosp-F(TTCTGCCCTATCAACTW GTTG)和Myxosp-R(GGTTTCNCDGRGGGMCCAAC)[16]。PCR 反應(yīng)條件: 第一輪擴(kuò)增94℃ 預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 48℃退火45s, 72℃延伸90s, 循環(huán)30次; 72℃末端加尾7min;第二輪擴(kuò)增 94℃ 預(yù)變性 5min; 94℃變性 30s, 52℃退火30s, 72℃延伸60s, 循環(huán)30次; 72℃末端加尾7min。第一輪PCR時(shí), 所加的模板量為10 μL, 第二輪PCR時(shí)所加模板量為 3 μL。

PCR 反應(yīng)液的配制 10×PCR buffer (Mg2+) 5 μL;dNTP Mixture 4 μL; 正向引物(20 μm) 2 μL; 反向引物(20 μm)2 μL; Takara Ex Taq (5 U/μL) 0.5 μL; 補(bǔ)滅菌水至 50 μL。

序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳回收, 送上海生物工程有限公司測序。獲得的18S rDNA 的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST檢索同源性序列。序列多重比對使用Clustal X軟件[17], 序列間的一致性分析使用MEGA 4.0 軟件[18]。為了分析放射孢子集合類群與黏孢子蟲類群間是否存在對應(yīng)關(guān)系, 通過檢索GenBank中登錄的放射孢子蟲序列, 并Blast比對和下載相似性最高的黏孢子蟲序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)發(fā)育分析在 MEGA4.0[18]軟件中采用最小進(jìn)化法(Minimum Evolution)、最大似然法(Maximum Likelihood),分支置信度用Bootstrap自展檢驗(yàn)1000次。

2 結(jié)果

2.1 水蚯蚓的鑒定

在調(diào)查中采集到的水蚯蚓在蟲體后部具有絲狀的鰓。這一形態(tài)特征是環(huán)節(jié)動(dòng)物寡毛類尾鰓蚓典型特征。PCR擴(kuò)增獲得水蚯蚓18S rDNA 序列片段長度為1803 bp。序列比對分析表明該水蚯蚓與 GenBank 中的蘇氏尾鰓蚓(Branchiura sowerbyi)(DQ459985)的序列一致性最高(99.8%)。因此可以鑒定該水蚯蚓為蘇氏尾鰓蚓。

2.2 放射孢子蟲鑒定

放射孢子蟲的檢測 通過連續(xù) 2周的顯微鏡檢查, 在采集到的400條水蚯蚓中僅檢查到1條釋放出本文報(bào)道的放射孢子蟲, 感染率為0.25%。蘇氏尾鰓蚓每天釋放放射孢子蟲的高峰出現(xiàn)在下午。

放射孢子蟲的形態(tài)特征 檢查到的放射孢子蟲呈Guyenotia集合類群的典型特征。孢體呈球形, 無孢柄, 極囊呈三個(gè)點(diǎn)狀緊簇的位于胞體頂部, 三個(gè)尾柄呈指狀且末端較鈍, 尾柄核近尾柄末端。孢體長 10.7 μm (10.0—12.1); 極囊 1.8 μm (1.7—2.0); 尾柄長 20.5 μm (17.4—23.8), 寬5.8 μm (4.8—6.3)。為了便于區(qū)別該類群其他放射孢子蟲, 作者根據(jù)目前慣例將其命名為 Guyenotia type CZ (圖 1、圖 2)。

表1 本文描述放射孢子蟲與文獻(xiàn)報(bào)道中相似放射孢子蟲的形態(tài)學(xué)比較Tab. 1 Comparison of measurements of the newly identified and the known Guyenotia types reported in scientific literatures

圖1 Guyenotia type CZ放射孢子蟲的整體形態(tài)(標(biāo)尺=10 μm)Fig. 1 Morphology of the Guyenotia type (Scale bar = 10 μm)

圖2 Guyenotia type CZ放射孢子蟲的側(cè)面觀(標(biāo)尺=10 μm)Fig. 2 Lateral view of the Guyenotia type (Scale bar = 10 μm)

18S rDNA 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR擴(kuò)增獲得的放射孢子蟲18S rDNA 序列為935 bp(GenBank 登錄號為 KF912153)。NCBI中 BLAST比對分析顯示本報(bào)道的 Guyenotia放射孢子蟲 18S rDNA 序列與兩極科(Myxidiidae)的楚克拉屬(Zschokkella)和兩極蟲屬(Myxidium)的孢子蟲, 以及球孢科(Sphaerosporidae)的Sphaerospora sp.(AY735411)具有較高遺傳相似性。其中,Guyenotia type CZ2013與GenBank中的Zschokkella sp.(DQ118776)、Sphaerospora sp. (Eszterbauer, et al.[22]AY735411)和放射孢子蟲 Guyenotia (Eszterbauer, et al.[21]AY779063)的序列一致性最高, 分別為 98.2%、98.1%、97.7%。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中(圖 3), 本文報(bào)道的 Guyenotia type CZ 與 Zschokkella sp. (DQ118776)、Guyenotia (AY779063)穩(wěn)定的聚為一個(gè)分支。

3 討論

自 Wolf 和 Markiw[2]首次證實(shí)放射孢子蟲是黏孢子蟲一個(gè)早期形態(tài)階段后, 這個(gè)發(fā)現(xiàn)已經(jīng)被大家所認(rèn)可,并陸續(xù)被研究者報(bào)道; 到目前為止報(bào)道的放射孢子蟲有200多種(17個(gè)組合群)。在放射孢子蟲類群的鑒定中, 孢體的形狀、孢柄的有無、尾柄在胞體后發(fā)生位置和尾柄形狀都是非常重要的鑒定特征。本文描述的放射孢子蟲(圖1、圖 2)孢子體呈球形, 極囊呈三個(gè)點(diǎn)狀緊簇的位于胞體頂部, 尾柄呈三個(gè)指狀且末端較鈍, 尾柄核近尾柄末端,這些形態(tài)特征為Guyenotia類群的典型特征, 因此將該放射孢子蟲劃歸為該集合類群。通過形態(tài)特征比較, 本文報(bào)道的放射孢子蟲與文獻(xiàn)中已報(bào)道Guyenotia類群的放射孢子蟲同時(shí)存在以下形態(tài)差異: (1)寄生宿主不同, 表1中所報(bào)道的放射孢子蟲的宿主多為正顫蚓、夾雜帶絲蚓這 2種寡毛類動(dòng)物, 而本文報(bào)道的放射孢子蟲的宿主為蘇氏尾鰓蚓。(2)形態(tài)大小有差異, 如表1中 Eszterbauer等[20]所報(bào)道的 Guyenotia 類型放射孢子蟲的尾突長度為15—21 μm, 寬度為 3.5—5.5 μm, 孢子體長度為 9.5—12 μm,極囊為1.3—2 μm; Xiao等[19]所報(bào)道的Guyenotia 類型放射孢子蟲的尾突長度為21 μm寬度為4.5—6.4 μm, 孢子體長度為9.5 μm, 極囊為3 μm。從這些數(shù)據(jù)上可以看出與本文所描述的放射孢子蟲有差別。(3)本文報(bào)道的放射孢子蟲的極囊占孢子體的比例與 Eszterbauer等[21]報(bào)道的Guyenotia類型的放射孢子蟲的差異明顯, 后者的極囊/孢子體要小于本文報(bào)道的, 雖然整體形狀都?xì)w為同一類群,但是極囊占孢子體的位置也有很大的區(qū)別, 比如后者極囊排列緊密。本文報(bào)道的放射孢子蟲與 Xi等[14]報(bào)道的Guyenotia放射孢子蟲在形態(tài)、個(gè)體大小和宿主非常相似,可能為同一種放射孢子蟲。然而, 由于放射孢子蟲的形態(tài)特征非常簡單, 僅僅依據(jù)形態(tài)很難做出準(zhǔn)確的鑒定[20]。此外, Xi等[14]報(bào)道的 Guyenotia放射孢子蟲由于沒有提供DNA序列, 本文也無法通過分子序列對其進(jìn)行比較分析。

作者在比較GenBank中Sphaerospora sp. (AY735411)(采集自鯽魚腎小管), 和 Zschokkela sp. (DQ118776)(采集自鯽魚膽管)的序列時(shí)發(fā)現(xiàn)這2個(gè)來自不同黏孢蟲科的孢子蟲18S rDNA序列完全一致。在Fiala[23]構(gòu)建的黏孢子蟲 18S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹中(見文章中 Fig. 5),Sphaerospora sp. (AY735411)單個(gè)聚類在整個(gè)兩極科大分支中。因此, 作者傾向于認(rèn)為 Eszterbauer 和 Szekely[22]在GenBank中登錄的Sphaerospora sp. 序列(AY735411)可能由于采樣過程樣品污染, 或組織同時(shí)感染有 2種黏孢子蟲導(dǎo)致出現(xiàn)的錯(cuò)誤; Zschokkella sp. (DQ118776)的鑒定和DNA測序結(jié)果應(yīng)該是正確的。Eszterbauer等[21]在運(yùn)用18S rDNA 序列鑒定放射孢子蟲Guyenotia (AY779063)時(shí)也注意到該放射孢子蟲與Sphaerospora sp. (AY735411)和Zschokkella sp. (DQ118776)的序列一致性分別為100%和99.9%。

在黏孢子蟲種類鑒定中, 不同種的種內(nèi)18S rDNA序列差異沒有統(tǒng)一界限, 種內(nèi)差異通常在1%—3%[24—26]。本文報(bào)道的Guyenotia type CZ 與楚克拉(Zschokkella sp.DQ118776)的序列一致性為98.2%, 系統(tǒng)發(fā)育分析中其與兩極科楚克拉屬聚為一支, 因此, 作者認(rèn)為Guyenotia type CZ應(yīng)屬于楚克拉屬(Zschokkella )的黏孢子蟲在蘇氏尾鰓蚓寄生階段所對應(yīng)的放射孢子蟲。

自 Kent等[3]廢止射孢子蟲綱類群有效后, 放射孢子蟲綱下原有的屬名被以集合類群(Collective group)形式保留, 用于描述和劃分具有相似形態(tài)特征的放射孢子蟲。目前, 發(fā)現(xiàn)不同水體中的放射孢子和鑒定其所對應(yīng)的魚體寄生黏孢子蟲種類引起寄生蟲學(xué)和魚病學(xué)研究人員廣泛關(guān)注。然而, 根據(jù)本文構(gòu)建的放射孢子蟲和黏孢子蟲系統(tǒng)發(fā)育樹, 放射孢子蟲的集合類群和黏孢子蟲各屬間沒有呈現(xiàn)清晰的對應(yīng)關(guān)系。如與碘泡屬(Myxobolus)的黏孢子蟲存在對應(yīng)關(guān)系的放射孢子蟲類群有 Triactinomyxon、Aurantiactinomyxon、Raabeia、Hexactinomyxon等。因此,從放射孢子蟲形態(tài)特征去推斷其歸屬于某個(gè)黏孢子蟲屬種類沒有規(guī)律可循。放射孢子蟲的鑒定需要通過傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室感染或DNA分子序列分析。實(shí)驗(yàn)室感染通常耗時(shí)較長, 而分子鑒定較為快速、便捷和準(zhǔn)確。