延邊地區(qū)長(zhǎng)柱金絲桃中4種酮類成分的含量測(cè)定

姜英子， 王科斯， 金慧穎， 安仁波,3*

( 1.延邊大學(xué)藥學(xué)院， 吉林 延吉 133002； 2.延邊第二人民醫(yī)院， 吉林 延吉 133001;3.延邊大學(xué)長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 吉林 延吉 133002 )

0 引言

中草藥隨產(chǎn)地的不同其化學(xué)成分的含量也有不同，同時(shí)制藥企業(yè)應(yīng)用不同的制藥工藝，也會(huì)導(dǎo)致同種中草藥產(chǎn)生不同的療效；因此，研究中草藥中的生物活性成分和測(cè)定標(biāo)志性成分的含量具有非常重要的意義.

長(zhǎng)柱金絲桃(HypericumascyronL.)為藤黃科(Guttiferae)金絲桃屬植物，廣泛分布于我國(guó)東北、內(nèi)蒙古和黃河、長(zhǎng)江流域以及朝鮮、日本、俄羅斯(西伯利亞)等地.研究[1-2]表明，長(zhǎng)柱金絲桃味苦、性寒，具有平肝、涼血、止血、敗毒、消腫、瀉火解毒等功效，民間常用于外傷止血、去除黃疸、治療肝炎及瘡癤腫毒等癥.文獻(xiàn)[3]研究表明：長(zhǎng)柱金絲桃中所含金絲桃苷具有鎮(zhèn)靜解痙、抗炎、止咳等作用，雖能夠減少肺通氣量但并不抑制呼吸中樞節(jié)律活動(dòng)；槲皮素可治支氣管炎、解痙降壓；山奈酚可抗菌、抗炎、止咳祛痰.文獻(xiàn)[4-12]顯示，長(zhǎng)柱金絲桃還含有二蒽酮類衍生物、黃酮類化合物、五環(huán)三萜類化合物、口山酮類和間苯三酚衍生物及甾醇混合物和甾醇苷類化合物.本文利用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)延邊地區(qū)長(zhǎng)柱金絲桃中的蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚進(jìn)行了含量測(cè)定，為合理開(kāi)發(fā)利用長(zhǎng)柱金絲桃資源和長(zhǎng)柱金絲桃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供參考.

1 儀器和材料

儀器有L-2400型高效液相色譜儀(含L-2400型紫外檢測(cè)器)(日本Hitach公司)，F(xiàn)A2004型萬(wàn)分之一電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)，SK1200H型超聲波清洗脫氣器(上海科島超聲儀器有限公司)，RRH-100型萬(wàn)能高速粉碎機(jī)(香港歐凱萊芙實(shí)業(yè)公司)，Diamonsil C18色譜柱(北京迪馬科技有限公司).蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚購(gòu)買于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，甲醇和乙腈均為色譜純，超純水和其他試劑均為分析純.長(zhǎng)柱金絲桃于2011年5—8月間采自延邊朝鮮族自治州內(nèi)10個(gè)縣市，由延邊大學(xué)藥學(xué)院呂慧子副教授鑒定為藤黃科金絲桃屬植物長(zhǎng)柱金絲桃的全草，憑證標(biāo)本存放于延邊大學(xué)藥學(xué)院.

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1供試樣品溶液 精密稱取長(zhǎng)柱金絲桃粉末0.5 g(過(guò)40目篩)置于圓底燒瓶中，加入甲醇50 mL后超聲提取40 min；提取液置50 mL容量瓶中定容，用0.45m微孔濾膜過(guò)濾后作為供試品試樣.

2.1.2對(duì)照品溶液 分別精密稱取蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚對(duì)照品，置50 mL容量瓶中后加甲醇稀釋至刻度，搖勻，定容.制成濃度分別為6.0，30.0,12.0，18.0g/mL的溶液，經(jīng)0.45m微孔濾膜濾過(guò)，備用.

2.2 色譜條件[13-15]

色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5m),流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，進(jìn)樣量為20L，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.6%磷酸水溶液.梯度洗脫條件見(jiàn)表1.

表1 色譜分離中流動(dòng)相的洗脫條件

對(duì)照品及供試樣品色譜圖見(jiàn)圖1，按保留時(shí)間，出峰順序分別為蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚.

1.蘆??； 2.金絲桃苷； 3.槲皮素； 4.山奈酚圖1 對(duì)照品(A)和供試品(B)溶液的HPLC色譜圖

2.3 線性

混合對(duì)照品溶液，稀釋制備成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出4種成分的線性回歸方程及線性范圍(見(jiàn)表2).

表2 4種酮類成分的回歸方程及線性范圍

2.4 精密度

將對(duì)照品溶液按2.2的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚的峰面積，結(jié)果顯示RSD值分別為1.79%、1.63%、1.85%、1.71%，這表明精密度良好.

2.5 重復(fù)性

將同一份供試樣品溶液按選定的色譜條件注入色譜儀，分別測(cè)定蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚的含量，結(jié)果顯示RSD值分別為1.43%、1.66%、1.97%、1.78%(n=5)，這表明本方法具有良好的重復(fù)性.

2.6 穩(wěn)定性

在不同時(shí)間(0,2,4,8,12,24 h)分別測(cè)定供試樣品溶液中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚的峰面積，結(jié)果顯示RSD值分別為1.80%、1.77%、0.91%、1.93%(n=6)，說(shuō)明供試樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.7 加標(biāo)回收率

在已知含量的延邊地區(qū)長(zhǎng)柱金絲桃藥材(蘆丁0.149 mg/g、金絲桃苷1.054 mg/g、槲皮素0.449 mg/g、山奈酚0.487 mg/g)中分別定量加入蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚，按2.1.1制備成供試樣品溶液，并按2.2的色譜條件分別測(cè)定蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚的含量，其回收率和RSD值見(jiàn)表3.

2.8 不同區(qū)域樣品的含量測(cè)定

將延邊地區(qū)不同區(qū)域的長(zhǎng)柱金絲桃樣品按2.1.1制備成供試樣品溶液，在2.2的色譜條件下進(jìn)樣20L，并同時(shí)測(cè)定蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚的含量，結(jié)果見(jiàn)表4.

表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表4 延邊地區(qū)長(zhǎng)柱金絲桃中4種酮類成分的含量 mg/g

注：—表示在此條件下提取，不能滿足本含量測(cè)定要求.

3 討論

蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山奈酚在360 nm與270 nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收，但在360 nm波長(zhǎng)處雜質(zhì)峰較少，故選定360 nm為檢測(cè)波長(zhǎng).本色譜條件可滿足同時(shí)測(cè)定長(zhǎng)柱金絲桃中4種酮類成分含量的HPLC分析方法要求.

根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]選擇不同的流動(dòng)相進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果顯示：以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，洗脫能力和分離度均較差；以甲醇-0.6%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，峰型較好，但分離度差；以甲醇-乙腈-0.6%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚4種成分都能得到很好的分離，并且峰形較好，所以本文選用了甲醇-乙腈-0.6%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行了梯度洗脫.我們還考查了不同流速(0.8,1.0 mL/min)的甲醇-乙腈-0.6%磷酸水溶液對(duì)分離結(jié)果的影響，結(jié)果表明當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí)其效果最佳.

本文測(cè)定結(jié)果表明，延邊各地區(qū)的長(zhǎng)柱金絲桃中蘆丁的平均含量在0.089～0.265 mg/g，金絲桃苷的平均含量在0.489～1.418 mg/g，槲皮素的平均含量在0.179～0.450 mg/g，山奈酚的平均含量在0.169～1.968 mg/g.這表明區(qū)域不同，蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚的含量也不同，而且具有顯著性差異.

本文研究表明，利用HPLC對(duì)長(zhǎng)柱金絲桃藥材中的4種酮類(蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚)成分的含量同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，方法靈敏、可靠、快捷，可為今后長(zhǎng)柱金絲桃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供參考.

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