MRSA的spa、clfB及spa-clfB雙位點(diǎn)序列分型的研究進(jìn)展

劉曄華(綜述)，穆 紅(審校)

(天津市第一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300192)

1959年，甲氧西林用于治療青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)引起的感染。1961年，在英國即分離到耐甲氧西林的MRSA，隨后歐洲其他國家也分離出MRSA，之后在日本、澳大利亞和美國分離出該菌。目前MRSA正在全世界快速蔓延，所致感染可呈散發(fā)、流行、甚至暴發(fā)[1-2]。MRSA的感染已成為全球公共衛(wèi)生問題之一。

迄今為止，已對(duì)MRSA進(jìn)行了從表型分析(比如噬菌體分型)到基因組分型——脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)的一系列研究[3]，最近基于單個(gè)基因或基因聯(lián)合運(yùn)用的分型技術(shù)有很大發(fā)展，該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于通過基因分型所建立的數(shù)據(jù)庫具有在不同實(shí)驗(yàn)室間的可比性，通過公用網(wǎng)站對(duì)所得數(shù)據(jù)資料歸納匯總，對(duì)暴發(fā)流行株進(jìn)行親緣鑒定和克隆群區(qū)分，以發(fā)現(xiàn)新的型別。

1 MRSA的基因組構(gòu)成

MRSA的基因組可分為核心基因和附屬基因兩個(gè)部分，其核心基因主要包括7個(gè)看家基因(arcC、aroE、glpE、gmk、pta、tpi、yqiL)，這些基因進(jìn)化相對(duì)緩慢，主要通過點(diǎn)突變和基因置換完成進(jìn)化，因此相對(duì)穩(wěn)定。多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)的方法是基于上述450～500 bp的7個(gè)看家基因的等位基因不同型別的分子分型技術(shù)[4]，這種方法可在全球范圍內(nèi)對(duì)MRSA進(jìn)行克隆群體的區(qū)分，以便進(jìn)一步對(duì)所調(diào)查的菌株溯源。MRSA的附屬基因包括mecA毒力因子(sea、tst和eta等)和黏附基因家族成員(clfA、clfB、fnbA、fnbB、spa等)[5]，這類基因可在菌株間傳遞，其所編碼蛋白與細(xì)菌的表型相關(guān)(圖1)?？傮w上說，MLST分型可以了解特定地區(qū)MRSA的群體結(jié)構(gòu)，即哪個(gè)克隆群占優(yōu)勢；基于附屬基因的分型方法更適合特定地區(qū)MRSA的流行病學(xué)監(jiān)測，但兩類方法需聯(lián)合運(yùn)用以互補(bǔ)。

圖1 金黃色葡萄球菌基因結(jié)構(gòu)圖

2 MRSA的分型方法

2.1spa基因分型 MRSA spa基因序列全長1527 bp，是編碼509個(gè)氨基酸的A蛋白，該蛋白是MRSA細(xì)胞壁的組成部分。spa基因從5′端到3′端依次為信號(hào)序列S、IgG結(jié)合區(qū)域A～D(E區(qū)域和A～D同源)、X可變重復(fù)區(qū)域(圖2)，其中Xr區(qū)由24 bp重復(fù)序列串聯(lián)組成，點(diǎn)突變形成了重復(fù)序列的多個(gè)型別，而重復(fù)序列的插入或缺失構(gòu)成了Xr區(qū)長度以及串聯(lián)圖譜的多態(tài)性，到目前為止spa的重復(fù)序列已達(dá)581個(gè)[6]，這可以確保該分型方法的靈敏度和分型能力。在X區(qū)域上游的C末端存在高度保守性的開放讀碼框，可對(duì)X區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)以便對(duì)不同菌株進(jìn)行基因分型，已經(jīng)有公共網(wǎng)站進(jìn)行分型比對(duì)(http://spa.ridom.de/spaserver)。

圖2 spa的基因結(jié)構(gòu)(從左到右5′～3′)

最早應(yīng)用spa分型技術(shù)的是Frénay等[7]，他們以14株已公布全基因組序列的MRSA作為對(duì)照，測定了33株MRSA spa基因X區(qū)串聯(lián)重復(fù)序列，認(rèn)為流行株X區(qū)串聯(lián)重復(fù)序列相對(duì)較長，這有助于細(xì)菌與IgG的Fc段結(jié)合。隨后Shopsin等[8]從散發(fā)流行到暴發(fā)流行的角度對(duì)spa分型技術(shù)進(jìn)行了全面評(píng)價(jià)，并公布了spa重復(fù)序列的型別以及編碼方式，使得該技術(shù)得到進(jìn)一步應(yīng)用。2003年Harmsen等[9]研發(fā)了spa分型軟件并創(chuàng)建了公共網(wǎng)站，通過上傳各地區(qū)MRSA spa的串聯(lián)重復(fù)序列測序結(jié)果，即可得到相應(yīng)型別；隨后該網(wǎng)站完善了對(duì)MRSA的spa型別歸納匯總，類似對(duì)MLST分型結(jié)果進(jìn)行CC克隆群體的親緣鑒定，同時(shí)該網(wǎng)站可以將spa的分型結(jié)果與MLST分型結(jié)果進(jìn)行對(duì)應(yīng)，彌補(bǔ)了單一分型方法的局限性(http://spa.ridom.de/mlst.shtml)。大量的研究報(bào)道指出，spa分型技術(shù)不如PFGE敏感，但優(yōu)于MLST的分型能力[10-13]。因此，應(yīng)對(duì)區(qū)域性MRSA的暴發(fā)流行調(diào)查或短期內(nèi)該菌的流行病學(xué)調(diào)查，spa分型是一種簡單易行的方法[14-16]。

2.2clfB基因分型 clfB基因與spa基因相似，MRSA的clfB是黏附素基因家族成員之一[17]，由其編碼的凝集因子B可錨定于人類纖維蛋白和角蛋白上，繼而使MRSA定植于人類鼻咽部，因此clfB在MRSA的致病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。有報(bào)道稱，clfB在MRSA所致的心內(nèi)膜炎中發(fā)揮病理作用[18]。clfB基因含有420～804 bp的絲氨酸-天冬氨酸(serine-aspartate，SD)高度變異串聯(lián)重復(fù)序列，該SD序列由18 bp(TCN-GAY-TCN-GAY-AGY-GAY，其中N=A、C、G或T、Y=C或者T)組成(圖3)，由于核苷酸突變以及發(fā)生于復(fù)制階段的鏈錯(cuò)配致使SD序列增加或丟失，使得該區(qū)域具有遺傳多態(tài)性。clfB具有體內(nèi)、外穩(wěn)定性及宿主之間傳播的穩(wěn)定性，且clfB為毒力基因，易受進(jìn)化選擇壓力的影響，加之SD序列的高度變異性保證了clfB分型的高分辨率，因此可以作為MRSA分型的候選基因[17,19]。已知clfB的SD序列有102個(gè)不同的型別，依據(jù)應(yīng)用spa串聯(lián)重復(fù)序列分型的原理，也可應(yīng)用clfB的SD序列對(duì)MRSA進(jìn)行分型。依據(jù)該基因的病理作用，將有助于區(qū)分感染株和定植菌株。

最早應(yīng)用clfB進(jìn)行分型的報(bào)道來自美國新澤西醫(yī)學(xué)院的Koreen等[19]的研究組和洛克菲勒大學(xué)Gomes等[20]的研究組對(duì)MRSA所做的clfB分型，結(jié)果顯示其分型能力僅次于PFGE，優(yōu)于spa和MLst的分型能力，而且與PFGE和spa分型的一致性>95%。

圖3 clfB的基因結(jié)構(gòu)

Ugolotti等[21]研究人員在Koreen等[19]的基礎(chǔ)上對(duì)clfB分型方法做了改進(jìn)，相應(yīng)法則如下：如果clfB重復(fù)序列的圖譜具有相同的5′和3′端，則歸入同一系列，同一系列內(nèi)的亞類通過罰分法則區(qū)分，其中插入、不連續(xù)缺失以及18 bp重復(fù)序列被12 bp序列置換各有相應(yīng)罰分，最終累計(jì)分?jǐn)?shù)可區(qū)分不同亞類：1=A<2；2=B<3；3=C<4；4=D<5；5=E<6；6=F<7；7=G<9；9=H<11；L>=11。不同的系列用不同羅馬數(shù)字表示。

2.3spa-clfB雙位點(diǎn)基因分型 研究認(rèn)為，單純應(yīng)用spa分型、clfB分型不及PFGE的分型能力，但PFGE對(duì)同一菌株在體外傳代或保存幾個(gè)月后再進(jìn)行分型，其結(jié)果即可能改變[17,22]，加之PFGE操作費(fèi)時(shí)，至今尚未建立針對(duì)其分型的一致判別標(biāo)準(zhǔn)，故該方法不能在不同實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行比對(duì)。Kuhn等[10]將spa與clfB聯(lián)合應(yīng)用，即雙位點(diǎn)序列分型(double-locus sequence typing，DLST)，這既分析了spa和clfB全部重復(fù)序列的圖譜，也分析兩者自3′端500 bp重復(fù)序列圖譜。聯(lián)合分型的分型能力與PFGE相當(dāng)，且更加經(jīng)濟(jì)省時(shí)。許多專家研究證實(shí)，spa和clfB這兩個(gè)候選基因具有體內(nèi)外穩(wěn)定性強(qiáng)，不易發(fā)生遺傳突變的特點(diǎn)[6,19]。Basset等[23]的研究組應(yīng)用DLST分型技術(shù)對(duì)186株甲氧西林敏感MRSA和103株MRSA進(jìn)行分型，獲得了205個(gè)DLST基因型，分型指數(shù)(index of discrimination,ID)為0.994。Ugolotti等[21]應(yīng)用DLST技術(shù)對(duì)一家醫(yī)院的ICU、外科和急診科室進(jìn)行了3年的流行病學(xué)調(diào)查，查明了幾個(gè)科室MRSA的主要流行株，與PFGE相比，DLST簡便、重復(fù)性好，ID達(dá)到0.85，優(yōu)于spa(ID=0.58)和clfB(ID=0.83)。

3 小 結(jié)

MRSA基因組可分為核心基因和附屬基因兩部分，基于核心基因的分型包括MLST分型，基于附屬基因的分型包括spa分型、clfB分型以及spa-clfB雙位點(diǎn)基因分型等。MLST分型可了解特定地區(qū)MRSA的群體結(jié)構(gòu)，即哪個(gè)克隆群占優(yōu)勢；spa分型、clfB分型及spa-clfB雙位點(diǎn)基因分型更適合特定地區(qū)MRSA的流行病學(xué)監(jiān)測。簡而言之，對(duì)于MRSA的分型，不論是PFGE、MLST，還是依據(jù)于附屬基因(如spa、clfB分型等)的可變串聯(lián)序列分型，任何一種方法的分型能力都存在局限性，因此需聯(lián)合應(yīng)用幾種分型方法，并結(jié)合流行病學(xué)資料，才能做到準(zhǔn)確溯源。

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