石油污染脅迫下植株根區(qū)土壤微生物多樣性分析

王晨霞，來航線，韓 剛，李凱榮，韋小敏

(西北農林科技大學 a 資源環(huán)境學院,b 林學院,陜西 楊凌 712100)

近年來，隨著石油勘探開發(fā)和區(qū)域經濟的不斷發(fā)展，受石油污染的土壤面積不斷擴大，污染程度也日益增加[1]。有數據顯示，全世界每年約有800萬t石油進入環(huán)境，我國每年有近60萬t石油進入環(huán)境形成污染[2]。在遼河油田、勝利油田和冀東油田等新老重污染區(qū)，土壤中的原油含量已經達到或超過1.0×104mg/kg，甚至達1.0×105mg/kg[3]。由于石油中含有多種復雜的芳香烴，這些物質毒性大，并且進入土壤后難以去除，從而引起嚴重的環(huán)境問題[4-5]，因此石油污染土壤的修復已引起人們的高度關注。目前，國內外研究人員對石油污染土壤的生物修復進行了大量研究，業(yè)已篩選了許多石油降解菌，但對于石油污染脅迫下土壤微生物的群落組成和動態(tài)變化了解甚少[6-7]。Sanjeet等[8]研究表明，石油污染物的降解是微生物群落共同作用的結果。因此，研究石油污染脅迫對土壤微生物多樣性的影響至關重要。

用于測定土壤微生物多樣性的方法很多，傳統的研究方法主要包括微生物平板培養(yǎng)法、電鏡法、染色法等[9]。隨著分子生物學的發(fā)展，PLFA、Biolog微平板法、RFLP、T-RFLP等技術受到越來越多的關注[10]。目前，這些方法在石油污染土壤微生物多樣性的研究中均有所應用。不可否認的是，傳統的微生物平板培養(yǎng)計數法仍是一個評價污染脅迫效應的有效方法[11-12]，但這種方法過于粗放，因此只有將傳統平板培養(yǎng)法與現代生物技術結合，才能更加客觀全面地反映微生物群落結構的真實信息。Biolog微平板法是通過微生物對多種碳源底物的利用能力來反映微生物群落的功能多樣性，可比較全面地表征土壤微生物群落結構、總體代謝活性與功能信息，是目前已知的研究微生物代謝功能多樣性的有力方法[13-14]。

本研究將微生物平板培養(yǎng)法與Biolog微平板法相結合，輔以土壤微生物呼吸強度的測定，從多個角度探討石油污染脅迫下刺槐、油松、紫穗槐和沙棘4種耐性植株根區(qū)的土壤微生物多樣性，旨在了解石油污染脅迫土壤生物降解過程中起重要作用的微生物類群，以及從微生物角度為石油污染土壤生物修復時的植株選擇、評價等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試土壤 供試土壤 (黃綿土) 來自陜北安塞縣人為活動稀少的無污染荒草地，采樣深度0～20 cm。

1.1.2 供試原油 采自陜北安塞縣化子坪油區(qū)井口。

1.1.3 供試植株 依據陜西延安氣候和土壤條件，選取刺槐、油松、紫穗槐和沙棘4種耐性植株。

1.1.4 供試培養(yǎng)基 參照《微生物學實驗技術》，放線菌分離用高氏一號培養(yǎng)基，細菌分離用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，真菌分離用PDA培養(yǎng)基[15]。

1.2 供試土壤預處理

采用常規(guī)分析方法[16]，測定供試土壤的全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、速效磷、速效鉀、pH值和有機質等基本理化性質，測定結果見表1。

供試土壤去掉植物殘體和其他雜質，風干并過4 mm篩，測定土壤含水量后，裝入31 cm×23 cm×27 cm (上口直徑×底部直徑×高) 的塑料桶中，每桶裝土12.94 kg (以土壤干質量計)，按設計的石油污染脅迫水平采用完全混合的方式分別添加供試原油，使盆栽土壤的石油污染脅迫水平為0，5，10，15和20 g/kg。供試土壤與供試原油混合時不使用任何有機溶劑，混勻后靜置15 d。

表1 供試安塞黃綿土的理化性質

于2012年3月初，選取苗高、地徑相對一致，根系完整的供試植株幼苗統一截干后，植入前期所制備的不同石油污染脅迫水平的盆栽土壤中。每盆重復栽植3株供試植株幼苗，每種供試植株對各石油污染脅迫水平的處理設置6個重復，同時設置無盆栽植株的空白對照 (CK)。為防止天然降水，定植后將盆栽放置于可移動式防雨棚內，晴天正常光照并充分供水，保證各處理幼苗成活和正常生長。試驗中各盆栽土壤的水分含量控制在初始土壤田間持水量的75%。

1.3 試驗土樣的采集與處理

2012年8月末以混合采樣法采取試驗盆栽植株根區(qū)的土壤。所采集土樣去除根系和其他雜質后裝于自封袋內并編號，4 ℃低溫保存，用于后續(xù)試驗分析。

1.4 試驗方法

1.4.1 土壤微生物區(qū)系分析 試驗土樣用牛肉膏蛋白胨瓊脂、PDA及高氏一號培養(yǎng)基按梯度稀釋法培養(yǎng)，其中PDA培養(yǎng)基加體積分數 0.3% 乳酸調pH，高氏一號培養(yǎng)基加入80 mg/L K2Cr2O4抑制劑。培養(yǎng)周期結束后以四分法按每克干土質量菌落數(CFU/g) 計數。之后依據菌落培養(yǎng)特征觀察記錄不同微生物種類，并對培養(yǎng)特征相似的細菌進行革蘭氏染色鏡檢觀察，初步確定細菌種類。

1.4.2 土壤微生物群落呼吸強度的測定[17-18]微生物呼吸強度的測定采用酸堿滴定法。試驗中以每消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH 相當于2.2 mg CO2量為標準，計算各處理土壤呼吸作用的CO2釋放量，以土壤呼吸釋放CO2的毫克數 (CO2mg/g干土) 表征微生物群落的呼吸強度。

1.4.3 土壤微生物功能多樣性分析[19-20]將試驗土樣制備為土壤懸液，活化后按梯度稀釋法稀釋至10-3，接種于ECO生態(tài)測試板上。將接種好的測試板加蓋，于(25±1) ℃培養(yǎng)240 h，其間每隔24 h用Biolog自動讀數裝置于590 nm波長下讀取吸光度值。

(1) 土壤微生物對碳源利用的整體特征。采用ECO生態(tài)測試板上每孔顏色平均變化率，即590 nm波長下土壤微生物群落的平均吸光度值 (Average well-color development，AWCD) 來描述微生物對碳源利用的整體情況及利用活性。

(2) 土壤微生物多樣性指數(H′)。以ECO生態(tài)測試板培養(yǎng)96 h后測定的吸光度值為基礎，計算Shannon指數H′[21]來反映微生物群落代謝功能的多樣性。AWCD、Shannon指數H′按下式計算：

AWCD=∑(Ci-C0)/n，H′=-∑pilnpi。

式中：Ci為每個孔的吸光度值，C0為對照孔的吸光度值，n為碳源孔數；pi為第i孔相對吸光度值與整個平板相對吸光度值總和的比值[22]。

(3) 土壤微生物對6大類型碳源的利用特征。將ECO生態(tài)測試板上的31種碳源分成6大類型，分別為羧酸類7種、碳水化合物類10種、氨基酸類6種、多聚物類4種、胺類2種和酚酸類2種。土樣中微生物群落對6大類型碳源的利用特征以相對吸光度值ΔC(ΔC=C-C0，其中C表示各碳源類型吸光度值的平均值)來表征。

(4) 主成分分析。通過主成分分析 (Principal component analysis,PCA) 將ECO生態(tài)測試板中的31種碳源形成的描述群落代謝特征的多元向量變換為互不相關的主元向量 (PC1和PC2)，在降維后的主元向量空間中用點的位置直觀地反映不同微生物群落的代謝特征。

1.4.4 數據處理與分析 試驗數據通過Excel及SPSS18.0軟件進行統計與分析。

2 結果與分析

2.1 土壤微生物區(qū)系分析

土壤中可培養(yǎng)微生物 (細菌、真菌、放線菌) 的種類和數量是衡量土壤微生物區(qū)系狀況的重要指標[23]。本試驗使用3種固體培養(yǎng)基，用稀釋平板涂布法對土樣中可培養(yǎng)的微生物進行分離計數，以此表征可培養(yǎng)微生物群落組成的多樣性，結果見表2。

表2 不同石油污染脅迫水平下4種植株根區(qū)土壤中可培養(yǎng)微生物的種類及數量

由表2可以看出，在無石油污染脅迫時，栽有植株的根區(qū)土樣中，可培養(yǎng)微生物的種類與數量總和均高于無植株土樣，說明所栽植的4種植株均能夠增加土壤微生物多樣性；當石油污染脅迫水平逐漸提高時，不同植株根區(qū)土壤微生物多樣性的變化不同，說明4種植株對石油污染脅迫的抗性存在差異。如當石油污染脅迫水平為10 g/kg時，各植株根區(qū)土樣可培養(yǎng)微生物種類的多少排序為：刺槐>油松>沙棘>紫穗槐?？傮w來看，在石油污染脅迫水平提高時，刺槐植株對根區(qū)土壤中微生物多樣性的促進作用最強。

進一步分析表2數據發(fā)現，當石油污染脅迫水平在5～10 g/kg時，油松、沙棘、刺槐植株根區(qū)土壤微生物種類隨污染水平的提高而增加；當石油污染脅迫水平高于10 g/kg時，油松、沙棘、刺槐植株根區(qū)土壤微生物種類隨石油污染脅迫水平的提高而減少；說明5～10 g/kg石油污染脅迫水平能有效刺激油松、沙棘、刺槐植株根區(qū)土壤微生物的生長，但高水平石油污染脅迫會對部分土壤微生物產生毒害作用，抑制其生長，使得油松、沙棘、刺槐植株根區(qū)土壤微生物的種類減少。此外，由表2還可以看出，紫穗槐植株根區(qū)土壤微生物的種類在不同石油污染脅迫水平下的變化無規(guī)律性。

2.2 土壤微生物呼吸強度分析

土壤微生物呼吸作用是土壤微生物生命活動中釋放CO2的過程，其強弱變化是反映微生物活性及土壤生化強度的總指標[24-25]。本試驗采用酸堿滴定法對石油污染脅迫下不同植株根區(qū)土壤樣品的呼吸強度進行了測定，結果見圖1。由圖1可以看出，在無石油污染脅迫時，油松植株根區(qū)土壤微生物呼吸強度低于無植株對照土壤；當石油污染脅迫水平遞增到15 g/kg時，栽有植株的根區(qū)土壤微生物呼吸強度均略高于無植株對照土壤；當石油污染脅迫水平為20 g/kg時，栽有植株的根區(qū)土壤微生物呼吸強度明顯高于無植株對照土壤。說明試驗所栽植的4種植株對根區(qū)土壤微生物生長有刺激作用，且這種刺激作用在高水平石油污染脅迫下表現得更為明顯，這與區(qū)系分析中所得到的“試驗植株能夠增加石油污染脅迫下土壤微生物多樣性”的結論相一致。

圖1 不同石油污染脅迫水平對4種植株根區(qū)土壤微生物呼吸強度的影響

進一步分析發(fā)現，不同水平石油污染脅迫對各處理土壤微生物呼吸強度的作用不同。其中，無植株土壤微生物呼吸強度在0～5 g/kg石油污染脅迫水平內上升，其后逐漸減弱；油松與沙棘植株根區(qū)土壤微生物呼吸強度隨石油污染脅迫水平的增加表現出相似的變化趨勢：在0～10 g/kg石油污染脅迫水平，植株根區(qū)土壤微生物呼吸強度出現輕微波動，高于10 g/kg石油污染脅迫水平后逐漸上升，在15 g/kg 石油污染脅迫水平下達到最大值，其后隨石油污染脅迫水平的升高而下降；刺槐根區(qū)土壤微生物呼吸強度在0～10 g/kg石油污染脅迫水平逐漸下降，在10～20 g/kg石油污染脅迫水平逐漸增加；紫穗槐根區(qū)土壤微生物呼吸強度隨石油污染脅迫水平升高而增加，至10 g/kg石油污染脅迫水平時達到最大值，其后隨石油污染脅迫水平升高而降低(圖1)。

2.3 土壤微生物功能多樣性分析

2.3.1 土壤微生物對碳源利用的整體特征AWCD可以從功能代謝水平上揭示微生物群落結構的多樣性，是反映土壤微生物群落對碳源利用整體情況及利用活性的重要指標[26]。本研究用各植株根區(qū)土壤微生物平均吸光度值 (AWCD) 隨培養(yǎng)時間變化的趨勢，來表征不同石油污染脅迫水平下土壤微生物群落結構的多樣性，各植株根區(qū)土壤微生物群落培養(yǎng)過程中AWCD在不同石油污染脅迫水平下的變化趨勢見圖2～7。

圖2 無石油污染脅迫條件下不同植株根區(qū)土壤微生物群落培養(yǎng)過程中AWCD的變化

圖4 不同石油污染脅迫水平下油松根區(qū)土壤微生物群落培養(yǎng)過程中AWCD的變化

圖6 不同石油污染脅迫水平下沙棘根區(qū)土壤微生物群落培養(yǎng)過程中AWCD的變化

圖2為無石油污染脅迫條件下不同植株根區(qū)土壤微生物群落培育過程中AWCD的變化趨勢。由圖2可知，在無石油污染脅迫條件下，油松植株根區(qū)的AWCD明顯低于無植株的對照；沙棘植株根區(qū)的AWCD接近無植株的對照；刺槐與紫穗槐植株根區(qū)的AWCD均高于無植株的對照，說明刺槐與紫穗槐植株在一定程度上促進了根區(qū)土壤微生物對碳源的利用。

由圖3～7可以看出，不同石油污染脅迫水平下各處理的AWCD隨培養(yǎng)時間不斷增加；在不同石油污染脅迫水平下，各植株根區(qū)土壤微生物碳源利用的整體情況存在差異?？傮w上，各植株根區(qū)土壤微生物在5～10 g/kg石油污染脅迫水平下對碳源的利用能力較強，20 g/kg石油污染脅迫水平下碳源利用的能力較弱。結合微生物區(qū)系及呼吸強度的結果，推測造成這一現象的原因可能是，5～10 g/kg的石油污染脅迫為微生物生長提供了更多的碳源物質，從而刺激了微生物生長，但高水平的石油污染脅迫對微生物產生了一定程度的毒害作用，使微生物利用碳源的能力有所減弱。

2.3.2 微生物多樣性指數(H′) 的比較 多樣性指數可表征不同土壤微生物群落利用碳源類型的多少，即功能多樣性[27]。在不同石油污染脅迫水平下，各植株根區(qū)土壤微生物培養(yǎng)96 h時對碳源利用的H′見表3。由表3可以看出，在不同石油污染脅迫水平下，栽有植株的根區(qū)土壤微生物H′除油松、沙棘在10～15 g/kg石油污染脅迫水平時略低于無植株的對照外，在其余條件下均高于無植株對照。表明試驗中所栽植株均能夠有效提高根區(qū)土壤微生物的多樣性，在石油污染脅迫下，其對根區(qū)土壤微生物的多樣性具有保護作用。

表 3 不同石油污染脅迫水平下4種植株根區(qū)土壤微生物對碳源利用的H′

2.3.3 刺槐根區(qū)土壤微生物對6大類型碳源的利用特征AWCD值與H′在總體上反映了土壤中微生物群落的變化情況，但不能闡釋土壤中微生物群落碳源代謝的微觀信息。本研究進一步對土壤中微生物群落利用的碳源進行分類，并以相對吸光度值ΔC分析不同處理土樣中微生物群落對6大類型碳源的利用情況，以此反映土壤微生物的代謝功能[28]。由于ECO生態(tài)測試板培養(yǎng)96 h時，微生物對碳源的利用 (即ΔC) 的變化趨于穩(wěn)定，因此對碳源利用特征的描述選取96 h的ΔC進行表征[29]。由于在同一石油污染脅迫水平下，刺槐植株根區(qū)土壤微生物較其他3種植株既表現出代表性的變化趨勢，又具有更高活力，所以以刺槐植株根區(qū)土壤微生物的碳源利用特征為例進行分析，結果見圖8。

圖8 不同石油污染脅迫水平下刺槐根區(qū)土壤微生物對6類碳源的利用情況

由圖8可以看出，隨石油污染脅迫水平的提高，刺槐根區(qū)土壤微生物對碳水化合物類群的利用率逐漸降低，表明石油污染脅迫對根區(qū)土壤微生物利用碳水化合物類碳源產生了抑制作用；刺槐根區(qū)土壤微生物對多聚物類及胺類的利用趨勢類似，均先隨石油污染脅迫水平增加而提高，在10 g/kg石油污染脅迫水平時ΔC達到最大值，其后隨石油污染脅迫水平的增加利用率有所降低，表明一定水平的石油污染脅迫刺激了根區(qū)土壤中多聚物類群及胺類群微生物的生長，但過高水平的石油污染脅迫則會產生抑制作用；刺槐根區(qū)土壤微生物對羧酸類與酚酸類碳源利用的ΔC在5 g/kg石油污染脅迫水平時最大，20 g/kg石油污染脅迫水平時最小，酚酸類群此時的ΔC甚至為0，表明20 g/kg高石油污染脅迫水平對根區(qū)土壤中羧酸類群與酚酸類群微生物的生長產生了極強的抑制作用?？傮w上，一定水平的石油污染脅迫能夠促進根區(qū)土壤微生物對碳源的利用，但15～20 g/kg石油污染脅迫水平會對根區(qū)土壤微生物利用碳源產生抑制作用，其中20 g/kg石油污染脅迫水平對微生物類群產生的毒害作用最大，推測20 g/kg石油污染脅迫水平可能已經達到部分根區(qū)土壤微生物耐受的上限。

進一步分析發(fā)現，在同一石油污染脅迫水平下，刺槐根區(qū)土壤微生物利用不同碳源的程度有明顯差異：無石油污染脅迫條件下的優(yōu)勢群落結構為碳水化合物類群>多聚物類群>氨基酸類群；5 g/kg石油污染脅迫水平下的優(yōu)勢群落結構為碳水化合物類群>多聚物類群>酚酸類群；10 g/kg石油污染脅迫水平下的優(yōu)勢群落結構為多聚物類群>碳水化合物類群>胺類群；15～20 g/kg 石油污染脅迫水平下的優(yōu)勢群落結構為碳水化合物類群>多聚物類群>氨基酸類群(圖8)。由此可以看出，在同一石油污染脅迫水平下，刺槐植株根區(qū)土壤微生物偏向利用碳水化合物類和多聚物類碳源，推測該部分碳源可能是某些根區(qū)土壤微生物生長的必需物質。

2.3.4 土壤微生物功能多樣性的主成分分析 Biolog ECO生態(tài)測試板共有31種不同的碳源，即31個變量。如果評估微生物功能多樣性變化的過程中考慮全部變量，往往會使分析過程更為復雜，因此利用主成分分析法，通過對變量的分析整合，將其合并為若干個綜合變量，這些綜合變量具有較高的方差貢獻率，提取綜合變量中的若干個主成分就可以對整個樣本進行分析，以此達到降維并降低評估復雜性的目的[30]。本研究選取刺槐根區(qū)土壤微生物培養(yǎng)96 h后測得的吸光度值進行主成分分析，以貢獻率最高的主成分 (PC1和PC2) 在空間中的位置，描述不同石油污染脅迫水平下根區(qū)土壤微生物功能多樣性的差異，結果見圖9。

圖9 不同石油污染脅迫水平下刺槐根區(qū)土壤微生物功能多樣性的主成分分析

在PCA中，31個主成分因子中前13個因子的累計方差貢獻率達99.505%，從中提取可以聚集單一碳源變量數據變異的前2個主成分PC1和PC2，其累計方差貢獻率分別為33.70%，21.68%，因此認為這2個主成分可以表征不同石油污染脅迫水平下刺槐根區(qū)土壤微生物群落代謝能力的基本輪廓。由圖9可見，不同石油污染脅迫水平下的刺槐根區(qū)土壤微生物功能多樣性在主成分坐標體系中分布差異明顯。PC1的方差貢獻率最大，可將10 g/kg石油污染脅迫水平與0，20 g/kg石油污染脅迫水平明顯區(qū)分；其中，10 g/kg石油污染脅迫水平處于PC1的正端，在PC1軸上值達1.64。PC2可將0 g/kg石油污染脅迫水平與其他石油污染脅迫水平區(qū)分；其中，僅0 g/kg石油污染脅迫水平處于PC2正軸方向，在PC2軸上的值為1.74。

單一碳源在主成分PC1和PC2上的載荷因子，反映了主成分與該單一碳源利用的相關系數，載荷因子越大，表示該單一碳源對主成分的影響越大。表4顯示了不同石油污染脅迫水平下刺槐植株根區(qū)土壤微生物對31種碳源的利用情況在PC1及PC2上的載荷因子。由表4可知，單一碳源對PC1貢獻最大的6種碳源分別為2類氨基酸 (L-苯丙氨酸、L-絲氨酸)、3類多聚物 (吐溫40、吐溫80、肝糖)、1類羧酸 (D-半乳糖醛酸)，可見影響PC1的碳源主要為多聚物類和氨基酸類；單一碳源對PC2貢獻最大的6種碳源包含4類碳水化合物 (N-乙酰-D-葡萄糖胺、β-甲基-D-葡萄糖苷、α-D-乳糖、D-纖維二糖)、1類氨基酸 (L-精氨酸)、1類羧酸 (衣康酸)，可見影響PC2的碳源主要為碳水化合物類。

表4 刺槐植株根區(qū)土壤微生物對31種碳源利用情況的主成分載荷因子

3 討 論

本研究結果顯示，5～10 g/kg石油污染脅迫水平增加了土壤微生物的種類，且在該石油污染脅迫水平下土壤微生物對碳源的利用能力較強。岳冰冰等[31]的Biolog微平板分析結果顯示，石油污染明顯提高了土壤微生物群落的代謝活性，馬會強等[13]的研究也有類似的結果。李慧等[32]的研究認為，石油污染可顯著提高土壤微生物 (細菌、放線菌、真菌) 的數量。本試驗再次證實，一定水平的石油污染脅迫對土壤微生物多樣性具有促進作用。同時，本試驗發(fā)現，10 g/kg以上石油污染脅迫水平，對各植株根區(qū)土壤微生物的碳源利用具有抑制作用。原因可能是，高水平石油污染脅迫自身的毒害作用及其對原本適合大部分微生物生長的土壤理化條件的改變作用，使大部分微生物生長受到抑制，植株根區(qū)土壤中的大部分微生物難以適應這種高水平的石油污染脅迫。

本研究發(fā)現，栽有植株的根區(qū)土壤微生物多樣性及碳源利用能力整體高于無植株對照土壤，說明4種供試植株對土壤微生物多樣性具有一定的保護作用，這種保護作用在高水平石油污染脅迫下表現更為明顯，這一結論對環(huán)境保護及污染環(huán)境的修復具有重要的指導意義。推測供試植株對土壤微生物多樣性形成保護作用的原因可能為，植株根系降解了部分石油污染物質，減弱了石油污染對土壤中微生物的脅迫作用，維護了微生物的生長環(huán)境。本研究還發(fā)現，4種供試植株根區(qū)土壤微生物對石油污染脅迫具有不同的響應；其中，栽植刺槐的植株根區(qū)土壤微生物多樣性最為豐富，因此認為刺槐植株在石油污染土壤修復中占有優(yōu)勢。

4 結 論

4種供試植株均能提高石油污染脅迫下根區(qū)土壤微生物的多樣性，其中刺槐植株對根區(qū)土壤微生物多樣性的保護作用最強。因此從微生物角度來看，在石油污染土壤生物修復中選擇栽植刺槐植株將會具有較為理想的效果；5～10 g/kg石油污染脅迫水平能促進土壤微生物對碳源的利用，增加土壤微生物的種類，15～20 g/kg石油污染脅迫水平降低了土壤微生物的多樣性，對微生物生長產生毒害作用。

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