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    瓊膠酶產(chǎn)生菌Stenotrophomonas sp.Z705的發(fā)酵條件優(yōu)化

    2014-03-26 12:21:38繆伏榮董志巖
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)酶浸膏牛肉

    繆伏榮,董志巖,劉 景

    (福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,福建 福州 350013)

    瓊膠(瓊脂)是存在于紅藻細(xì)胞壁中的一類多糖,是自然界中存在的重要碳源之一,是我國產(chǎn)量最大的海洋三大多糖(褐藻膠、瓊膠、卡拉膠)之一,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生物技術(shù)等領(lǐng)域[1]。瓊膠由中性的瓊膠糖(agarose)和離子性的硫瓊膠(agaropectin)組成,其中瓊膠糖是由1,3連接的β-D-半乳吡喃糖和1,4連接的3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳吡喃糖殘基反復(fù)交替連接的鏈狀中性多糖[2]。瓊膠黏度高、溶解度低,影響了其在各領(lǐng)域中的應(yīng)用;但瓊膠降解后可產(chǎn)生一定分子質(zhì)量和聚合度的瓊膠寡糖,這些寡糖具有良好的抗癌[3]、抗氧化[4]、抗病毒[5]、增強(qiáng)免疫[6]等藥理作用和生物活性。但由于未能找到有效降解瓊膠的途徑[7],因此長期以來瓊膠未能得到很好的開發(fā)利用。利用瓊膠酶降解瓊膠生產(chǎn)瓊膠寡糖,被認(rèn)為是當(dāng)今最理想的綠色環(huán)保生產(chǎn)技術(shù)。但由于瓊膠酶來源少、活性低、價(jià)格昂貴,難以滿足瓊膠寡糖生產(chǎn)的需要,因此,篩選高產(chǎn)瓊膠酶的菌株及研究其發(fā)酵產(chǎn)酶具有重要的實(shí)際意義。

    目前,已見報(bào)道的產(chǎn)瓊膠酶菌屬有Pseudomonas[8]、Pseudoalteromonas[9]、Streptomyces[10]、Alteromonas[11]、Vibrio[12]和Cytophaga[13]等。本試驗(yàn)從腐爛的紫菜中分離到1株高產(chǎn)瓊膠酶的菌株,并將其初步鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonassp.Z705[14], 目前國內(nèi)外尚未見該菌屬產(chǎn)瓊膠酶的相關(guān)報(bào)道。本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),對該菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶條件和培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化,旨在為瓊膠酶的深入研究以及瓊膠低聚糖的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    1.1.1 菌種來源 寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonassp.Z705,由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營養(yǎng)室提供。

    1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 純化培養(yǎng)基:牛肉膏5 g,酵母浸膏1.5 g,瓊脂15 g,陳海水1 000 mL,pH 7.2;121 ℃滅菌30 min。

    種子和發(fā)酵培養(yǎng)基:牛肉膏5 g,酵母浸膏1.5 g,瓊脂3 g,陳海水1 000 mL,pH 7.2。

    主要試劑有DNS試劑[15]、0.2 mol/L磷酸緩沖液[16]、瓊脂粉、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏等。

    1.1.3 主要儀器 主要儀器有DY-89Ⅱ電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)、LRH-250A生化培養(yǎng)箱、SW-CJ-1FD單人超凈工作臺(tái)、熱電multican fc 酶標(biāo)儀、TDL-5000B高速冷凍離心機(jī)、DY-ⅢS水質(zhì)分析儀、FW-80高速萬能粉碎機(jī)、LDZS-30KBS立式高壓滅菌器、CRY-200恒溫?fù)u床等。

    1.2 菌株的培養(yǎng)

    1.2.1 純化培養(yǎng) 將Stenotrophomonassp.Z705劃菌斜面置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d,然后置于4 ℃冰箱中保存。

    1.2.2 種子培養(yǎng) 在250 mL三角瓶中裝入25 mL種子培養(yǎng)基,121 ℃滅菌30 min后,取培養(yǎng)好的斜面挑取1環(huán)于種子培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

    1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 在250 mL三角瓶中裝入25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,121 ℃滅菌30 min后,按體積分?jǐn)?shù)0.1%的接種量接入種子液,28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)23 h。

    1.3 瓊膠酶活力的測定

    發(fā)酵培養(yǎng)11 h開始每2 h對發(fā)酵液取樣1次。發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心5 min,其上清液即為粗酶液。根據(jù)Imoto等[17]的方法,通過DNS-還原糖法測定發(fā)酵液的酶活,用D-半乳糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]。取粗酶液1 mL加入磷酸緩沖液1 mL,再加入0.3 g/L的瓊膠底物溶液1 mL,50 ℃水浴酶解30 min后再于沸水浴中滅活5 min,立即用冰水冷卻至室溫,然后加入1.5 mL的DNS試劑;在沸水浴中保溫顯色5 min后,于室溫下定容至10 mL,20 ℃、2 000 r/min離心5 min得上清液,用酶標(biāo)儀測其在520 nm波長處的吸光度;同時(shí)以滅活酶作對照。在上述反應(yīng)條件下,以1 mL酶液1 min產(chǎn)生1 μg還原糖作為1個(gè)酶活(U)。

    1.4 菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

    在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,按表1中的設(shè)計(jì)方案對發(fā)酵條件進(jìn)行單因素試驗(yàn),分析不同因素對菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶活力的影響,其他培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基相同,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

    1.5 菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

    1.5.1 單因素試驗(yàn) 首先,在獲得菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵最佳條件的基礎(chǔ)上,分析不同氮源(牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨、NaNO3、(NH4)2SO4)和碳源(葡萄糖、D-半乳糖、瓊膠、果糖、麥芽糖)對菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶活力的影響;在篩選到最佳氮源(牛肉膏、酵母浸膏)以及最佳碳源(瓊膠)的基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素試驗(yàn),培養(yǎng)基中氮源和碳源添加水平見表1。

    表1 Stenotrophomonas sp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

    1.5.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇最佳氮源(牛肉膏、酵母浸膏)以及最佳碳源(瓊膠)等培養(yǎng)基組分,采用三因素三水平L9(33)的正交試驗(yàn)(表2)篩選最佳培養(yǎng)基組成。所有試驗(yàn)重復(fù)3次,分別平行取樣。用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    表2 Stenotrophomonas sp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化的正交試驗(yàn)方案

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

    2.1.1 裝液量和搖床轉(zhuǎn)速對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在微生物發(fā)酵過程中,溶氧量對好氧細(xì)菌的生長和產(chǎn)酶具有十分重要的作用。減少裝液量和增加搖床轉(zhuǎn)速均可以達(dá)到增加溶氧量的目的,使菌株快速地利用營養(yǎng)物質(zhì),從而有利菌株產(chǎn)酶。但溶氧量必須適度,過量供給會(huì)造成酶活力的下降。由圖1可以看出,在轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí),隨著裝液量的增加,瓊膠酶活力隨之升高,至裝液量為25 mL時(shí),瓊膠酶活力最高(37.8 U/mL);然后隨著裝液量的增加,瓊膠酶活力逐漸降低。從圖2可知,在裝液量為25 mL時(shí),隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高,瓊膠酶活力隨之升高,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí),瓊膠酶活力達(dá)到最高(35.6 U/mL);之后隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高,瓊膠酶活力逐漸降低??芍罴蜒b液量和搖床轉(zhuǎn)速分別為25 mL和200 r/min。

    2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 由圖3可見,在裝液量25 mL和搖床轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下,培養(yǎng)11 h時(shí)瓊膠酶活力為5.6 U/mL;隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,瓊膠酶活力逐漸提高,至23 h瓊膠酶活力達(dá)到最高(45.2 U/mL);之后隨著發(fā)酵時(shí)間增加,瓊膠酶活力逐漸下降。表明最佳發(fā)酵時(shí)間為23 h。

    2.1.3 初始pH值對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 海水的pH為7.2~8.3,海洋細(xì)菌最適宜生長的pH值與此關(guān)系密切。培養(yǎng)物的pH不僅直接影響菌體對營養(yǎng)物的吸收及代謝產(chǎn)物的分泌,而且影響營養(yǎng)物的分解。從圖4可以看出,在培養(yǎng)基的初始pH值為6.4時(shí),瓊膠酶活力為0.6 U/mL,隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高,Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶活力逐漸提高,當(dāng)初始pH值為7.2時(shí)達(dá)到最高(46.3 U/mL);之后隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高,瓊膠酶活力逐漸下降。表明最佳初始pH值為7.2。

    2.1.4 培養(yǎng)溫度對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 培養(yǎng)溫度是影響微生物生長和代謝的最重要的環(huán)境因素之一。適當(dāng)?shù)靥岣吲囵B(yǎng)溫度有助于促進(jìn)微生物的生長和酶促反應(yīng)。從圖5可以看出,在培養(yǎng)溫度為20 ℃時(shí),瓊膠酶活力為17.53 U/mL,隨著培養(yǎng)溫度的升高,Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶活力逐漸提高,當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí),瓊膠酶活力最高(43.8 U/mL);之后隨著培養(yǎng)溫度升高,瓊膠酶活力下降??芍罴雅囵B(yǎng)溫度為28 ℃。

    2.1.5 鹽度對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 鹽度與海洋細(xì)菌的生長密切相關(guān),是區(qū)分海洋菌與淡水菌的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)改變培養(yǎng)基的鹽度,來研究該菌株產(chǎn)酶最適的鹽度。從圖6可以看出,隨著發(fā)酵培養(yǎng)基鹽度的升高,Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶活力逐漸提高,至發(fā)酵鹽度為3.4%時(shí)達(dá)最高(43.2 U/mL);之后隨著發(fā)酵液鹽度的升高,瓊膠酶活力逐漸下降。表明此菌株是典型的海洋細(xì)菌,具有耐高滲透壓的特性,發(fā)酵培養(yǎng)的最佳鹽度為3.4%。

    圖1 裝液量對Stenotrophomonas sp.Z705菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的影響

    圖3 發(fā)酵時(shí)間對Stenotrophomonas sp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶的影響

    圖5 培養(yǎng)溫度對Stenotrophomonas sp.Z705菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的影響

    2.2 菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

    2.2.1 氮源對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 圖7顯示,以牛肉膏作為氮源時(shí),Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶活力最大,其次為酵母浸膏。因此,分別選用牛肉膏和酵母浸膏作為氮源,研究其對Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶活力的影響。從圖8可以看出,隨著牛肉膏添加量的增加,瓊膠酶活力逐漸提高,至牛肉膏添加量為5.0 g/L時(shí),瓊膠酶活力最高(45.6 U/mL);之后隨著牛肉膏添加量升高,瓊膠酶活力下降。由圖9可見,隨著酵母浸膏添加量增加,瓊膠酶活力逐漸提高,當(dāng)酵母浸膏添加量為1.50 g/L時(shí),瓊膠酶活力最高(41.8 U/mL);之后隨著酵母浸膏添加量的增加,瓊膠酶活力下降。

    圖7 不同氮源對Stenotrophomonas sp.Z705菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的影響

    圖8 牛肉膏添加量對Stenotrophomonas sp.Z705菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的影響

    2.2.2 碳源對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 碳源是微生物生長和發(fā)酵過程中必需的營養(yǎng)物。它不僅可為微生物生長繁殖提供能量,還可為菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物提供所需的碳成分。本研究中,不同碳源對Stenotrophomonassp.Z705菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的影響見圖10和圖11。

    圖10 不同碳源對Stenotrophomonas sp.Z705菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的影響

    圖10顯示,以瓊膠作為惟一碳源時(shí),發(fā)酵液培養(yǎng)Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶的活力最高。因此,選用瓊膠作為碳源,研究其對Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶活力的影響。從圖11可以看出,隨著瓊膠添加量的升高,瓊膠酶活力逐漸提高,瓊膠添加量為0.30 g/L時(shí)瓊膠酶活力達(dá)到最高(43.5 U/mL);之后隨著瓊膠添加量的升高,瓊膠酶活力逐漸降低。這可能是因?yàn)殡S著瓊膠添加量的增加,培養(yǎng)基的流動(dòng)性變差,發(fā)酵液通氣量降低,從而影響了菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶性能。

    2.3 菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化的正交試驗(yàn)

    從單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看出,Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶的最佳發(fā)酵條件為:裝液量25 mL、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、發(fā)酵時(shí)間23 h、初始pH 7.2、發(fā)酵溫度28 ℃、鹽度3.4%;發(fā)酵培養(yǎng)基中的牛肉膏、酵母浸膏和瓊膠對該菌株的產(chǎn)酶影響較大。從表3和表4可見,影響Stenotrophomonassp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶活力的因素順序?yàn)锳(牛肉膏)>B(酵母浸膏)>C(瓊膠);同時(shí)各因素對該菌產(chǎn)酶水平均有顯著的影響(P<0.05),確定Stenotrophomonassp.Z705菌株發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成為A2B2C3,即牛肉膏5.0 g/L、酵母浸膏1.50 g/L、瓊膠0.30 g/L。結(jié)合最佳發(fā)酵條件,經(jīng)多次發(fā)酵試驗(yàn),該菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶活力穩(wěn)定在87.1 U/mL左右。

    表3 Stenotrophomonas sp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

    表4 Stenotrophomonas sp.Z705菌株產(chǎn)瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

    3 討 論

    微生物發(fā)酵產(chǎn)酶是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程,菌體不同的營養(yǎng)條件會(huì)直接影響菌體的代謝,從而影響酶的產(chǎn)量。要提高酶的產(chǎn)量,就必須對發(fā)酵產(chǎn)酶的條件進(jìn)行優(yōu)化[19]。不同的瓊膠酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)條件不相同,各種因素如培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)溫度、初始pH值、培養(yǎng)時(shí)間等都對產(chǎn)酶有很大的影響。本研究以來源于腐爛紫菜且具有較高瓊膠降解能力的野生菌株Stenotrophomonassp.Z705為出發(fā)菌株,以提高菌株的產(chǎn)酶活性為目的,對其產(chǎn)酶發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成進(jìn)行了優(yōu)化,確定Stenotrophomonassp.Z705菌株的最佳發(fā)酵條件為:裝液量25 mL、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、發(fā)酵時(shí)間23 h、初始pH 7.2、發(fā)酵溫度28 ℃、鹽度3.4%;最佳培養(yǎng)基組成為:牛肉膏5.0 g/L、酵母浸膏1.50 g/L、瓊膠0.30 g/L,在此條件下該菌株產(chǎn)酶效果最好,瓊膠酶活力最高。經(jīng)多次發(fā)酵試驗(yàn),該菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶活力穩(wěn)定在87.1 U/mL左右,與優(yōu)化前(平均酶活力為34.49 U/mL)相比提高了60.4%。

    與國內(nèi)外已報(bào)道的瓊膠酶產(chǎn)生菌相比,首先從酶活力方面而言,菌株NBRC102603[20]為56.89 U/mL,菌株HF3-04[21]為80.7 U/mL,Bacillussp.MK03[22]為14.1 U/mL,Vibriosp.JT0107[23]為66 U/mL,AgarivoransalbusYKW-34[24]為83 U/mL,均低于本研究中的Stenotrophomonassp.Z705菌株;其次從瓊膠酶活力達(dá)到最高時(shí)的發(fā)酵時(shí)間而言,MA-B22[25]需要60 h,Halomonassp.DT-3[26]需要36 h,而本研究供試菌株僅需23 h。目前我國尚未有工業(yè)化產(chǎn)瓊膠酶的菌株,所需產(chǎn)品均來自國外,價(jià)格昂貴,而本研究供試菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組分簡單低價(jià)、培養(yǎng)條件簡便,穩(wěn)定性好,具有一定的生產(chǎn)潛力,可為瓊膠酶的深入研究及瓊膠低聚糖的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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