基于熒光光譜檢測不同環(huán)境牛奶中維生素B2含量研究

楊苗,張偉剛,楊萍果

(1.山西農業(yè)大學 文理學院,山西 太谷 030801；2.南開大學 現(xiàn)代光學研究所光電信息技術科學教育部重點實驗室，天津 300071； 3.山西師范大學 生命科學院，山西 臨汾 041000)

維生素B2(Vitamin B2)，是人體內許多重要酶的組成成分，但在人體內含量很少，而人體自身又無法合成該化合物，必須從食物中攝取。VB2能促進發(fā)育和細胞再生，保證皮膚、指甲、毛發(fā)的正常生長，幫助消除口腔、唇、舌的炎癥，增進視力，減輕眼睛的疲勞，幫助碳水化合物、脂肪、蛋白質代謝等。因此，它在人體的生長、發(fā)育及代謝過程中發(fā)揮著不可替代的重要作用。人體中缺乏維生素B2會引起多種疾病。

牛奶是人們日常生活中最喜愛的食物之一，含有豐富的蛋白質、脂肪、鈣、維生素等多種營養(yǎng)成分。早在上世紀30年代化學家哥爾倍格從牛奶中提取VB2，在2年后由化學家哥恩合成。目前維生素B2含量的研究方法主要有高效液相色譜法[1,2]、熒光分析法[3,4]、電化學法[5]等。不同的檢測方法各有優(yōu)缺點，如高效液相色譜法對高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析有優(yōu)勢，但該方法的缺點是有“柱外效應”。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間(進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等)中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。電化學法的缺點是電極選擇性不高，易發(fā)生副反應，降低電流效率，電極易形成吸附層和氧化膜，污損電極使電壓升高。

熒光分析法具有靈敏度高、干擾少、線性范圍寬、選擇性好、樣品用量少、操作簡便等優(yōu)點,被廣泛用于食品[1,2，6～9]、藥品[3，5，7]及環(huán)境[4]等領域的檢測，是一種有效的光譜分析技術。劉杰等[10]采用激光誘導熒光(LIF)技術研究鮮牛奶變質過程，發(fā)現(xiàn)牛奶的熒光光譜與其變質過程有密切的關系；顧春峰[8]等連續(xù)幾天對不同牧場合格奶樣的三維熒光光譜分析，發(fā)現(xiàn)熒光光譜可區(qū)分不同牧場來源的奶樣，判斷該牧場的奶樣是否穩(wěn)定，但采用熒光光譜技術對牛奶中維生素B2的成分檢測報道很少。本文采用熒光光譜技術分析法研究不同環(huán)境(酸、堿、光照、溫度)對純牛奶中維生素B2含量的影響，為從牛奶中攝取VB2提供理論參考。

1 熒光產(chǎn)生的原理

大多數(shù)分子在室溫時均處在電子基態(tài)的最低振動能級，當物質分子吸收了與它所具有的特征頻率相一致的光子時，由原來的能級躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)或第二電子激發(fā)態(tài)中各個不同振動能級(圖1)。其后，大多數(shù)分子常迅速降落至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，在這一過程中它們和周圍的同類分子或其他分子撞擊而消耗了能量，因而不發(fā)射光。分子在第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級停留約10～9 s之后,直接下降至電子基態(tài)的各個不同振動能級，并以光的形式釋放出多余的能量，所發(fā)生的光即是熒光(圖1)。某些熒光物質分子在降落到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級后，通過另一次無輻射躍遷降落至亞穩(wěn)的三重線態(tài)，又受到熱激活作用再回到第一電子激發(fā)態(tài)的各個振動能級，最后由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級降落至電子基態(tài)而發(fā)出熒光。因此，產(chǎn)生熒光的第一個必要條件是該物質的分子必須具有能吸收激發(fā)光的結構，通常是共軛雙鍵結構；第二個條件是該分子必須具有一定程度的熒光效率。

2 試驗及方法

2.1 試驗樣品

試驗用鮮牛奶購于山西農業(yè)大學牧站牛奶廠；生物試劑維生素B2(VB2)、蒸餾水、鹽酸(HCl)、氫氧化鈉(NaOH)均購于天津市光復精細化工研究所；1 cm比色皿。

圖1 熒光光譜能級躍遷Fig.1 Fluorescence spectrum energy level transition

2.2 試驗儀器

采用日本島津RF-5301PC熒光分光光度計，以150 W的弧光氙燈作為發(fā)光光源，用1300刻線·毫米-1的光柵作為單色儀中分光元件，采用R3788型光電倍增管(PTM)作為光電探測器，掃描波長范圍為220～900 nm，波長精度為±1.5 nm，波長掃描速度3000 min-1，可通過500～650 nm的濾光片作為暢通濾光片,測得的數(shù)據(jù)經(jīng)RF-5301軟件實時采集、處理并輸出。

電子天平為上海精科FA1204B型，精度為0.1 mg。

2.3 樣品的制備

2.3.1 維生素B2標準儲備液配制

準確稱取維生素B2對照樣品10 mg，用0.1 mol·L-1鹽酸溶液溶解維生素B2，定容至100 mL的棕色容量瓶中，其濃度為0.10 mg·mL-1，當天配置，冰箱4℃保存，試驗時稀釋成不同的濃度的標準系列。

2.3.2 不同環(huán)境下牛奶中維生素B2液體的配制

2.3.2.1 配制酸性環(huán)境下牛奶中維生素B2的液體樣品

取10 mL鮮牛奶4份，分別加入5 mL濃度不同的(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mol·L-1)鹽酸溶液提取，超聲提取30 min后，定容至25 mL的容量瓶中，經(jīng)0.3 μm有機微孔濾膜抽濾后，去部分上清液待進行光譜測定。

2.3.2.2 配制堿性環(huán)境下牛奶中維生素B2的液體樣品

取10 mL鮮牛奶4份，分別加入5 mL濃度不同的(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mol·L-1)氫氧化鈉溶液提取，超聲提取30 min后，定容至25 mL的容量瓶中，經(jīng)0.3 μm有機微孔濾膜抽濾后，去部分上清液待進行光譜測定。

2.3.2.3 在不同時間的光照環(huán)境下牛奶中維生素B2的液體樣品

取10 mL鮮牛奶4份，分別在陽光下照射5、10、15、20、25 h，然后超聲提取30 min后，定容至25 mL的容量瓶中，經(jīng)0.3 μm有機微孔濾膜抽濾后，去部分上清液待進行光譜測定。

2.3.2.4 不同溫度下牛奶中維生素B2的液體樣品

取10 mL鮮牛奶4份，分別在20、40、60、80、100℃的水浴中放置3 h，超聲提取30 min后定容至25 mL的容量瓶中，經(jīng)0.3 μm有機微孔濾膜抽濾后，去部分上清液待進行光譜測定。

3 熒光光譜數(shù)據(jù)處理

3.1 激發(fā)波長與發(fā)射波長的選擇

維生素B2標準制備液在不同的激發(fā)波長照射下，產(chǎn)生的熒光光譜強度(I)隨著激發(fā)光波長的增加而增加，對應的熒光光譜的波段為500～610 nm。由圖2可見，當激發(fā)光波長為370 nm時，熒光光譜中出現(xiàn)熒光強度最高的峰對應的峰值波長是530 nm。可以斷定維生素B2溶液的最佳激發(fā)波長(λex)為370 nm，最佳發(fā)射波長(λem)為530 nm。

圖2 維生素B2標準制備液的熒光光譜Fig.2 Fluoresecence spectra of aqueou solution of Vitamin B2

圖3 牛奶的熒光光譜Fig.3 Fluoresecence spectra of Mike

3.2 酸處理對牛奶中維生素B2含量的影響

由圖4可見，隨著鹽酸濃度的增加，VB2的含量略有下降，表明鹽酸對牛奶中維生素B2的含量的影響較小，牛奶中維生素B2在酸性環(huán)境下較穩(wěn)定。維生素B2在酸性環(huán)境下，產(chǎn)生了p-π共軛作用，增強了π電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大，使熒光增強。

3.3 堿處理對牛奶中維生素B2含量的影響

由圖5可見，隨著氫氧化鈉濃度的增加，維生素B2的含量逐漸下降，表明氫氧化鈉對牛奶中VB2的含量影響較大，牛奶中維生素B2在堿性條件下不穩(wěn)定，易被分解破壞。其原因主要是減少了π電子的共軛度，同時增加了分子的內轉換和系間跨越過程以及分子內部的振動等非輻射躍遷的能量損失，減弱了熒光效率。分子結構剛性減弱，共平面性減弱，熒光減弱。因此，隨著過氧化氫濃度的增加，過氧化氫的氧化性增強，將VB2氧化為其他物質，致使牛奶中維生素B2的含量有所下降。

圖4 不同HCL濃度下牛奶中維生素B2的含量Fig.4 Vitamin B2concentration of Mike of different HCL concentration

圖5 不同NaOH濃度下牛奶中維生素B2的含量Fig.5 Vitamin B2concentration of Mike of different NaOH concentration

3.4 光照條件對牛奶中維生素B2含量的影響

由圖6可見，隨著光照時間的延長，牛奶中VB2的含量逐漸下降，說明光照對牛奶中VB2的含量影響較大，即VB2對光敏感，易被分解破壞，物質分子吸收輻射后，物質分子的熒光產(chǎn)率必然由激發(fā)態(tài)分子之活化過程的各個相對速率決定。隨著光照時間的延長，一個原因是分子內部能量轉化。當激發(fā)分子接受額外熱能時，有可能使激發(fā)能轉換為基態(tài)的振動能量，隨后迅速振動弛豫而喪失振動能量。另一個原因是碰撞頻率增加，使外轉換的去活幾率增加。導致熒光強度減小。因此，牛奶要避光保存。

圖6 光照下牛奶中維生素B2的含量Fig.6 Vitamin B2concentration of Mike of Light time

3.5 溫度對牛奶中維生素B2含量的影響

由圖7可見，隨著溫度的升高，牛奶中VB2的含量漸有下降，說明溫度對牛奶中VB2的含量影響不大，即VB2對溫度不敏感。這主要是由于隨著溫度的升高，熒光物質溶液的熒光量子產(chǎn)率和熒光強度將減小，原因是分子內部能量轉化。當激發(fā)分子接受額外熱能時，有可能使激發(fā)能轉換為基態(tài)的振動能量，隨后迅速振動弛豫而喪失振動能量，導致VB2的含量減少。因此，溫度因素對牛奶的保存影響不太顯著。

圖7 不同溫度下牛奶中維生素B2的含量Fig.7 Vitamin B2concentration of Mike of different Temperature

4 結論

試驗采集的熒光光譜圖由大量的光譜數(shù)據(jù)構成，為了更好的分析純牛奶在不同環(huán)境下樣品的光

譜特性，試驗通過利用Oirign7.5軟件對樣品熒光光譜數(shù)據(jù)進行處理。熒光光譜中激發(fā)光譜和發(fā)射光譜隨著熒光物質的不同或物質含量的不同，熒光強度也不同，所以定性鑒別和定量分析熒光物質可從激發(fā)光譜和發(fā)射光譜兩方面著手處理。

利用熒光光譜檢測技術，對維生素B2純溶液及牛奶發(fā)射光譜特性和激發(fā)光譜特性進行了詳細的對比研究，解釋了熒光光譜產(chǎn)生的原因以及對應的熒光團，并分析了純牛奶熒光物質產(chǎn)生熒光的機理。

研究了不同環(huán)境下牛奶的熒光光譜特性，分析了不同環(huán)境下牛奶中維生素B2含量的影響因素及原因。牛奶中維生素B2在酸性環(huán)境下較穩(wěn)定；在堿性條件下不穩(wěn)定，易被分解破壞，對光敏感，對溫度不敏感，因此，牛奶要避光保存。

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