單管巢式實(shí)時PCR檢測麻風(fēng)桿菌方法的建立及初步應(yīng)用

覃曉琳 黃進(jìn)梅 薛耀華 曾維英 吳興中 歐江麗藍(lán)銀苑 唐三梅 方銘恒 百 順 鄭和平

·論著·

單管巢式實(shí)時PCR檢測麻風(fēng)桿菌方法的建立及初步應(yīng)用

覃曉琳 黃進(jìn)梅 薛耀華 曾維英 吳興中 歐江麗藍(lán)銀苑 唐三梅 方銘恒 百 順 鄭和平?

目的: 明確單管巢式實(shí)時PCR檢測麻風(fēng)桿菌的特異性、靈敏性和重復(fù)性。方法: 以麻風(fēng)桿菌hsp18基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物和探針，建立單管巢式實(shí)時PCR方法檢測麻風(fēng)桿菌并與抗酸染色及普通PCR進(jìn)行特異性和靈敏性的比較。結(jié)果: 單管巢式實(shí)時PCR檢測下限為2.1 fg質(zhì)粒DNA，普通PCR為21 fg質(zhì)粒DNA，敏感性高10倍；與8種非麻風(fēng)桿菌無交叉反應(yīng)；批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.24%～1.08%，批間RSD為0.09%～2.8%。對比檢測54例麻風(fēng)疑似標(biāo)本中，抗酸染色、普通PCR和單管巢式實(shí)時PCR的敏感性分別為81.3%(26/32)、87.5%(28/32)和96.9%(31/32)。結(jié)論: 單管巢式實(shí)時PCR特異性強(qiáng)、敏感性高且重復(fù)性好。

麻風(fēng)桿菌； 單管巢式實(shí)時PCR； hsp18

由于體外培養(yǎng)麻風(fēng)桿菌尚未成功，目前臨床廣泛應(yīng)用的檢測方法主要為抗酸染色法、免疫學(xué)和組織學(xué)方法。1－3早期麻風(fēng)臨床表現(xiàn)不典型或病變不顯著時，特別是抗酸染色查菌陰性的少菌型(PB)患者，組織病理無特異性改變，用上述方法診斷較難。PCR技術(shù)的發(fā)展，為麻風(fēng)實(shí)驗(yàn)室診斷開辟了新的途徑。然而，普通PCR方法檢測敏感性尚不理想，多菌型病人PCR陽性率為89%，少菌型僅為33.3%。4為了提高敏感性，巢式PCR被成功應(yīng)用于麻風(fēng)桿菌的檢測，5其敏感性可達(dá)1 fg，但由于操作過程中需要開蓋加樣，存在PCR污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此建立單管巢式實(shí)時PCR方法十分必要。

目前有多種麻風(fēng)桿菌特異性基因(hsp 65kD、36kD、18kD和16SrRNA等)被作為診斷和治療麻風(fēng)的靶點(diǎn)。6－9研究顯示，hsp18是檢測早期麻風(fēng)和分析治療麻風(fēng)療效的一個有效指標(biāo)，已成功應(yīng)用于麻風(fēng)桿菌的實(shí)時PCR檢測。10，11本研究以hsp18基因?yàn)榘悬c(diǎn)，建立一種單管巢式實(shí)時PCR檢測方法，一方面克服常規(guī)麻風(fēng)檢測方法敏感性不足的缺點(diǎn)，另一方面又可以降低交叉污染的可能，為更敏感地檢測早期麻風(fēng)提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 LightCycler2.0 PCR擴(kuò)增儀，紫外分光光度計(jì)，DNA提取試劑盒購自亞能生物技術(shù)公司，SYBR?Premix Ex TaqTM反應(yīng)試劑、1000 bp DNA Maker購自寶生物(大連)生物工程公司，麻風(fēng)桿菌含hsp18基因序列的質(zhì)粒DNA由我院保存。

1.1.2 菌種 麻風(fēng)桿菌DNA、標(biāo)準(zhǔn)株鳥分枝桿菌(25291)、結(jié)核分枝桿菌(95053)、蟾蜍分枝桿菌(19250)、堪薩斯分枝桿菌(12478)由我院保存。海分枝桿菌(927)、胞內(nèi)分枝桿菌(13950)、偶發(fā)分枝桿菌(6841)、潰瘍分枝桿菌(19423)等由亞能公司提供，標(biāo)準(zhǔn)株均由ATCC引進(jìn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采用傳統(tǒng)麻風(fēng)桿菌取材方法對54例麻風(fēng)疑似患者進(jìn)行取材，切刮患者眉弓、耳垂、顴、下頜等部位皮膚組織液，對于有皮膚潰瘍病人直接在潰瘍部位刮取組織液，進(jìn)行涂片抗酸染色常規(guī)檢測，同時刮取組織液置于1 m L PBS離心管中，立即置于－20℃保存?zhèn)溆?。少菌型麻風(fēng)患者，抗酸染色為陰性，由我院麻防科醫(yī)生根據(jù)麻風(fēng)典型臨床表現(xiàn)(有皮損、麻木、神經(jīng)粗大等)結(jié)合病理改變確診為少菌型麻風(fēng)。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank發(fā)表的麻風(fēng)桿菌hsp18(序列號為:M19058.1)設(shè)計(jì)1對外引物和1對內(nèi)引物，擴(kuò)增片段長度分別為155 bp和107 bp，序列如下:外上游引物P1:5’－CGCTTCGCCGAGCAAGTGTTAGG－3’，外下游引物P2:5’－ACGGTGACTACGTTGCGTTCGATGT－3’；內(nèi)上游引物P3:5’－GCCCAGCAGTAATGCC－3’，內(nèi)下游引物P4:5’－ATGTCAATGTCCAGTGAATC－3’。

1.2.3 DNA模板的制備 根據(jù)亞能公司基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取。將凍存于－20℃保存的1 m L PBS離心管組織液室溫解凍，10 000 r/ min離心5 min，去上清，加入DNA提取試劑，充分混勻，置于99℃金屬浴中，15 min，然后10 000 r/min離心1 min，上清即為PCR反應(yīng)模板。

1.2.4 實(shí)時PCR擴(kuò)增 實(shí)時PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系: ddH2O:6μL；SYBR?Premix Ex TaqTMBuffer:10μL，P1:0.5μL，P2:0.5μL，P3:0.5μL，P4:0.5μL，DNA模板:2μL，總反應(yīng)體系為20μL。通過摸索LightCycler 2.0 PCR最佳反應(yīng)程序?yàn)?5℃30 s，94℃5 s，68℃30 s，20個循環(huán)；94℃5 s，58℃30 s，40個循環(huán)，最后降溫至37℃。通過LightCycler 2.0 PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測。單對引物普通PCR方法參照文獻(xiàn)方法。12

1.2.5 特異性分析 以麻風(fēng)桿菌質(zhì)粒DNA(含hsp18基因序列)作為陽性模板，ddH2O作為陰性對照，按照上述反應(yīng)條件，檢測結(jié)核分枝桿菌，海分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、鳥分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等已知分枝桿菌樣本，并將陽性PCR產(chǎn)物送上海生工測序，測序引物為內(nèi)引物。

1.2.6 敏感性檢測 將麻風(fēng)桿菌hsp18質(zhì)粒DNA(濃度為2.1×109fg)行10倍梯度倍比稀釋后分別作為模板，以ddH2O作為陰性對照，根據(jù)上述最佳反應(yīng)體系和程序進(jìn)行實(shí)時PCR擴(kuò)增，電腦軟件分析結(jié)果。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 對麻風(fēng)桿菌陽性DNA模板分別在不同時間(每次重復(fù)間隔時間不少于1天)進(jìn)行5次重復(fù)性試驗(yàn)，檢測該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.2.8 臨床初步應(yīng)用評價(jià) 將上述建立的方法檢測54例麻風(fēng)疑似標(biāo)本(根據(jù)臨床診斷資料，其中包括26例多菌型和6例少菌型)，并與直接涂片抗酸染色法、普通PCR法比較。

2 結(jié)果

2.1 單管巢氏PCR方法 以2對巢式PCR引物對麻風(fēng)桿菌質(zhì)粒DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度分別為155 bp和107 bp，見圖1。

2.2 特異性檢測 按照上述反應(yīng)條件對8株不同分枝桿菌和8例正常人皮膚黏液樣本進(jìn)行實(shí)時PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了麻風(fēng)桿菌hsp18質(zhì)粒DNA陽性對照出現(xiàn)了特異性熒光曲線，其余無熒光出現(xiàn)，表明該單管巢式實(shí)時PCR方法具有良好的特異性(圖2)。將擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送測序，將測序結(jié)果與麻風(fēng)桿菌目的基因hsp18序列(序列號為:M19058.1)比對(圖3)，結(jié)果一致。

圖1 單管巢式PCR電泳圖 M:1 kb DNA Maker，1:陰性對照，2:麻風(fēng)桿菌單管巢式PCR陽性產(chǎn)物圖2 麻風(fēng)桿菌單管巢式實(shí)時PCR特異性檢測圖3 測序比對結(jié)果

2.3 敏感性檢測 經(jīng)紫外分光光度儀測得麻風(fēng)桿菌hsp18質(zhì)粒DNA含量為2.1×109fg，作10倍梯度稀釋后，按照上述最佳反應(yīng)條件以此為模板進(jìn)行單管巢式實(shí)時PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，麻風(fēng)桿菌DNA最低檢測濃度為2.1 fg(圖4)。

圖4 麻風(fēng)桿菌單管巢式實(shí)時PCR敏感性檢測

采用巢式PCR、普通PCR、單獨(dú)的內(nèi)引物PCR、外引物PCR分別對上述稀釋的麻風(fēng)桿菌陽性樣本進(jìn)行實(shí)時PCR檢測，結(jié)果顯示，外引物普通PCR檢測DNA的最低濃度為42 fg，內(nèi)引物普通PCR檢測DNA的最低濃度為21 fg，而單管巢式PCR的最小檢測濃度是2.1 fg，即單管巢式PCR的敏感性是內(nèi)引物PCR的10倍，是外引物PCR的20倍。

2.4 重復(fù)性檢測 以相同濃度的麻風(fēng)桿菌hsp質(zhì)粒DNA(2.1×104fg)作為模板，5次不同時間檢測，同一時間重復(fù)3孔，通過計(jì)算其批內(nèi)及批間Ct值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。批內(nèi)RSD為0.24%～1.08%，批間RSD為0.09%～2.8%，RSD均＜5%，該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.5 臨床應(yīng)用評價(jià) 用抗酸染色方法、普通PCR方法和單管巢式實(shí)時PCR方法分別對臨床54例麻風(fēng)疑似標(biāo)本進(jìn)行檢測，抗酸染色法顯示27例陽性(1例為非麻風(fēng)桿菌，標(biāo)本來源于腿部潰瘍組織液)，普通PCR顯示28例陽性(2例為抗酸染色陰性)，單管巢式PCR 31例陽性(5例為抗酸染色陰性)(圖5)。根據(jù)臨床診斷資料顯示，54例疑似病例中有6例查菌陰性的少菌型麻風(fēng)患者和26例多菌型麻風(fēng)患者。普通PCR少菌型陽性檢出率為33.3%(2/6)，單管巢式PCR少菌型陽性檢出率為83.3%(5/6)，兩種PCR方法多菌型陽性檢出率為100%。1例患者切刮液抗酸染色陽性而經(jīng)兩種PCR方法檢測均為陰性的標(biāo)本，經(jīng)亞能公司提供的分枝桿菌雜交試劑盒檢測，結(jié)果顯示為偶發(fā)分枝桿菌。另外5例抗酸染色陰性和PCR方法檢測陽性標(biāo)本的PCR產(chǎn)物送測序，測序結(jié)果與麻風(fēng)hsp18理論擴(kuò)增序列一致。

圖5 單管巢式實(shí)時PCR檢測方法的應(yīng)用

3 討論

國外研究顯示，PCR技術(shù)檢測麻風(fēng)桿菌特異性16 SrRNA，其特異性為100%，敏感性為30 fg，相當(dāng)于8.3條麻風(fēng)桿菌。13而實(shí)時定量PCR技術(shù)的檢測水平可達(dá)20 fg，相當(dāng)于4條麻風(fēng)桿菌，14提示PCR技術(shù)有助于早期診斷。在應(yīng)用PCR技術(shù)的過程中，為提高對麻風(fēng)桿菌含量較低的PB患者的確診率，較多研究者選擇擴(kuò)增麻風(fēng)桿菌特異性靶基因或采用巢式PCR提高敏感性。溫艷等5應(yīng)用巢式PCR方法檢測全血中麻風(fēng)桿菌特異片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PB患者中細(xì)菌密度指數(shù)(BI)為陰性者，其陽性檢測率可達(dá)78.57%，檢測水平可達(dá)1 fg。巢式PCR技術(shù)有效提高了檢測敏感性，但操作過程中需要開蓋加樣，增加了污染危險(xiǎn)。

本研究選擇麻風(fēng)桿菌hsp18基因序列作為擴(kuò)增目的片段，10，11融合巢式PCR和實(shí)時PCR兩種方法建立了單管巢式實(shí)時PCR方法，雖不如溫艷等5報(bào)道的方法敏感，但與普通PCR相比提高了敏感性和特異性，且通過單管反應(yīng)減少了操作過程中可能存在的交叉污染。用此法檢測臨床54例麻風(fēng)疑似標(biāo)本(其中臨床診斷26例為多菌型和6例為少菌型)，多菌型麻風(fēng)患者陽性檢出率為96.9%(31/32)，少菌型患者陽性檢出率為83.3%(5/6)，高于普通PCR方法[33.3% (2/6)]和抗酸染色方法，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。同時抗酸染色檢測臨床病例時，誤診1例，誤診率為4.3%(1/23)，而2種PCR方法均無誤診，其特異性高于抗酸染色法。

本研究擴(kuò)增產(chǎn)物(155 bp和107 bp堿基序列)經(jīng)基因測序后同Genbank報(bào)道的序列比較，顯示一致。特異性檢測發(fā)現(xiàn)與8種非麻風(fēng)桿菌和8例正常人皮膚黏液樣本無交叉反應(yīng)。經(jīng)對hsp18質(zhì)粒DNA進(jìn)行系列稀釋，本方法檢測下限(2.1 fg)比普通PCR(21 fg)檢測方法和單引物PCR(21 fg或42 fg)敏感性高。由于檢測病例較少，本方法臨床應(yīng)用評價(jià)的敏感性和特異性還需擴(kuò)大樣本進(jìn)行進(jìn)一步檢測確證，但初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示建立的單管巢式實(shí)時PCR敏感性和特異性較好，通過單管減少了交叉污染。對提高少菌型患者的診斷率具有一定的應(yīng)用前景，對臨床診斷麻風(fēng)患者特別是診斷不典型的少菌型麻風(fēng)患者意義更大，有利于麻風(fēng)流行病學(xué)研究的開展。

1Britton WJ，Lockwood DN.Leprosy.Lancet，2004，363(9416): 1209－1219.

2 Naafs B.Viewpoint:leprosy after the year 2000.Trop Med Int Health，2000，5(6):400－403.

3Williams DL，Gillis TP，Booth RJ，et al.The use of a specific DNA probe and polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium leprae.J Infect Dis，1990，162(1):193－200.

4 Kramme S，Bretzel G，Panning M，etal.Detection and quantification of Mycobacterium leprae in tissue samples by real－time PCR.Med Microbiol Immunol，2004，193(4):189－193.

5溫艷，邢燕，袁聯(lián)潮，等.用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從全血擴(kuò)增麻風(fēng)菌特異片段提高麻風(fēng)病確診率.中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，12(5):415－418.

6Martinez AN，Britto CF，Nery JA，et al.Evaluation of real time and conventional PCR targeting complex 85 genes for detection of Mycobacterium leprae DNA in skin biopsy samples from patients diagnosed with leprosy.J Clin Microbiol，2006，44(9): 3154－3159.

7 Cox RA，Kempsell K，F(xiàn)airclough L，et al.The 16S ribosomal RNA of Mycobacterium leprae contains a unique sequence which can be used for identification by the polymerase chain reaction.J Med Microbiol，1991，35(5):284－290.

8Donoghue HD，Holton J，Spigelman M.PCR primers that can detect low levels ofMycobacterium leprae DNA.JMed Microbiol，2001，50(2):177－182.

9溫艷，谷俊朝.PCR技術(shù)檢測麻風(fēng)分枝桿菌進(jìn)展.中華實(shí)用診斷與治療雜志，2012，26(9):838－840.

10 Chae GT，Kim MJ，Kang TJ，et al.DNA－PCR and RT－PCR for the 18－kDa gene of Mycobacterium leprae to assess the efficacy ofmultidrug therapy for leprosy.JMed Microbiol，2002，51 (5):417－422.

11 LiniN，Shankernarayan NP，Dharmalingam K.Quantitative real－time PCR analysis of Mycobacterium leprae DNA and mRNA in human biopsymaterial from leprosy and reactional cases. JMed Microbiol，2009，58(Pt 6):753－759.

12熊俊浩，雍剛，喻林沖.16SrRNA在多聚酶鏈反應(yīng)麻風(fēng)診斷中的特異性研究.預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2002，18(1):26－27.

13 Bang PD，SuzukiK，PhuongleLT，et al.Evaluation of polymerase chain reaction－based detection of Mycobacterium leprae for the diagnosis of leprosy.JDermatol，2009，36(5):269－276.

14 Rudeeaneksin J，Srisungngam S，Sawanpanyalert P，et al. LightCycler real－time PCR for rapid detection and quantitation of Mycobacterium leprae in skin specimens.FEMS Immunol Med Microbiol，2008，54(2):263－270.

(收稿:2014－01－18 修回:2014－07－08)

Establishment and prelim inary application of single－tube nested realtime PCR in detecting Mycobacterium leprae

QIN Xiao-lin，HUANG Jin-mei，XUE Yao-hua，et al.Guangdong Provincial Center of Skin Diseases＆STIs Control，Guangzhou，510091

Objective:To detect the sensitivity of single－tube nested realtime PCR in detecting Mycobacterium leprae.Methods:The primers and probe were designed based on the hsp18 gene of Mycobacterium leprae.The single－tube nested realtime PCR was established and the sensitivity and specificity were compared with acid－fast staining and ordinary PCR.Results:The sensitivity of the single－tube nested realtime PCR for detecting Mycobacterium lepraewas 2.1fg of plasmid DNA，which was 10 timesmore sensitive than that in the normal PCR.There was non－cross reactivity with other 8 Non－Mycobacterium leprae.Intra relative standard deviation(RSD)was 0.24%－1.08%and inter RSD was 0.09%－2.8%.The sensitivity of acid－fast staining，normal and single－tube nested PCR in detecting 54 suspected samplesof leprosywas81.3%(26/32)，87.5% (28/32)and 96.9%(31/32)，respectively.Conclusion:The single－tube nested realtime PCR method in detecting Mycobacterium leprae ismore sensitive and specific.

Mycobacterium leprae；single－tube nested realtime PCR；hsp18

廣東省皮膚性病防治中心/廣東省皮膚病醫(yī)院，廣州，510091

?通信作者