溫度和pH對(duì)黃金鱸消化酶活力的影響

楊 婳，邢秀蘋(píng)，黃 權(quán)，吳莉芳，楊歡歡，王洪鶴

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2 廈門(mén)利洋水產(chǎn)科技有限公司，福建 廈門(mén) 361012)

消化酶是由消化系統(tǒng)和消化腺分泌的起營(yíng)養(yǎng)和消化作用的酶類(lèi)。魚(yú)類(lèi)的消化酶按照種類(lèi)可以分為蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶3種。影響?hù)~(yú)類(lèi)消化酶活力的因素很多，主要包括食性、生長(zhǎng)階段、外界環(huán)境等，其中外界環(huán)境主要包括溫度、鹽度、pH等。隨著魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)、消化生理學(xué)以及漁業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，對(duì)魚(yú)類(lèi)消化酶的研究已經(jīng)有了大量的報(bào)道，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后對(duì)大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[1]、黑鮸(Miichthysmiiuy)[2]、月鱧(Channaasiatica)[3]、美國(guó)紅魚(yú)(Sciaenopsocellatus)[4]、金槍魚(yú) (Thunnusalbacores)[5]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和鯽魚(yú)(Carassiuscuvieri)[6]等魚(yú)類(lèi)消化酶活力的最適溫度、pH或消化酶活力的分布特點(diǎn)等進(jìn)行了研究。黃金鱸(Percaflavescens)又名絲綢鱸，屬于鱸形目(Perciformes)鱸科(Perch)，是美國(guó)最著名的溫、冷水性淡水游釣魚(yú)類(lèi)之一。它不僅體形優(yōu)美，而且具有肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、生長(zhǎng)速度快、適溫范圍廣、適應(yīng)性強(qiáng)、病害少、商品價(jià)值高等特點(diǎn)，是池塘、網(wǎng)箱、工業(yè)化等養(yǎng)殖的主要對(duì)象，也是廣大養(yǎng)殖戶(hù)的理想養(yǎng)殖品種之一，具有廣闊的養(yǎng)殖發(fā)展前景。目前對(duì)于黃金鱸的研究主要集中在人工繁殖、苗種培育、成魚(yú)養(yǎng)殖等方面，而對(duì)其消化酶活力的研究尚未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。本試驗(yàn)以黃金鱸為對(duì)象，研究不同溫度、pH條件下黃金鱸胃、前腸、中腸、肝臟和幽門(mén)盲囊5 個(gè)不同組織部位中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力的變化及分布特性，確定消化道不同部位消化酶活力的最適溫度及pH，以豐富魚(yú)類(lèi)消化生理的基礎(chǔ)研究，同時(shí)為相關(guān)配合飼料的研制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所用黃金鱸購(gòu)自江蘇省鎮(zhèn)江市揚(yáng)中市娛樂(lè)園，魚(yú)體健康、無(wú)病無(wú)傷，平均體長(zhǎng)為(18.96±0.19) cm，平均體質(zhì)量為(142.29±4.31) g，試驗(yàn)魚(yú)購(gòu)回后在實(shí)驗(yàn)室魚(yú)缸中暫養(yǎng)。

1.2 儀器設(shè)備與主要試劑

主要儀器包括722N分光光度計(jì)(YK1204837)、高速低溫冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))、恒溫水浴鍋(DK-98-11A)、玻璃勻漿器、比色皿、pH測(cè)定儀。

主要試劑有福林酚試劑、酪氨酸、酪蛋白、無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、三氯乙酸、鹽酸、淀粉酶試劑盒、脂肪酶試劑盒、醋酸-醋酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。

1.3 消化酶粗提液的制備

隨機(jī)取黃金鱸10尾，置于冰盤(pán)上活體解剖，解剖后取出肝臟、胃、幽門(mén)盲囊和腸道組織，剔除內(nèi)容物、表面脂肪及腸系膜，用去離子水沖洗干凈，在4 ℃條件下用剪刀剪碎，稱(chēng)其質(zhì)量。按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，將組織懸液在低溫下5 000 r/min離心10 min，所得上清液即為酶粗提液。

1.4 不同溫度和pH條件下消化酶活力的測(cè)定

用恒溫水浴鍋控制反應(yīng)溫度，反應(yīng)溫度設(shè)置在20～55 ℃，每5 ℃為一個(gè)梯度，共8個(gè)溫度梯度，于pH為7.5的條件下測(cè)定各溫度下的酶活力(胃蛋白酶pH設(shè)置在2.5)，每個(gè)溫度梯度做3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。

本試驗(yàn)將蛋白酶pH設(shè)置在5.0～10.0，淀粉酶pH設(shè)置在4.0～9.0，脂肪酶pH設(shè)置在5.0～9.0，每1.0為一個(gè)梯度，其中胃蛋白酶的pH范圍設(shè)置在2.0～4.0，每0.5為一個(gè)梯度，共5個(gè)梯度。在溫度為(37±1) ℃條件下，測(cè)定不同pH下消化酶的活力。每個(gè)梯度下3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。

蛋白酶活力采用福林-酚法測(cè)定，淀粉酶、脂肪酶活力分別采用淀粉酶試劑盒、脂肪酶試劑盒(均購(gòu)自南京建成科技有限公司)測(cè)定。蛋白酶單位定義：在37 ℃條件下，每min每克水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個(gè)酶活力單位(U)；淀粉酶單位定義：在37 ℃條件下，每毫克蛋白與底物反應(yīng)30 min，水解10 mg淀粉為一個(gè)酶活力單位(U)；脂肪酶單位定義：在37 ℃條件下，每克組織蛋白與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

數(shù)據(jù)采用SPSS(17.0)軟件中的Linear Mode模塊進(jìn)行方差分析，若方差分析顯著，進(jìn)一步進(jìn)行LSD和Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)黃金鱸蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力的影響

溫度對(duì)黃金鱸蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力的影響見(jiàn)圖1。

圖1 溫度對(duì)黃金鱸蛋白酶(A)、淀粉酶(B)和脂肪酶活力(C)的影響

根據(jù)單因素方差分析，溫度對(duì)胃、肝臟、前腸、中腸和幽門(mén)盲囊中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力均有顯著影響(P<0.05)，進(jìn)一步進(jìn)行LSD和Duncan’s多重比較。由圖1可知，在20～55 ℃，3 種酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，同一組織器官在不同溫度下3種消化酶的活力均具有顯著差異，同一溫度不同組織器官3種消化酶的活力也均具有顯著差異 (P<0.05)。其中，胃、肝臟蛋白酶的最適溫度為 40 ℃，前腸、中腸和幽門(mén)盲囊蛋白酶的最適溫度均為50 ℃(圖1-A)，胃、中腸、肝臟淀粉酶的最適溫度均為35 ℃，前腸和幽門(mén)盲囊的淀粉酶最適溫度為30 ℃(圖1-B)，各組織器官脂肪酶活力最適溫度均為40 ℃(圖1-C)。在最適溫度下，蛋白酶活力順序?yàn)橛拈T(mén)盲囊>前腸>胃>中腸>肝臟，淀粉酶的活力順序?yàn)楦闻K>前腸>中腸>幽門(mén)盲囊>胃，脂肪酶的活力順序?yàn)楦闻K>胃>前腸>幽門(mén)盲囊>中腸，在最適溫度下，各部位3種消化酶活力差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

2.2 pH對(duì)黃金鱸蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力的影響

在(37±1) ℃的條件下，測(cè)定不同pH對(duì)黃金鱸各組織器官消化酶活力的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 pH對(duì)黃金鱸蛋白酶(A、B)、淀粉酶(C)和脂肪酶活力(D)的影響

由圖2可知，在一定pH 范圍內(nèi)，不同組織器官的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)；不同組織器官的同一種消化酶的最適pH不同，同時(shí)不同組織器官的同一消化酶活力也存在顯著差異(P<0.05)。黃金鱸胃蛋白酶的最適pH為2.5 (圖2-A)，幽門(mén)盲囊、前腸、中腸和肝臟蛋白酶的最適pH分別為8.0，9.0，9.0和6.0(圖2-B)；黃金鱸胃、幽門(mén)盲囊、前腸、中腸和肝臟淀粉酶的最適pH分別為6.0，6.0，7.0，7.0和6.0(圖2-C)；黃金鱸胃、幽門(mén)盲囊、前腸、中腸和肝臟脂肪酶的最適pH分別為6.0，7.0，7.0，7.0和7.0(圖2-D)。這說(shuō)明胃蛋白酶在強(qiáng)酸性時(shí)活力較高，肝臟蛋白酶活力在偏酸性條件下較高，腸道和幽門(mén)盲囊蛋白酶活力在偏堿性時(shí)較高，淀粉酶活力在中性偏酸性時(shí)較高，脂肪酶在中性時(shí)活力較高。

3 討 論

3.1 溫度對(duì)黃金鱸蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力的影響

溫度是酶活力的重要影響因素之一，酶的最適溫度不是酶的特征物理常數(shù)，因?yàn)橐环N酶的最高活力溫度不是固定的，它受酶的純度、底物、激活劑、抑制劑以及酶促反應(yīng)時(shí)間等因素的影響。酶在最適溫度范圍內(nèi)，活力最強(qiáng)，酶促反應(yīng)速度最大。不同生物體組織器官酶的最適反應(yīng)溫度不同。John[7]研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類(lèi)消化酶的最適反應(yīng)溫度一般是在 30～50 ℃。袁玉仁[8]研究不同溫度對(duì)花鱸(Lateolabraxjaponicus)蛋白酶活力的影響，結(jié)果表明，花鱸胃蛋白酶活力在41 ℃時(shí)最高，前腸、中腸、后腸、肝胰臟和幽門(mén)盲囊蛋白酶活力均在49 ℃最高；其淀粉酶活力均在33 ℃最高。王海英[9]報(bào)道，大菱鲆胃、前腸、中腸、后腸、肝胰臟和幽門(mén)盲囊淀粉酶活力最適溫度均為40 ℃。韓慶等[10]對(duì)洞庭鲇(Silurusasotus)的消化酶活力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)洞庭鲇胃中脂肪酶活力在35 ℃時(shí)活力最高，前腸、中腸、后腸和肝胰臟脂肪酶最適溫度均為30 ℃。本試驗(yàn)結(jié)果表明，胃、肝臟蛋白酶的最適溫度均為40 ℃，前腸、中腸和幽門(mén)盲囊蛋白酶的最適溫度均為50 ℃；胃、中腸、肝臟淀粉酶的最適溫度均為35 ℃，前腸和幽門(mén)盲囊的淀粉酶最適溫度為30 ℃；黃金鱸各組織器官脂肪酶活力最適溫度均為40 ℃。

本研究結(jié)果與上述結(jié)論相一致。黃金鱸淀粉酶活力在消化道前、后段(胃和中腸)最適溫度較高，中間段(前腸和幽門(mén)盲囊)最適溫度較低，這一點(diǎn)與大多數(shù)魚(yú)類(lèi)不同，這可能與不同種類(lèi)魚(yú)、組織器官以及消化酶對(duì)溫度的適應(yīng)性不同有關(guān)，例如，美國(guó)紅魚(yú)(Sciaenopsocellatus)胃和腸道蛋白酶活力最適溫度為25 ℃，幽門(mén)盲囊為40 ℃，表現(xiàn)為消化道前、后段(胃和腸道)最適溫度較低，中間段(幽門(mén)盲囊)最適溫度較高[11]。此外，由于許多魚(yú)類(lèi)沒(méi)有幽門(mén)盲囊，所以沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行研究，亦沒(méi)有總結(jié)出溫度的變化規(guī)律。從魚(yú)類(lèi)消化酶的最適反應(yīng)溫度與其棲息溫度比較來(lái)看，水體環(huán)境的溫度一般都低于消化酶所需要的最適溫度。雖然黃金鱸最佳生長(zhǎng)水溫是20～25 ℃，但從本研究結(jié)果可知，黃金鱸5種不同組織器官消化酶的最適反應(yīng)溫度均高于其最佳生長(zhǎng)溫度。

本試驗(yàn)中，黃金鱸消化酶活力是在離體條件下進(jìn)行測(cè)定的，消化酶活力最適溫度均高于其生活的水溫。在實(shí)際生產(chǎn)中，水溫對(duì)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育具有顯著影響。一般而言，水體在適宜的溫度范圍內(nèi)，水溫越高，飼料消化率越高，魚(yú)類(lèi)的攝食量也隨之增加。本研究中，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，黃金鱸的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。

3.2 pH 對(duì)黃金鱸蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力的影響

酶促反應(yīng)都是在一定的pH條件下進(jìn)行的，酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以pH過(guò)大或過(guò)小都能引起酶變性失活，并且pH的改變能影響酶與底物的結(jié)合。當(dāng)反應(yīng)pH大于或小于最適pH時(shí)，酶活力均會(huì)降低。本研究結(jié)果表明，pH 對(duì)黃金鱸3 種消化酶的活力均具有顯著影響，在設(shè)定的pH 范圍內(nèi)，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度、反應(yīng)時(shí)間以及底物等反應(yīng)條件相同時(shí)，存在一個(gè)最適pH，在該pH條件下酶活力最高。周景祥等[12]報(bào)道，硬骨魚(yú)類(lèi)胃蛋白酶的最適pH 在2～3，肝胰臟和腸道蛋白酶的最適pH 分別在7.0～8.7 和6.5～9.5；而胃、肝胰臟和腸道淀粉酶的最適pH分別是5.0～7.0，6.8～7.0和5.0～8.0。

魚(yú)類(lèi)蛋白酶在不同組織器官的最適pH 不同，不同魚(yú)類(lèi)同一組織器官蛋白酶的最適pH也不同。本研究中，黃金鱸胃、前腸、中腸、幽門(mén)盲囊和肝臟蛋白酶的最適pH分別為2.5，9.0，9.0，8.0和6.0，這說(shuō)明魚(yú)類(lèi)蛋白酶在不同組織器官的最適pH 不同。大量研究表明，有胃的魚(yú)類(lèi)胃中均含有胃蛋白酶，并且胃蛋白酶活力均在強(qiáng)酸性條件下最高，一般最適pH 在2.0～3.0。Vys等[13]的研究表明，胃中的蛋白酶只有在強(qiáng)酸中才能有效地分解蛋白質(zhì)。本試驗(yàn)中，黃金鱸胃蛋白酶活力在pH 2.5時(shí)活力最高。付新華[1]也報(bào)道了大菱鲆胃蛋白酶活力最適pH為2.0；李軍[14]對(duì)美國(guó)紅魚(yú)胃蛋白酶活力的最適pH進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其胃蛋白酶最適pH在1.4～2.2，這都與本研究結(jié)果相似。但李昌達(dá)[2]對(duì)黑鮸的胃蛋白酶活力進(jìn)行研究，結(jié)果表明，當(dāng)pH為7.2時(shí)，胃蛋白酶活力較高。這表明，不同魚(yú)類(lèi)胃蛋白酶活力的最適pH不同。這可能是因?yàn)轸~(yú)的種類(lèi)及其食性不同，胃蛋白酶活力可能會(huì)發(fā)生改變，所以最適pH也有可能不同。

本研究中，黃金鱸胃、幽門(mén)盲囊、肝臟淀粉酶的活力在pH為6.0時(shí)最高，在pH為7.0時(shí)前腸和中腸淀粉酶活力最高，這與周景祥等[12]報(bào)道的硬骨魚(yú)類(lèi)、葉元土等[15]報(bào)道的大口鯰(Silurusmeridionalis)、長(zhǎng)吻鮠(Leiocassislongirostris)不同組織的淀粉酶最適pH表現(xiàn)相似。

大量研究表明，脂肪酶在pH為中性時(shí)活力最高。如泥鰍(Misgurusnsanguillicaudatus)脂肪酶最適pH為7.4[16]，月鱧脂肪酶最適pH為6.6～7.4[3]，軍曹魚(yú)(Rachycentroncanadum)脂肪酶最適pH為6.0～7.0[17]。本研究中，黃金鱸脂肪酶最適pH為6.0～7.0，與以上魚(yú)類(lèi)相類(lèi)似。脂肪酶在中性時(shí)活力最高，這可能與其適宜生長(zhǎng)在中性的水環(huán)境有關(guān)。

大量有關(guān)酶的試驗(yàn)結(jié)果表明，不同生物種類(lèi)、不同組織器官內(nèi)相同的酶具有不同的最適pH[18-19]。最適pH的高低對(duì)魚(yú)類(lèi)生理活動(dòng)的影響是多方面的。因此，為了促進(jìn)黃金鱸對(duì)食物的消化吸收，促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng)發(fā)育，可以考慮在飼料中添加一定量的酸化劑和外源性酶制劑，從而提高飼料利用率，同時(shí)也有利于減少對(duì)水體的污染。

3.3 食性與消化酶活力的關(guān)系

魚(yú)類(lèi)的食性分為肉食性、雜食性和草食性3種，其與魚(yú)消化器官的組織結(jié)構(gòu)以及消化機(jī)能相適應(yīng)，不同器官組織結(jié)構(gòu)不同，其所承擔(dān)的消化機(jī)能也有差異，因而消化酶的含量也存在一定差異。Agrawal[20]、Hidalgo等[6]比較不同食性魚(yú)類(lèi)蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力的差異，結(jié)果表明，肉食性魚(yú)類(lèi)蛋白酶活力高于雜食性魚(yú)類(lèi)，草食性魚(yú)類(lèi)淀粉酶活力相對(duì)較高，而肉食性魚(yú)類(lèi)的脂肪酶活力高于草食性和雜食性魚(yú)類(lèi)。本研究測(cè)定的黃金鱸蛋白酶活力高于雜食性鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)和草食性草魚(yú)(Ctenopharyngondonidellus)[21]，表明其對(duì)蛋白質(zhì)具有較高的消化能力，為溫和肉食性魚(yú)類(lèi)，天然條件下主要攝食水生無(wú)脊椎動(dòng)物。因此，在黃金鱸的人工養(yǎng)殖過(guò)程中，應(yīng)以動(dòng)物性飼料和蛋白質(zhì)含量較高的飼料為主。

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