臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化及應(yīng)用*

楊軍政 綜述，李永海，李 萌，林俊堂 審校

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院干細(xì)胞與生物治療技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

自2000年Erices等[1]報道臍帶血中含有豐富的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞以來，因臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能，免疫調(diào)節(jié)作用和無倫理問題等優(yōu)點，備受研究者的關(guān)注。隨后，有學(xué)者分別報道了臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可誘導(dǎo)表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物[2-3]。目前人們已經(jīng)可以成功地體外分離培養(yǎng)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞，并且對其生物學(xué)特性、表面標(biāo)志和免疫原性有了進一步的了解。近年來成功地誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨、脂肪、軟骨、肝臟及神經(jīng)等成體細(xì)胞，展示了臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的無限分化潛能和廣闊的應(yīng)用前景。從而為體外誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分化各種成體細(xì)胞和各種疾病的治療提供了新的思路。

1 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的特性及誘導(dǎo)分化

1.1臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離主要有以下幾種方法[4]：密度梯度離心法、貼壁細(xì)胞分離法、流式細(xì)胞分離法和免疫磁珠法等。目前采用最多的是密度梯度離心法，但分離的純度不高。流式細(xì)胞分離法和免疫磁珠法都是通過臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞表面的特殊標(biāo)志對細(xì)胞進行篩選，分離的細(xì)胞純度較高，但成本較高。

目前在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方面沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。常用的培養(yǎng)基有DMEM/F12、DMEM、IMEM和MesencultTM等，在培養(yǎng)基中添加胎牛血清或者生長因子的含量和種類也不盡一致，傳代培養(yǎng)的方案也不完全相同。由于胎牛血清的成分的復(fù)雜性和對結(jié)果的不可預(yù)知性，目前在干細(xì)胞培養(yǎng)過程中，大多采用低血清甚至是無血清的培養(yǎng)基來進行培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)方法的進一步成熟有望統(tǒng)一干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，也為干細(xì)胞的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

1.2臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多潛能干細(xì)胞，具有很強的生命力，并且在體外一定的誘導(dǎo)條件下可以分化為各種神經(jīng)樣細(xì)胞。近年來利用臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)樣細(xì)胞實驗研究比較多。目前常用的誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)方法包括以下幾種:(1)生長因子類，包括bFGF、EGF、BNGF和RA等；(2)抗氧化劑類，包括DMSO、β-巰基乙醇、黃芪苷、丹參提取物、枸杞多糖等；(3)基因轉(zhuǎn)染，通過一些基因諸如Noggin、Notch等在臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)來獲得神經(jīng)樣細(xì)胞；(4)細(xì)胞共培養(yǎng)，即采用與神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或者其他類神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，通過細(xì)胞之間分泌的有關(guān)生長或者營養(yǎng)因子、細(xì)胞信號等來誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞。

有學(xué)者分別報道了臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可誘導(dǎo)表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物以來[2-3]，許多學(xué)者采用不同的誘導(dǎo)方法都成功地誘導(dǎo)獲得了神經(jīng)樣細(xì)胞。如Arien-Zakay等[5]采用IFN-gamma誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)IFN-gamma可以提高臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化，并且可以增強β-tubulin、MAP-2、NF-M、NSE等神經(jīng)標(biāo)志物表達(dá)。而Li等[6]采用10 μmol/L全反式維甲酸誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞12 d后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞呈現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，并且表達(dá)TH和DAT多巴胺神經(jīng)標(biāo)志物。Slovinska等[7]采用磁珠細(xì)胞分選法獲得CD133+和CD133-兩種細(xì)胞，采用EGF和bFGF誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)兩者都可以誘導(dǎo)表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物，并且CD133+細(xì)胞表達(dá)MAP2、RIP和S100的陽性率要比CD133-細(xì)胞高。

而Yang等[8]采用細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，通過羊膜上皮細(xì)胞分泌的多效生長因子刺激臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，從而獲得多巴胺神經(jīng)元。Devarajan等[9]采用腺病毒作為載體通過表達(dá)Atoh1首次誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞為聽毛細(xì)胞樣細(xì)胞。隨后，管讓憲等[10]證明了中藥黃芩苷體外誘導(dǎo)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的可行性。黃仕雄等[11]則采用體外轉(zhuǎn)染的方法，用Nurr1基因修飾人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞，成功分化為多巴胺神經(jīng)元。最近，Divya等[12]采用免疫熒光、熒光激活細(xì)胞篩選和PCR的方法研究發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞存在兩種細(xì)胞群體，兩者都表達(dá)CD29和CD105，一種細(xì)胞群體具有與生俱來的神經(jīng)形成潛力，同時表達(dá)Oct4、Nanog、Sox2、ABCG2等多潛能干細(xì)胞標(biāo)志物和神經(jīng)外胚層標(biāo)志物nestin，在簡單的刺激下可以像神經(jīng)細(xì)胞分化；而另一種細(xì)胞群體則表現(xiàn)為間充質(zhì)特性，需要多種生長因子刺激下才能分化為神經(jīng)細(xì)胞。

2 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究

臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞作為最有潛力的多潛能干細(xì)胞之一，其來源豐富、采集方便、安全、無倫理問題，且具有免疫調(diào)節(jié)作用等特點，決定了其在臨床治療方面具有很大的應(yīng)用前景。目前干細(xì)胞的臨床應(yīng)用有兩種方法：一是直接將臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞移植體內(nèi)，通過體內(nèi)的微環(huán)境誘導(dǎo)其為相應(yīng)的細(xì)胞，發(fā)揮相應(yīng)的作用；二是將臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)、定向誘導(dǎo)其分化為目的神經(jīng)樣細(xì)胞，然后通過一定的方法植入到體內(nèi)，治療相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

2.1在腦部損傷中的治療作用 2001年Chen等[13]在腦卒中行為缺陷的大鼠模型中，靜脈注射人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)大鼠的行為缺陷行為有明顯的改善。證明臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞對腦損傷疾病有一定的治療作用。隨后，Kim等[14]在大鼠幼鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在治療永久性大腦中動脈閉塞引起的重度腦損傷也有很好的治療作用。2013年，Ahn等[15]將1×105個臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞注射到腦出血的SD大鼠的側(cè)腦室部位，發(fā)現(xiàn)由腦室內(nèi)出血引起的出血性腦積水和腦損傷得到很好的改善。2010年Sun等[16]對184名兒童進行了自體臍帶血靜脈灌注治療神經(jīng)損傷，研究發(fā)現(xiàn)，自體臍帶血靜脈灌注治療兒童神經(jīng)損傷是安全可行的(除了有3名兒童存在灌注反應(yīng)外)，從而為臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞治療神經(jīng)損傷疾病提供了直接的臨床證據(jù)。

2.2在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中的治療作用 2001年Ende等[17-18]將人臍帶血細(xì)胞注射到過表達(dá)人阿爾茲海默病淀粉樣前體蛋白的小鼠體內(nèi)和亨廷頓氏舞蹈病的小鼠體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)這些小鼠的壽命有了明顯的延長，病情得到好轉(zhuǎn)。證明了臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在治療神經(jīng)變性疾病過程中發(fā)揮著重要作用。

2011年，Bigini等[19]研究發(fā)現(xiàn)，單邊腦室內(nèi)注射人臍帶血單核細(xì)胞到家族性肌萎縮脊髓側(cè)索硬化癥小鼠模型中可以延長小鼠的壽命；檢測發(fā)現(xiàn)臍帶血間充質(zhì)單核細(xì)胞存在于側(cè)腦室，可以保持4個月之久，同時分泌一些具有抗炎性的可以改善運動神經(jīng)元變性疾病的細(xì)胞因子和趨化因子。同年，Veeravalli等[20]將臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞用于顫抖性小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞可以存在并在腦內(nèi)遷移，髓鞘堿性蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，1個月后小鼠顫抖完全消失，很好的證明了臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在治療髓鞘脫落或髓鞘形成不足等神經(jīng)性疾病中有很好的作用。最近，Seo等[21]將臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞注射到發(fā)病之前的NPC小鼠的海馬組織，研究發(fā)現(xiàn)，死亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量下降，運動缺陷有所改善。

2.3在脊髓損傷中的治療作用 Kao等[22]采用關(guān)閉壓力在55 g的動脈鉗壓迫小鼠1 min致使小鼠脊髓損傷后，將小鼠分為椎板切除術(shù)組、椎板切除術(shù)+脊髓損傷+CD34-細(xì)胞組、椎板切除術(shù)+脊髓損傷+CD34+細(xì)胞組和椎板切除術(shù)+脊髓損傷+生理鹽水四組，CD34細(xì)胞核生理鹽水通過尾靜脈注射。研究發(fā)現(xiàn)，來源于人臍帶血的CD34+細(xì)胞通過刺激產(chǎn)生VEGF和GDNF，對脊髓損傷引起的脊髓梗塞、細(xì)胞凋亡和后肢功能異常具有很好的治療作用。而Cho等[23]首先將臍帶血祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化成神經(jīng)祖細(xì)胞，隨后移植到脊髓損傷的SD小鼠中10周后發(fā)現(xiàn)，小鼠在行動方面有了明顯的改觀，肢體感覺誘發(fā)性電位得到回升，并且這些移植的細(xì)胞在壞死穴周圍呈現(xiàn)少突細(xì)胞表型，這些結(jié)果表明由臍帶血衍生的神經(jīng)祖細(xì)胞對神經(jīng)損傷具有一定的治療作用。2009年，Dasari等[24]在雄性大鼠脊髓損傷模型中研究發(fā)現(xiàn)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷過程中可以抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。隨后，Kaner等[25]在大鼠半切脊髓損傷模型中證明臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在脊髓損傷疾病中的治療具有很好的效果。

最近，Schira等[26]將一種從人臍帶血中分離出來的明確已知的無限制的成體干細(xì)胞移植到一只脊索嚴(yán)重?fù)p傷的免疫抑制成年大鼠的第8胸椎背部半切損傷部位附近，檢測后發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞生長因子在體內(nèi)發(fā)生定向移動，并在損傷部位聚集，傷口明顯變小，并且有利于軸突再生和顯著的功能性運動改善。

3 展 望

臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有多分化潛能的特性，而且來源豐富、采集方便、安全、無倫理問題，且具有免疫調(diào)節(jié)作用，使其比胚胎干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有更好的臨床應(yīng)用前景，有可能成為治療人類遺傳疾病特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的種子細(xì)胞。但其中還存在著一些問題亟待解決:(1)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性還不甚清楚，至今還沒有分離鑒定臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的統(tǒng)一的特異性標(biāo)志,對臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化造成了很大的障礙。(2)當(dāng)前培養(yǎng)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的條件還不甚一致。只有采用一致的和標(biāo)準(zhǔn)的無血清培養(yǎng)才能夠為進一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。(3)在體外誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化方面，技術(shù)還不是很成熟。譬如向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化，雖然各種各樣的方法都可以成功獲得神經(jīng)樣細(xì)胞，但各種方法誘導(dǎo)的效率并不高，尚不能有效地獲得單一種類的神經(jīng)元細(xì)胞，這給進一步臨床應(yīng)用造成很大的不便。(4)成功誘導(dǎo)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞為神經(jīng)元樣細(xì)胞的機制還不很清楚，這方面的研究還處于初級階段。(5)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面還處于動物實驗階段，距離臨床應(yīng)用還有一定的距離。

總之，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞作為最有潛力的多潛能干細(xì)胞，具有多向分化潛能，在體外能夠定向誘導(dǎo)分化為各種神經(jīng)細(xì)胞，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路。

參考文獻:

[1] Erices A,Conget P,Minguell JJ.Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood[J].Br J Haematol,2000,109(1):235-242.

[2] Sanchez-Ramos JR,Song S,Kamath SG,et al.Expression of neural markers in human umbilical cord blood[J].Exp Neurol,2001,171(1):109-115.

[3] Buzanska L,Machaj EK,Zablocka B,et al.Human cord blood derived cells attain neuronal and glia features in vitro[J].J Cell Sci,2002,115(10):2131.

[4] 段軼潷，喬鑫，稅青林．臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化的研究進展[J]．西南軍醫(yī)，2009，11(5)：939-941．

[5] Arien-Zakay H,Lecht S,Bercu MM,et al.Interferon-gamma-induced neuronal differentiation of human umbilical cord blood-derived progenitors[J].Leukemia,2009,23(10):1790-1800.

[6] Li X,Li H,Bi J,et al.Human cord blood-derived multipotent stem cells(CB-SCs) treated with all-trans-retinoic acid(ATRA) give rise to dopamine neurons[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,419(1):110-116.

[7] Slovinska L,Novotna I,Kubes M,et al.Umbilical cord blood cells CD133+/CD133-cultivation in neural proliferation media differentiates towards neural cell lineages[J].Arch Med Res,2011,42(7):555-562.

[8] Yang S,Xue DD,Wu B,et al.Pleiotrophin is involved in the amniotic epithelial cell-induced differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into dopaminergic neuron-like cells[J].Neurosci Lett,2013,539:86-91.

[9] Devarajan K,Forrest ML,Detamore MS,et al.Adenovector-mediated gene delivery to human umbilical cord mesenchymal stromal cells induces inner ear cell phenotype[J].Cell Reprogram,2013,15(1):43-54.

[10] 管讓憲，顏小華，陳啟文．中藥單體黃芩苷體外誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化[J]．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13(14)：2787-2792．

[11] 黃仕雄，劉軍，文國強，等．Nurrl基因修飾人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞源性多巴胺能神經(jīng)元移植治療帕金森病[J]．中山大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2009，30(5)：522-526．

[12] Divya MS,Roshin GE,Divya TS,et al.Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells consist of a unique population of progenitors co-expressing mesenchymal stem cell and neuronal markers capable of instantaneous neuronal differentiation[J].Stem Cell Res Ther,2012,3(6):57.

[13] Chen J,Sanberg PR,Li Y,et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats[J].Stroke,2001,32(11):2682-2688.

[14] Kim ES,Ahn SY,Im GH,et al.Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell transplantation attenuates severe brain injury by permanent middle cerebral artery occlusion in newborn rats[J].Pediatr Res,2012,72(3):277-284.

[15] Ahn SY,Chang YS,Sung DK,et al.Mesenchymal stem cells prevent hydrocephalus after severe intraventricular hemorrhage[J].Stroke,2013,44(2):497-504.

[16] Sun J,Allison J,McLaughlin C,et al.Differences in quality between privately and publicly banked umbilical cord blood units:a pilot study of autologous cord blood infusion in children with acquired neurologic disorders[J].Transfusion(Paris),2010,50(9):1980-1987.

[17] Ende N,Chen R,Ende-Harris D.Human umbilical cord blood cells ameliorate Alzheimer′s disease in transgenic mice[J].J Med,2001,32(3/4):241-247.

[18] Ende N,Chen R.Human umbilical cord blood cells ameliorate Huntington′s disease in transgenic mice[J].J Med,2001,32(3/4):231-240.

[19] Bigini P,Veglianese P,Andriolo G,et al.Intracerebroventricular administration of human umbilical cord blood cells delays disease progression in two murine models of motor neuron degeneration[J].Rejuvenation Res,2011,14(6):623-639.

[20] Veeravalli KK,Dasari VR,Fassett D,et al.Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells upregulate myelin basic protein in shiverer mice[J].Stem Cells Dev,2011,20(5):881-891.

[21] Seo Y,Yang SR,Jee MK,et al.Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells protect against neuronal cell death and ameliorate motor deficits in Niemann Pick type C1 mice[J].Cell Transplant,2011,20(7):1033-1047.

[22] Kao CH,Chen SH,Chio CC,et al.Human umbilical cord blood-derived CD34+cells may attenuate spinal cord injury by stimulating vascular endothelial and neurotrophic factors[J].Shock,2008,29(1):49-55.

[23] Cho SR,Yang MS,Yim SH,et al.Neurally induced umbilical cord blood cells modestly repair injured spinal cords[J].Neuroreport,2008,19(13):1259-1263.

[24] Dasari VR,Veeravalli KK,Tsung AJ,et al.Neuronal apoptosis is inhibited by cord blood stem cells after spinal cord injury[J].J Neurotrauma,2009,26(11):2057-2069.

[25] Kaner T,Karadag T,Cirak B,et al.The effects of human umbilical cord blood transplantation in rats with experimentally induced spinal cord injury[J].J Neurosurg Spine,2010,13(4):543-551.

[26] Schira J,Gasis M,Estrada V,et al.Significant clinical,neuropathological and behavioural recovery from acute spinal cord trauma by transplantation of a well-defined somatic stem cell from human umbilical cord blood[J].Brain,2012,135(Pt 2):431-446.