牦牛β-防御素5基因的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的抑菌活性

符 梅，熊顯榮，蘭道亮，李 鍵

(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

牦牛生活在青藏高原3 000～5 000 m海拔的高寒地帶，是高原地區(qū)牧民的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源，其對(duì)低溫、低氧、低壓的高原環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，能充分利用其他家畜難以利用的高山草原環(huán)境[1]。良好的高原生態(tài)環(huán)境保障了牦牛奶天然、綠色的品質(zhì)，純凈的奶源環(huán)境造就了綠色的牦牛奶。哺乳類動(dòng)物防御素是一類廣泛存在于哺乳類動(dòng)物體中的內(nèi)源性抗微生物肽，在宿主天然免疫過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)機(jī)體受外源病原體入侵時(shí)，可以激活機(jī)體的第一道防御屏障，啟動(dòng)機(jī)體先天性免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)。防御素除具有廣譜的抗細(xì)菌活性外，還對(duì)真菌、病毒等具有一定的抗性，且與一些傳統(tǒng)抗生素等具有協(xié)同抗微生物的作用。因其對(duì)機(jī)體無(wú)毒副作用，所以研究哺乳類動(dòng)物防御素在體內(nèi)、外的抗菌作用及其機(jī)理具有重要意義。防御素(Defensin)最早是由美國(guó)科學(xué)家Lehrer等[2]于1993年發(fā)現(xiàn)并命名的，并從人的嗜中性白細(xì)胞中分離純化得到3種陽(yáng)離子小肽，發(fā)現(xiàn)其具有特殊的生物學(xué)活性及功能。依據(jù)其半胱氨酸殘基位置及二硫鍵連接方式的不同，防御素可分為α、β和θ 3大類[3]。β-防御素(β-defensins)是肽抗生素中較為重要的一種，是具有廣譜抗菌活性的多功能肽，其抗菌譜包括革蘭氏陰性、陽(yáng)性菌，病毒和真菌[4-5]。 Diamond等[6]于1991年首次在牛的氣管黏膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)β-防御素，并將其命名為TAP，之后又在牛的舌黏膜上皮中發(fā)現(xiàn)了舌抗菌肽LAP。1993年，Selsted等[7]從牛的中性粒細(xì)胞中分離了13種β-防御素(BNBD1～BNBD13)。研究表明，TAP、LAP、BNBD1～BNBD13等β-防御素對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、克雷伯肺炎桿菌、綠膿桿菌和念珠菌屬等乳房炎病原菌有抗菌活性[8]。Goldammer等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在患乳房炎奶牛的乳腺組織中，β-防御素5的表達(dá)量是平時(shí)的4～13倍；原位雜交顯示，病原微生物可誘導(dǎo)局部感染區(qū)的乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)的β-防御素5的表達(dá)上升，進(jìn)一步證明β-防御素5在奶牛乳房炎的發(fā)生、預(yù)防過(guò)程中具有重要作用[10]。到目前為止，尚未見(jiàn)到關(guān)于牦牛β-防御素5方面的報(bào)道。本研究構(gòu)建了牦牛β-防御素5(BNBD5)基因的原核表達(dá)載體pET32-BNBD5，誘導(dǎo)BNBD5融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物的抗菌生物活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為防御素替代抗生素成為新型的抗菌藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)購(gòu)自天根(北京)公司。金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)由西南民族大學(xué)動(dòng)物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。pMD19-T克隆載體購(gòu)自TaKaRa(大連)公司，pET-32a(+)表達(dá)載體購(gòu)自Novagen公司。RNA提取Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen(北京)公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司。IPTG購(gòu)自天根(北京)公司，HisTrapTMFF蛋白純化柱購(gòu)自GE公司，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ和T4 DNA ligase連接酶均購(gòu)自NEB公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI已公布的黃牛BNBD5基因序列(登錄號(hào)：AJ278799)，利用Primer 5設(shè)計(jì)1對(duì)引物P1/P2。上游引物P1:5′-CGGGATCCGGATTTACTCAAGTAGTAAGAAATC-3′，下游引物P2：5′-CCCTCGAGTTACCACCTCCTGCAGCAT-3′，分別在上、下游引物5′端添加BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)(劃線部分)，并在其前端添加保護(hù)性堿基。引物由Invitrogen(上海)公司合成。

1.3 BNBD5基因的克隆與序列分析

取牦牛肺組織100 mg，加入1 mL Trizol液氮研磨提取總RNA，按照Promega試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以牦牛肺組織的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增BNBD5基因，擴(kuò)增體系為:ExTaq12.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板(1 500 ng/μL)1 μL，雙蒸水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸5 min。取6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在15 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行初步電泳鑒定。膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，經(jīng)PCR鑒定后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD19-BNBD5送Invitrogen(上海)公司進(jìn)行測(cè)序。用MEGA5.0軟件將牦牛BNBD5基因序列與其他動(dòng)物β-防御素5的mRNA序列進(jìn)行比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 BNBD5基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pMD19-BNBD5與原核表達(dá)載體pET-32a(+)分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，將牦牛BNBD5基因亞克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32-BNBD5，用其轉(zhuǎn)化DH5α，挑選克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，并提取重組表達(dá)載體進(jìn)行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，將陽(yáng)性質(zhì)粒送Invitrogen (上海)公司測(cè)序。

1.5 重組牦牛BNBD5蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET32-BNBD5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取單個(gè)菌落接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)的5 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，次日取培養(yǎng)物按照1∶100(體積比)的比例接種于50 mL含有Amp(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD600=0.6時(shí)，加入0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，于誘導(dǎo)不同時(shí)間(0，1，2，3，4，5，6 h)各取2 mL菌樣，8 000 r/min離心5 min，收集沉淀，加入50 μL PBS (pH=7.4)和50 μL 2×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸10 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(5%的濃縮膠，15%的分離膠)。

1.6 重組牦牛BNBD5蛋白的純化

取10 mL含目的蛋白的菌液接種到1 L LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩6 h，4 ℃、8 000 r/min 離心10 min收集菌體，加入磷酸鹽緩沖液重懸，超聲破碎(200 W，超聲6 s，停9 s，直到樣品澄清)后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，分別收集上清和沉淀。沉淀用體積分?jǐn)?shù)1%Triton和2 mol/L的尿素各洗2次，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集沉淀，然后用8 mol/L尿素溶解沉淀(1 g濕質(zhì)量加入10 mL尿素)，4 ℃過(guò)夜，12 000 r/min離心20 min，收集上清用0.45 μm濾膜過(guò)濾，然后用HisTrapTMFF純化柱純化蛋白，并對(duì)純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。將純化后的蛋白放入透析袋，然后將透析袋依次放入含6，4，2，1 mol/L尿素的復(fù)性液中于4 ℃各透析2 h，最后將透析袋置于不含尿素的磷酸鹽緩沖液中4 ℃透析過(guò)夜，使蛋白質(zhì)在此過(guò)程中復(fù)性。

1.7 重組牦牛BNBD5蛋白體外抑菌活性的檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[11-12]的Bradford 法檢測(cè)純化的重組蛋白的濃度。根據(jù)前人對(duì)牛防御素的最小抑菌試驗(yàn)[11-12]，采用瓊脂擴(kuò)散法，分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌(各5×106CFU) 涂LB平板，將經(jīng)高壓滅菌過(guò)的濾紙片蘸取0.08和0.10 mg/mL 純化后的重組蛋白溶液，置于倒好的無(wú)抗生素的LB固體平板上，同時(shí)設(shè)氨芐青霉素為陽(yáng)性對(duì)照，純化的pET-32a(+)空載蛋白為陰性對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀測(cè)以濾紙片為中心的抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛β-防御素5基因的克隆與序列分析

本研究根據(jù)GenBank 上提交的黃牛BNBD5的基因序列，利用RT-PCR從牦牛肺組織中擴(kuò)增得到約138 bp 的牦牛BNBD5基因片段(圖1)，與目的基因片段長(zhǎng)度相符，編碼45個(gè)氨基酸殘基(圖2)，并且含有防御素的特征性分子結(jié)構(gòu)，即在特定位置上有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，分別在分子內(nèi)形成Cys1-Cys5、Cys2-Cys4 和Cys3-Cys6共3對(duì)二硫鍵。同源性分析表明，牦牛BNBD5基因與黃牛BNBD5同源性最高，達(dá)86.2%，與其他物種BNBD5的同源性為21.0%～79.7%(表1)。牦牛BNBD5基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 牦牛β-防御素5基因的PCR擴(kuò)增

2.2 牦牛BNBD5基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pET32-BNBD5 經(jīng)PCR檢測(cè)，獲得了138 bp的目的片段，BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后也得到138 bp的片段(圖4)，證明外源基因片段已成功插入到質(zhì)粒中。

圖2 牦牛BNBD5基因序列及其編碼的氨基酸序列下劃線標(biāo)示保守的半胱氨酸

表1 β-防御素5基因核酸序列的同源性比較

圖3 牦牛與其他物種BNBD5基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 牦牛BNBD5重組蛋白的表達(dá)及純化

SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖5)表明，與誘導(dǎo)前的菌體相比，誘導(dǎo)后的菌體有1條明顯的特異性條帶，與預(yù)期大小25 ku相符合，誘導(dǎo)后，表達(dá)量明顯增加。BNBD5重組蛋白主要以包涵體的形式存在，上清中蛋白因濃度太低幾乎檢測(cè)不到，BNBD5蛋白經(jīng)親和層析純化后可得到比較純的融合蛋白(圖6)。

2.4 pET32-BNBD5融合蛋白的抑菌活性

將純化后的BNBD5基因成熟肽融合蛋白進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果(圖7)顯示，BNBD5基因成熟肽融合蛋白對(duì)革蘭氏陰性菌(E.coil)具有較強(qiáng)的抑菌活性。當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)，抑菌圈直徑為7.21 mm；當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到0.10 mg/mL時(shí)，可看到明顯的抑菌效果，抑菌圈直徑為7.62 mm；但抑菌圈都小于氨芐青霉素(13.5 mm)，而純化的空載蛋白無(wú)抑菌圈。BNBD5基因成熟肽融合蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(S.aureus)也有較強(qiáng)的抑菌活性。當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)可以觀察到抑菌圈，抑菌圈直徑為5.61 mm；當(dāng)其質(zhì)量濃度為 0.10 mg/mL 時(shí)抑菌效果較明顯，抑菌圈直徑為 6.73 mm；但氨芐青霉素的抑菌圈(12.7 mm)更大，純化的空載蛋白亦無(wú)抑菌圈。

圖4 重組質(zhì)粒pET32-BNBD5的BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切分析

圖5 牦牛BNBD5融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析

圖6 融合蛋白BNBD5表達(dá)形式的鑒定及純化蛋白的SDS-PAGE

圖7 重組牦牛BNBD5蛋白抑菌活性的檢測(cè)

3 討 論

防御素是一種具有代表性的內(nèi)源抗菌肽，其廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞中。大量研究表明，無(wú)論是重組表達(dá)還是人工合成的防御素，對(duì)細(xì)菌、真菌，甚至一些被膜病毒[13]都有很強(qiáng)的殺傷力，且無(wú)毒副作用，不會(huì)使病原微生物產(chǎn)生耐藥性[14-16]。但動(dòng)物體內(nèi)天然防御素較少，分離成本較高，使得防御素的利用受到限制，因此通過(guò)基因工程手段在體外獲得3～5 ku的防御素分子[17-19]，可在一定程度上擴(kuò)大其利用范圍，但如何提高表達(dá)水平及表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，使合成的防御素有更好的殺菌活力及更廣譜的殺菌效果還需深入研究。

本研究根據(jù)已發(fā)表的黃牛BNBD5(AJ278799)基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，利用RT-PCR方法從牦牛肺組織中克隆了牦牛BNBD5基因成熟肽編碼區(qū)。經(jīng)測(cè)序分析，該成熟肽編碼區(qū)大小為138 bp，編碼45個(gè)氨基酸殘基，內(nèi)含6個(gè)位置保守的半胱氨酸殘基，分別在分子內(nèi)形成Cys1-Cys5、Cys2-Cys4 和Cys3-Cys6 3對(duì)二硫鍵，這是β-防御素的基本結(jié)構(gòu)單元[20-21]。將該基因成熟肽序列與其他物種的BNBD5成熟肽序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，該基因與黃牛BNBD5的同源性最高，可達(dá)86.2%。從遺傳進(jìn)化樹可知，哺乳類動(dòng)物和禽類都存在β-防御素，但他們的同源性都比較低。針對(duì)這一現(xiàn)象，很多學(xué)者用達(dá)爾文進(jìn)化論來(lái)解釋[22-23]，認(rèn)為不同物種感染的病原體有可能不同，為了抵御外源病原體，一些基因就會(huì)發(fā)生有利于自身的突變，從而導(dǎo)致防御素在物種間的同源性較低。

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)是目前常用的表達(dá)系統(tǒng)之一，以其表達(dá)的融合蛋白多以包涵體的形式存在，這樣既能保護(hù)目的蛋白不被蛋白酶降解，又能提高重組蛋白的產(chǎn)量及穩(wěn)定性，且不會(huì)影響目標(biāo)蛋白的功能及活性[24-25]。本試驗(yàn)采用His組氨酸標(biāo)簽融合表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行牦牛BNBD5的原核表達(dá)，用GE公司的HisTrapTMFF純化柱純化蛋白，在包涵體的溶解、復(fù)性及透析過(guò)程中加入2 mmol的β-巰基乙醇有助于二硫鍵的正確折疊，從而使純化的目的蛋白有活性。防御素的抗菌機(jī)理非常復(fù)雜，他們對(duì)微生物作用的活性與特異性主要取決于他們的理化性質(zhì)，例如陽(yáng)離子凈電荷和疏水性質(zhì)、β-防御素結(jié)構(gòu)、低聚反應(yīng)、蛋白水解穩(wěn)定性等。目前對(duì)于防御素的抗菌機(jī)制并沒(méi)有統(tǒng)一的說(shuō)法，普遍被大家接受的說(shuō)法是胞膜攻擊作用，即抗菌肽作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，破壞膜的完整性使離子通透性失衡，細(xì)胞內(nèi)容物大量滲出而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[26]。本研究制備的重組牦牛BNBD5融合蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌都具有抑菌活性；空載體純化的蛋白不具有抑菌活性，不影響重組蛋白的活性，這與前人的研究結(jié)果[27-28]一致。但由于本試驗(yàn)都只選了1種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌進(jìn)行抑菌活性研究，因此不能說(shuō)明純化的重組蛋白對(duì)其他細(xì)菌的抑菌活性，這是本研究的不足之處。

本試驗(yàn)克隆的牦牛BNBD5成熟肽在BL21中得到了高效表達(dá)，且純化的蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的抗性，可為防御素代替抗生素成為新型的抗菌藥物提供理論依據(jù)，但有關(guān)牦牛防御素的抗菌作用機(jī)制等還有待進(jìn)一步研究。

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