單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在腫瘤基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用＊

陳 誠(chéng)，楊 軍綜述，董 堅(jiān)△審校

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，昆明650031；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，昆明650032）

隨著人類基因組計(jì)劃（human genome project，HGP）和國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃（the international HapMap project）的完成以及高通量生物芯片技術(shù)的成功研發(fā)，以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的基因組結(jié)構(gòu)初步分析已經(jīng)完成。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤是在細(xì)胞水平的惡性克隆，同時(shí)，惡性腫瘤細(xì)胞通過(guò)對(duì)自身的不斷的“改良”以適應(yīng)宿主各種環(huán)境。從進(jìn)化上來(lái)說(shuō)，能夠引發(fā)惡性腫瘤的細(xì)胞即所謂“成功”的腫瘤細(xì)胞，其具備將遺傳模板傳遞給下一代腫瘤細(xì)胞的能力，而能夠引致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤細(xì)胞其自身必定帶有其他腫瘤細(xì)胞亞群所不具備的信息。因此，在單克隆水平去分析這些腫瘤克隆的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等，有可能揭示惡性腫瘤產(chǎn)生的具體機(jī)制。由于惡性腫瘤本身的異質(zhì)性，在原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞群可能是由具備血管生成、侵襲能力、轉(zhuǎn)移特性等不同方面的能力或是具備多功能的細(xì)胞亞群所組成。目前普遍認(rèn)為，傾向于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一些細(xì)胞亞群在親代腫瘤中已然存在，不同的轉(zhuǎn)移灶可從不同的單個(gè)細(xì)胞增生而來(lái)，并且這些發(fā)生轉(zhuǎn)移的細(xì)胞亞群受多重機(jī)制的調(diào)控。如果能夠以單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行整個(gè)全基因組范圍的分析，不僅取材更經(jīng)濟(jì)，更重要的是細(xì)胞可能達(dá)到真正的純化，實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果更精確也更可靠。因此，探索單個(gè)腫瘤細(xì)胞的遺傳信息并對(duì)其進(jìn)行分析成為腫瘤基礎(chǔ)研究人員的夢(mèng)想。

2011年，由紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室、德州大學(xué)安德森癌癥研究中心開發(fā)并報(bào)道單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)（single cell sequencing，SNS），該技術(shù)能夠突破傳統(tǒng)癌癥基因組研究的如混合樣品測(cè)序無(wú)法判斷具體突變來(lái)源及頻率，無(wú)法解釋癌癥的發(fā)生、發(fā)展以及演化過(guò)程中的細(xì)節(jié)，難以區(qū)分主動(dòng)與被動(dòng)突變；細(xì)胞系測(cè)序無(wú)法除去體外培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的新突變等問題[1]。目前，對(duì)于惡性腫瘤單細(xì)胞測(cè)序已應(yīng)用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎癌、血液腫瘤等惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制等的研究，同時(shí)，也有研究者將該技術(shù)應(yīng)用于乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制方面的研究[2-4]。將單細(xì)胞的純化技術(shù)聯(lián)合單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于腫瘤的相關(guān)機(jī)制研究必將能夠取得突破性進(jìn)展。

1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的原理

單細(xì)胞測(cè)序主要包括單細(xì)胞基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA進(jìn)行序列分析，分別揭示單個(gè)細(xì)胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組的變化情況。單細(xì)胞全基因組測(cè)序是對(duì)選定的目的細(xì)胞的全部基因組序列進(jìn)行非選擇性、均勻擴(kuò)增，隨后利用外顯子捕獲技術(shù)進(jìn)而高通量測(cè)序。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行cDNA測(cè)序，從而獲取特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本，主要用于在全基因組范圍內(nèi)挖掘基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，尤其適用于存在高度異質(zhì)性的干細(xì)胞及胚胎發(fā)育早期的細(xì)胞群體。與活細(xì)胞成像系統(tǒng)相結(jié)合，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析更有助于深入理解細(xì)胞分化、細(xì)胞重編程及轉(zhuǎn)分化等過(guò)程及相關(guān)的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

2 單細(xì)胞分離技術(shù)

2.1 單細(xì)胞分離的重要性 既往關(guān)于腫瘤的相關(guān)機(jī)制的研究中，研究樣本主要來(lái)源于在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系以及患者的腫瘤標(biāo)本。由于樣本采集及單細(xì)胞分離技術(shù)受限的原因，幾乎所有的癌癥基因組研究結(jié)果都來(lái)自包含多種不同細(xì)胞群（包括腫瘤細(xì)胞及其他正常細(xì)胞亞群等）的腫瘤樣本，混雜的細(xì)胞中摻雜許多干擾信號(hào)，導(dǎo)致目標(biāo)腫瘤細(xì)胞亞群內(nèi)那些包含有與腫瘤發(fā)生、浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)可能被平均化甚至被無(wú)限稀釋。為了盡可能的獲得單個(gè)細(xì)胞用于腫瘤基因組學(xué)研究，研究人員開展了一系列的細(xì)胞純化技術(shù)并進(jìn)行優(yōu)化。目前，對(duì)于單細(xì)胞的分離技術(shù)主要兩大類：（1）基于細(xì)胞培養(yǎng)以達(dá)到單個(gè)細(xì)胞分離的目的；（2）分離技術(shù)是基于儀器的單個(gè)細(xì)胞的分選。

2.2 基于培養(yǎng)的方法 （1）有限稀釋法：主要是針對(duì)腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行單個(gè)腫瘤細(xì)胞的分選，將細(xì)胞配制成系列濃度梯度的細(xì)胞懸液，接種于96孔板等培養(yǎng)器皿中，從而使某些孔中只有1個(gè)細(xì)胞。由于操作費(fèi)時(shí)，且無(wú)法保證對(duì)單個(gè)腫瘤細(xì)胞的分離和純化，因此，不能大規(guī)模開展。（2）軟瓊脂培養(yǎng)法：其主要應(yīng)用于新鮮采集的腫瘤標(biāo)本內(nèi)單個(gè)腫瘤細(xì)胞的篩選，利用實(shí)體瘤細(xì)胞能在軟瓊脂上生長(zhǎng)并形成克隆的原理，可將少量的腫瘤細(xì)胞從大多數(shù)非惡性細(xì)胞內(nèi)分離出來(lái)。目前，由Cell Biolabs公司的開發(fā)的克隆原性腫瘤細(xì)胞分離試劑盒（clonogenic tumor cell isolation kit，CytoSelect）能夠?qū)蝹€(gè)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分離純化，達(dá)到單細(xì)胞分離的需求。

2.3 基于儀器分選的方法 （1）單細(xì)胞顯微操作法：利用玻璃針頭等在高倍鏡下進(jìn)行細(xì)胞分選，該方法獲取細(xì)胞數(shù)量少，且操作難度大、易損傷目的細(xì)胞，因此難以應(yīng)用于大規(guī)模實(shí)驗(yàn)研究中。（2）流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞：通過(guò)超聲波使樣本細(xì)胞團(tuán)分散成單個(gè)細(xì)胞，使帶不同電荷的細(xì)胞經(jīng)過(guò)電場(chǎng)偏向不同方向，或是通過(guò)熒光標(biāo)記目的細(xì)胞進(jìn)行分選，從而達(dá)到分選以及獲取單個(gè)細(xì)胞的目的，該技術(shù)分離迅速，純度高。（3）激光捕獲顯微切割：在組織切片上覆蓋一層透明的膜，顯微鏡下選擇目的細(xì)胞后，利用脈沖式紅外激光束使膜熔化，冷卻后該位置的細(xì)胞牢固地黏附在膜上面，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離，利用該方法可方便、確定分離靶細(xì)胞。（4）免疫磁珠分離：其原理是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場(chǎng)中，與磁珠相連的帶有表面抗原的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，不能與磁珠連接著的細(xì)胞不在磁場(chǎng)中停留，從而使目的細(xì)胞得以分離。這是目前最為常用的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）富集方法，現(xiàn)已有FDA批準(zhǔn)上市的專業(yè)產(chǎn)品Cell SearchTM System （Veridex）。

3 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在腫瘤相關(guān)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用

3.1 腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究 2008年，Ley等[5]利用流式細(xì)胞分選技術(shù)分選出AML患者的腫瘤細(xì)胞，隨后對(duì)這些腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了遺傳突變檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了可能與AML有關(guān)的基因；2009年，Tang等[6]分析了單個(gè)小鼠細(xì)胞的四細(xì)胞胚胎和卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，同年，Mayer等[7]通過(guò)激光顯微切割技術(shù)分離單個(gè)的外周血淋巴細(xì)胞，然后對(duì)一類少見的遺傳性大腸癌--家族性腺瘤性息肉綜合征的致病基因APC基因進(jìn)行了測(cè)序分析，獲得了完整的APC基因突變數(shù)據(jù)。2010年，Clark等[2]及Pleasance等[8]分別對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87及小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H209進(jìn)行了的單個(gè)腫瘤細(xì)胞測(cè)序分析，研究所得結(jié)果為腫瘤的基因診斷提供了新的線索；2011年Hannemann等[9]采用高分辨率微陣列比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）技術(shù)，通過(guò)顯微切割技術(shù)分離出單個(gè)的結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116的細(xì)胞，隨后對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行了拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）的檢測(cè)。最新的研究結(jié)果顯示，通過(guò)利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)所進(jìn)行的深度測(cè)序可發(fā)現(xiàn)許多非常罕見的與人大腸癌發(fā)生的密切相關(guān)的突變。2011年，Bass等[10]通過(guò)對(duì)9名的大腸癌患者進(jìn)行了全基因組的測(cè)序，得出了如VTI1A和TCF7L2的融合等11個(gè)讀碼框內(nèi)的基因融合事件。2012年，Hou等[4]采用以 MDA為基礎(chǔ)的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）患者的單個(gè)骨髓細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序并分析，篩查出在ET發(fā)病和進(jìn)展中的驅(qū)動(dòng)基因。隨后，該研究團(tuán)隊(duì)用同樣的方法分析了單個(gè)腎癌細(xì)胞的單核苷酸突變特征[3]。

3.2 腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究 通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)分析來(lái)自同一患者成對(duì)的腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶的樣品中的單個(gè)腫瘤細(xì)胞的基因組信息，對(duì)比原癌巢腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞之間突變位點(diǎn)，從而闡明腫瘤的轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)遺傳學(xué)機(jī)制，可以認(rèn)識(shí)各種腫瘤細(xì)胞之間及個(gè)體之間存在差異的起因和解釋腫瘤產(chǎn)生的機(jī)制[11-12]。2010年，Ding等[13]完成了來(lái)源于同一患者的4種組織樣本的DNA樣本的完整序列分析，結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)移腫瘤來(lái)源于原發(fā)性腫瘤中1個(gè)亞類的細(xì)胞，與原發(fā)灶內(nèi)的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的細(xì)胞已發(fā)生突變。2011年，Navin等[1]利用全基因組擴(kuò)增及DNA測(cè)序?qū)?00個(gè)乳腺癌細(xì)胞分別進(jìn)行了CNV的分析，準(zhǔn)確地量化出單個(gè)核基因組中的拷貝數(shù)，推斷出乳腺癌細(xì)胞的群體結(jié)構(gòu)和腫瘤的進(jìn)化過(guò)程[2]。通過(guò)對(duì)100個(gè)源于多染色體組腫瘤的單細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)不同的與腫瘤細(xì)胞連續(xù)克隆擴(kuò)增有關(guān)的細(xì)胞亞群。接著又對(duì)100個(gè)源于單染色體組腫瘤的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的單細(xì)胞進(jìn)行分析后，得出腫瘤的播散和轉(zhuǎn)移與單個(gè)克隆擴(kuò)增有關(guān)。他們還發(fā)現(xiàn)了一種不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移的含有豐富亞群的假二倍體細(xì)胞。

3.3 腫瘤干細(xì)胞的研究 Liu等[14]通過(guò)運(yùn)用單細(xì)胞分離技術(shù)所取得的單個(gè)腫瘤干細(xì)胞接種于特定的培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行單細(xì)胞克隆形成分析，觀察腫瘤干細(xì)胞的自我更新及分化潛能。對(duì)來(lái)源于同一乳腺癌細(xì)胞系的腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，單克隆形成細(xì)胞比部分克隆及多克隆形成細(xì)胞具有更高的增殖潛能，提示單克隆形成細(xì)胞中可能含有腫瘤干細(xì)胞的亞群體。他們通過(guò)對(duì)單個(gè)腫瘤干細(xì)胞的測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)CD133（＋）的高表達(dá)和腫瘤血管生成的密切關(guān)系可能與三陰乳腺癌的進(jìn)展復(fù)發(fā)有關(guān)。Felthaus等[15]利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的干細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞癌對(duì)常規(guī)放化療的抵抗可能由腫瘤干細(xì)胞引起。

4 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在腫瘤臨床治療方面的應(yīng)用

4.1 指導(dǎo)腫瘤的治療 由于單染色體組腫瘤的患者要比多染色體組腫瘤患者有更好的化療敏感性和更高的生存率，這提高了發(fā)現(xiàn)研究耐藥克隆的可能性，單細(xì)胞測(cè)序可以提高原發(fā)腫瘤中比較罕見的耐藥性克隆的檢測(cè)靈敏度[16]。這一方法可能會(huì)解釋耐藥性克隆是在原發(fā)性腫瘤中先天存在還是在治療后出現(xiàn)這一問題[17-18]。此外，通過(guò)對(duì)1個(gè)患者數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的單個(gè)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分析，可以繪制出腫瘤在接受輔助治療前后的全基因組多樣性圖譜。這樣的研究在順鉑治療宮頸癌和卵巢癌放化療中已經(jīng)開始進(jìn)行，這些研究通過(guò)分析腫瘤基因組化療前和化療后的基因拷貝數(shù)，檢測(cè)到一些腫瘤的異質(zhì)性及預(yù)先存在于原發(fā)性腫瘤的亞群在化療后進(jìn)一步擴(kuò)大[19-20]。利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)來(lái)進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞的基因組拷貝數(shù)分析可以提供更全面的基因組信息，一些潛在的癌基因可能會(huì)被發(fā)現(xiàn)，從而為腫瘤的治療提供更好的決策指導(dǎo)。

4.2 評(píng)估腫瘤的預(yù)后 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的一個(gè)主要應(yīng)用是它可以檢測(cè)那些在組織樣本中比較罕見的，少于100個(gè)細(xì)胞數(shù)的腫瘤細(xì)胞。例如只有5%～10%的早期乳腺癌會(huì)進(jìn)展為浸潤(rùn)性癌，所以用傳統(tǒng)的檢測(cè)手段無(wú)法檢測(cè)。免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)，許多早期乳腺癌就可以表現(xiàn)出很明顯的腫瘤異質(zhì)性，利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)這些腫瘤的異質(zhì)性，相應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果可提示患者的預(yù)后，從而可能會(huì)對(duì)這些腫瘤是否會(huì)發(fā)展為浸潤(rùn)性癌提供預(yù)測(cè)并更好地對(duì)腫瘤的治療進(jìn)行指導(dǎo)[21]。

4.3 監(jiān)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā) 單細(xì)胞測(cè)序的另一臨床應(yīng)用是在監(jiān)測(cè)和分析轉(zhuǎn)移性腫瘤治療過(guò)程中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）。Bidard等[21]對(duì)115例確診為轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者化療前及化療后隨訪36個(gè)月都進(jìn)行了血液中CTCs的檢測(cè)，23%的患者可以檢測(cè)到循環(huán)腫瘤細(xì)胞，有10%的患者在7.5mL血液中可以檢測(cè)到1個(gè)以上的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。其結(jié)果提示化療前CTCs的檢測(cè)可以作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌遠(yuǎn)傳轉(zhuǎn)移無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素。Rao等[22]對(duì)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)也提示了CTCs與黑色素瘤的預(yù)后及生存率有關(guān)。臨床醫(yī)生在患者接受輔助治療或化療后通過(guò)監(jiān)測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞來(lái)確定腫瘤是否有復(fù)發(fā)的可能。

5 展 望

2011年《自然方法》雜志將單細(xì)胞測(cè)序列為年度值得期待的技術(shù)之一，2013年《科學(xué)》雜志將單細(xì)胞測(cè)序列為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首。雖然大部分的腫瘤組織樣本基因組學(xué)研究可以提供1個(gè)患者身上的總體突變趨勢(shì)，但不能確定是否所有的腫瘤細(xì)胞都包含全套的突變，或者不同的亞群是否包含這些突變的子集，并且聯(lián)合推動(dòng)了腫瘤的進(jìn)化和發(fā)展。而單細(xì)胞測(cè)序法向人們提供了探索腫瘤基因組多樣性和檢測(cè)分析罕見癌癥細(xì)胞基因組或腫瘤細(xì)胞亞群所包含的遺傳信息的手段和方法。同時(shí)，在基礎(chǔ)研究方面，它還揭示了部分腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的部分機(jī)制，并在腫瘤的早期診斷，指導(dǎo)臨床治療，提示預(yù)后復(fù)發(fā)等方面發(fā)揮了積極的作用。筆者相信，隨著單細(xì)胞分離技術(shù)以及單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)的逐漸成熟，測(cè)序成本的大幅度下降，破譯來(lái)自單細(xì)胞的30億堿基的基因組并逐個(gè)細(xì)胞比較序列正在變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。

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