慢病毒載體包裝與生產(chǎn)方法

蔡晶晶，宋小平，嚴(yán)繼貴，王雅潔

（安徽醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，安徽合肥230601）

慢病毒是在人類(lèi)免疫缺陷I型病毒（HIV－1）基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的基因治療載體，具有攜帶基因片段容量大、轉(zhuǎn)染效率高、宿主范圍廣、長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已經(jīng)成為轉(zhuǎn)移目的基因的理想載體并用于臨床治療，截止2013年1月已經(jīng)有62例慢病毒介導(dǎo)的基因治療臨床試驗(yàn)開(kāi)展。由于1次基因治療需要1012TU的病毒總量，提高慢病毒的包裝與生產(chǎn)水平可有效的促進(jìn)慢病毒介導(dǎo)的基因治療的發(fā)展［1］。

由于安全性等因素，慢病毒載體逐步改進(jìn)，現(xiàn)已發(fā)展至第三代的四質(zhì)粒系統(tǒng)，其一般構(gòu)建流程是將病毒包裝必需的3個(gè)蛋白Gag／Pol、Rev、VSV－G（代替HIV－1的Env）分別獨(dú)立放置在3個(gè)質(zhì)粒上，目的基因的載體構(gòu)建在質(zhì)粒p Lenti－gene上，然后將四質(zhì)粒按比例共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)后收集上清，純化病毒。病毒滴度的高低受很多因素的影響，本文就慢病毒質(zhì)粒提取、病毒包裝、細(xì)胞培養(yǎng)、病毒純化等方面對(duì)提高慢病毒滴度的研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 慢病毒質(zhì)粒提取的優(yōu)化

病毒載體構(gòu)建的首要環(huán)節(jié)是慢病毒質(zhì)粒的提取，質(zhì)粒的濃度、純度和構(gòu)象直接影響后繼的轉(zhuǎn)化率及病毒滴度。慢病毒質(zhì)粒提取試劑盒基本可以達(dá)到慢病毒包裝的要求，但提取量較少，有研究者將改良后的堿裂解法與中空纖維超濾、分子排阻層析等純化方法結(jié)合用于慢病毒大規(guī)模生產(chǎn)，可獲得大量濃度高、純度好的質(zhì)粒DNA［2］。此外，病毒包裝中的衣殼蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶和包膜蛋白的增加主要是通過(guò)調(diào)節(jié)包裝質(zhì)粒的比例來(lái)實(shí)現(xiàn)，不同質(zhì)粒的比例會(huì)很大程度影響質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和慢病毒包裝的效率。雖然有關(guān)于4個(gè)質(zhì)粒比例的報(bào)道，但不同研究結(jié)果之間差距較大［2－3］，需要在不同的實(shí)驗(yàn)條件下研究確定。

2 慢病毒包裝方法

病毒包裝主要有瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與構(gòu)建穩(wěn)定包裝細(xì)胞系2種方法，目前用于基因治療臨床試驗(yàn)的慢病毒主要采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

2.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的選擇

為提高病毒滴度，研究人員多選用具有較高的病毒包裝能力的293 T細(xì)胞，該細(xì)胞可表達(dá)SV40大T抗原，含有SV40復(fù)制起始點(diǎn)的質(zhì)粒可以復(fù)制。293T細(xì)胞在相同實(shí)驗(yàn)條件下產(chǎn)生的病毒滴度是HEK293細(xì)胞的4倍，且293T細(xì)胞可以馴化成無(wú)血清適應(yīng)的懸浮細(xì)胞，有利于病毒包裝的擴(kuò)大培養(yǎng)［4］。

2.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法

常用的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法有磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、聚乙烯亞胺法（PEI）、電穿孔法等。磷酸鈣沉淀法安全，價(jià)格低廉，大規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用較多，不足之處是細(xì)胞培養(yǎng)需要加入血清來(lái)降低磷酸鈣對(duì)細(xì)胞的毒性，且該法受到培養(yǎng)基p H的影響非常大，在實(shí)驗(yàn)中對(duì)溶液配制及實(shí)驗(yàn)操作要求很高［5］；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法病毒滴度產(chǎn)量高，所需細(xì)胞量只為磷酸鈣轉(zhuǎn)染的1／3，但該法價(jià)格昂貴，難以用于工業(yè)的大規(guī)模推廣［6－7］；PEI轉(zhuǎn)染法所獲的病毒產(chǎn)量比磷酸鈣轉(zhuǎn)染法高，且細(xì)胞培養(yǎng)中不需更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染效率受培養(yǎng)基p H的影響小，但是PEI－質(zhì)粒復(fù)合物對(duì)細(xì)胞也有一定的毒性，可通過(guò)調(diào)整PEI含氮量與DNA中磷酸含量的比值（如N／P＝20）來(lái)確定PEI的用量，提高轉(zhuǎn)染效率［8－9］；電穿孔法更適合于懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的病毒量可達(dá)108TU／ml［10］。此外待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的密度與生長(zhǎng)狀態(tài)也是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素，一般需選擇傳代次數(shù)低，處生長(zhǎng)旺盛期，轉(zhuǎn)染時(shí)的存活率90%以上，最佳匯合度60%～70%［11］。

2.3 慢病毒穩(wěn)定包裝細(xì)胞系的建立

大量研究證實(shí)慢病毒可以在穩(wěn)定細(xì)胞系中包裝產(chǎn)生，但是基于安全考慮，在慢病毒的大規(guī)模生產(chǎn)中尚未使用，多處實(shí)驗(yàn)室研究階段。Stor naiuolo A等［12］針對(duì)第三代慢病毒載體構(gòu)建了同時(shí)具有Gag／Pol、Rev、Tat、Rd114－tr等慢病毒元件轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細(xì)胞克隆，建立了穩(wěn)定的包裝系以方便產(chǎn)生假型化慢病毒。Broussau S等［13］人建立了穩(wěn)定的293SF病毒包裝細(xì)胞系，將VSVG構(gòu)建在四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)及cu mate基因開(kāi)關(guān)上，此雙重調(diào)控避免了包膜蛋白VSVG的過(guò)量表達(dá)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，該細(xì)胞系可在無(wú)選擇壓力下產(chǎn)生高滴度病毒長(zhǎng)達(dá)18周，病毒滴度達(dá)8.0×106TU／ml，有望用于基因治療臨床試驗(yàn)的慢病毒生產(chǎn)中。

3 細(xì)胞培養(yǎng)方法

3.1 貼壁細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)

轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞是目前基因治療中用慢病毒大規(guī)模生產(chǎn)的主要方式，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法主要有細(xì)胞工廠、微載體培養(yǎng)等。細(xì)胞工廠結(jié)構(gòu)緊密，受污染風(fēng)險(xiǎn)低，常用的細(xì)胞工廠有2、4、10層，目前已有報(bào)道［4］40層的案例，一批即可收獲50L的病毒液。細(xì)胞工廠內(nèi)注入的培養(yǎng)液體積與表層面積之比一般為0.1 ml／cm2～0.16 ml／cm2，此比例有利于產(chǎn)生較高的病毒滴度［14］。同時(shí)為提高慢病毒生產(chǎn)過(guò)程中的無(wú)菌與安全性，有設(shè)計(jì)將若干收集包管道連接于細(xì)胞工廠上，負(fù)責(zé)提供轉(zhuǎn)染混合物、細(xì)胞培養(yǎng)液及收集樣品，該系統(tǒng)能降低產(chǎn)品污染的風(fēng)險(xiǎn)，適用于系統(tǒng)、大規(guī)模的慢病毒生產(chǎn)［2］。微載體也可實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，但有研究指出該法產(chǎn)生的病毒量要低于細(xì)胞瓶培養(yǎng)法［15］。

3.2 懸浮細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)

Segura等［16］首次報(bào)道了用生物反應(yīng)器進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染后的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，成功的將細(xì)胞種子轉(zhuǎn)接到3 L生物反應(yīng)器中，并在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的3～6d里產(chǎn)量達(dá)1.1×106TU／ml；Witting SR等［10］用2 L的Wave搖袋式生物反應(yīng)器進(jìn)行慢病毒包裝細(xì)胞的培養(yǎng)，2d內(nèi)慢病毒總量達(dá)2×1011TU，并可通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)袋的體積來(lái)進(jìn)一步放大培養(yǎng)。此外一些化學(xué)物質(zhì)也會(huì)提高慢病毒的產(chǎn)量，如在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入2～20 m M的丁酸鈉或是2～4 m M的咖啡因都會(huì)提高慢病毒的產(chǎn)量［9，17］。

4 慢病毒的純化

實(shí)驗(yàn)室用的慢病毒，通常是經(jīng)過(guò)超速離心收獲到的病毒粗品，含有的雜質(zhì)較多，不能用于基因治療，也不適應(yīng)慢病毒純化大規(guī)模生產(chǎn)化的要求。要達(dá)到人體基因治療的目的，慢病毒必須去除產(chǎn)品中的蛋白雜質(zhì)、DNA雜質(zhì)、內(nèi)毒素等來(lái)確保產(chǎn)物的質(zhì)量、安全性及有效性。

4.1 離心與膜分離

離心與膜分離技術(shù)用于目的產(chǎn)物的初步分離與濃縮，病毒通過(guò)超速離心，可使滴度提高102～103倍，但大體積、長(zhǎng)時(shí)間的離心產(chǎn)生的剪切力可能導(dǎo)致慢病毒顆粒破碎，所以在慢病毒大規(guī)模生產(chǎn)中，離心多用于膜分離等病毒原液的濃縮之后［2］。

膜分離技術(shù)適合病毒等熱敏性物質(zhì)的分離、濃縮，具高通量、低分辨率的特點(diǎn)。常用的超濾技術(shù)可快速進(jìn)行慢病毒粗液的濃縮，孔徑一般選擇100～500 k Da，可將病毒原液濃縮20～30倍［18］。該法的主要缺點(diǎn)是濾孔易堵塞，可采用一系列孔徑遞減的濾膜（如從0.8～0.45μm）來(lái)進(jìn)行過(guò)濾以解決這個(gè)問(wèn)題，也可用中空纖維切向流過(guò)濾裝置來(lái)濃縮慢病毒載體，滯留體積低，回收率高，且不易造成阻塞［17］。

4.2 核酸酶消化

慢病毒包裝過(guò)程中受到質(zhì)粒DNA及宿主細(xì)胞核酸的污染，在所有慢病毒生產(chǎn)中都使用核酸酶來(lái)除去核酸雜質(zhì)，核酸酶消化一般位于慢病毒純化方案的前期，因核酸酶作為生產(chǎn)過(guò)程中引入的雜質(zhì)，必須在后繼的純化步驟中除去，同時(shí)要考慮前期樣品體積大加入量多導(dǎo)致的高成本問(wèn)題。最終的病毒產(chǎn)品要經(jīng)過(guò)檢測(cè)確保無(wú)核酸酶殘留［19］。

4.3 層析

層析在生物分子的大規(guī)模純化中應(yīng)用非常廣泛，具有快速、分辨率高、可回收利用的特點(diǎn)。慢病毒在生理p H下呈負(fù)電荷，離子交換層析是慢病毒純化中最有效的層析方法，可高效除去雜蛋白與DNA，同時(shí)起到濃縮的作用。有報(bào)道用DEAE陰離子交換柱或Mustang Q膜層析純化可得到約65%的慢病毒收率，且該法適合放大生產(chǎn)［4，20］。

親和層析中目前能用于慢病毒純化的配體只有肝素，但該法因成本較高不適合大規(guī)模生產(chǎn)，且病毒收率低于離子交換層析，在慢病毒的純化方法中報(bào)道很少。

分子排阻層析一般用于慢病毒純化后的最后精制，該法僅以分子量為分離依據(jù)，溫和高效。慢病毒粒子大小約100n m，選擇合適的排阻極限可以將大于排阻極限的慢病毒與小分子雜質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，同時(shí)除鹽、除緩沖液，選擇合適的層析介質(zhì)及孔徑大小，可以得到70%～80%的慢病毒收率［20］。

慢病毒純化幾種方法聯(lián)用時(shí)，應(yīng)選擇不同機(jī)制的分離單元組成一套分離純化工藝。整個(gè)純化過(guò)程要在低溫下進(jìn)行以保證病毒活性，經(jīng)過(guò)純化后一般可除去大于99%的雜蛋白與核酸污染，最終得到的病毒滴度一般為108～109TU／ml［14］。

5 展望

慢病毒在臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用逐漸增多，基因治療對(duì)慢病毒效價(jià)的高要求也促使研究人員要從多方面來(lái)研究慢病毒包裝產(chǎn)量的提高途徑，后續(xù)可通過(guò)正交設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來(lái)優(yōu)化病毒包裝及生產(chǎn)的各個(gè)影響因素，以期得到更有效的病毒包裝與生產(chǎn)方案，同時(shí)提高產(chǎn)物的質(zhì)量與穩(wěn)定性。另外構(gòu)建安全有效的慢病毒穩(wěn)定包裝細(xì)胞系與質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)也是今后研究的重點(diǎn)，目前的慢病毒生產(chǎn)仍主要是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞，而慢病毒包裝細(xì)胞系的發(fā)展將推動(dòng)懸浮細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，這也將顯著提高慢病毒的生產(chǎn)能力。

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