索拉非尼聯(lián)合蒽環(huán)類化療藥對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖周期的影響

胡 燕 吳 冰 張 鈞 王 亮 和戈偉 羅榮城

武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北武漢430060

索拉非尼聯(lián)合蒽環(huán)類化療藥對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖周期的影響

胡 燕 吳 冰 張 鈞 王 亮 和戈偉 羅榮城

武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北武漢430060

目的探討索拉非尼聯(lián)合蒽環(huán)類化療藥表阿霉素對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖周期的作用。方法細(xì)胞做四甲基偶氮唑鹽實驗，繪制細(xì)胞增殖曲線。實驗分為4組：對照組、索拉非尼單藥組、表阿霉素單藥組、聯(lián)合組（索拉非尼+表阿霉素）。用聚酰亞胺染色后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞增殖周期的變化。結(jié)果細(xì)胞增殖曲線可見細(xì)胞傳代后開始增殖，4～5 d達(dá)到峰值，后隨著時間的延長，細(xì)胞增殖受抑越來越明顯。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，索拉非尼單藥組使MCF-7細(xì)胞阻滯于G0/G1期[（62.837±0.511）%]與對照組[（49.250±0.826）%]比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；表阿霉素單藥組使細(xì)胞阻滯于S期[（24.976±0.409）%]，與對照組[（23.473±1.009）%]比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組G0/G1期細(xì)胞比率[（64.373±0.429）%]高于對照組及表阿霉素單藥組[（50.980±0.403）%]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論索拉非尼和表阿霉素的聯(lián)合應(yīng)用可以使乳腺癌MCF-7細(xì)胞明顯阻滯于G0/G1，可以為乳腺癌的聯(lián)合化療提供一定的理論依據(jù)。

乳腺癌；生物化療；索拉非尼；表阿霉素

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一，占世界所有新發(fā)癌癥的23%，占癌癥總病死率的14%[1]。近期的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌的遠(yuǎn)期隨訪中，復(fù)發(fā)性乳腺癌的預(yù)后很不理想[2]。目前對于晚期乳腺癌，尤其是性激素受體陰性的乳腺癌，由于缺乏特異性的靶標(biāo)，一直沒有理想的治療方法[3]。傳統(tǒng)化療藥費用昂貴，副作用大，而且容易使乳腺癌產(chǎn)生化療抵抗。細(xì)胞周期失控是腫瘤細(xì)胞異常增殖的一個重要原因，在腫瘤中發(fā)現(xiàn)有調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的Cyclin及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）基因的異常表達(dá)[4]。細(xì)胞周期的異常運轉(zhuǎn)是腫瘤細(xì)胞惡性增殖的核心環(huán)節(jié)，其中S期的DNA合成和G2/M期的細(xì)胞有絲分裂對維持腫瘤細(xì)胞的惡性增殖尤為重要。各種抗腫瘤藥物對腫瘤細(xì)胞的生長抑制大都體現(xiàn)在對于細(xì)胞周期這兩個時相的調(diào)控上[5]。因此，針對這兩個時相以及相應(yīng)藥物的研究對于了解細(xì)胞周期和化療藥的相互關(guān)系起到重要的作用。

索拉非尼是一種小分子多靶點的酪氨酸酶抑制劑，可抑制腫瘤細(xì)胞信號傳導(dǎo)，具有良好的抗腫瘤效應(yīng)[6]。索拉非尼抑制細(xì)胞周期蛋白及細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白，使增殖期細(xì)胞阻滯在G1期，從而阻斷細(xì)胞周期的進(jìn)展，影響腫瘤細(xì)胞的增殖并促腫瘤細(xì)胞凋亡[7]。蒽環(huán)類化療藥表阿霉素（epirubicin，EPI）是乳腺癌治療中最為常用和有效的藥物，可明顯改善患者的生存率，在乳腺癌術(shù)后輔助化療及術(shù)前新輔助化療中常用[8]。表阿霉素是一種細(xì)胞周期非特異性藥物，能夠直接嵌入腫瘤細(xì)胞DNA堿基對之間，從而抑制DNA、RNA的合成。本研究主要探討表阿霉素聯(lián)合索拉非尼對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖周期各時相的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株人乳腺癌（MCF-7）細(xì)胞株，引自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。培養(yǎng)傳代于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中（Gibco公司），選擇對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.1.2 藥物及試劑索拉非尼購于德國拜耳公司，應(yīng)用二甲基亞砜（DMSO）溶解，于-20°保存，實驗用時稀釋，使DMSO終濃度＜0.5%，不影響細(xì)胞生長。表阿霉素（Epirubicin，EPI）購于江蘇豪森制藥，小牛血清購于天津灝洋生物，四甲基偶氮唑鹽（MTT）及DMSO均購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞生長曲線將MCF-7細(xì)胞以1×104/孔，接種于96孔板，每組3個復(fù)孔，于培養(yǎng)的第1～7天每日采用MTT比色法檢測3個復(fù)孔的吸光度（A）值，以時間（d）為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞的生長曲線。

1.2.2 細(xì)胞生長周期檢測方法①取對數(shù)生長MCF-7細(xì)胞，常規(guī)消化、計數(shù)，以細(xì)胞數(shù)為2×104個/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔加RPMI1640全培養(yǎng)基2mL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后在各培養(yǎng)孔中加入藥物。②將細(xì)胞分為4組，分別為對照組、索拉非尼單藥組、表阿霉素單藥組、聯(lián)合組。單藥組的給藥濃度分別為索拉非尼（2μmol/L）、表阿霉素（0.5μmol/L），聯(lián)合組中化療藥物的濃度與單藥組相同，對照組不加任何藥物。加藥后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，然后用不含EDTA的0.25%胰酶消化、收集各組細(xì)胞；③分別制備各組單細(xì)胞懸液，4℃1000 r/min離心5min，形成細(xì)胞團(tuán)。小心移去上清液，冰預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細(xì)胞2次，細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105～5× 105/mL。④用75%乙醇-20℃固定收集的細(xì)胞，過夜，用PBS液洗滌2次，2000 r/min離心5 min后，加入含有0.1%RnaseA的PBS液100μL，10μg/mL聚酰亞胺（PI）500μL室溫避光染色30min后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期測定。本實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間A值比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的生長狀況評價

從細(xì)胞的生長曲線可以看出，MCF-7細(xì)胞生長的初期（4 d）內(nèi)生長速度較快，4～5 d進(jìn)入平臺期，后生長逐漸衰老。見圖1。

圖1 MCF-7細(xì)胞生長曲線

2.2 細(xì)胞周期檢測結(jié)果

索拉非尼單藥組、表阿霉素單藥組、聯(lián)合組G0/G1期細(xì)胞比率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）,結(jié)果提示兩藥分別作用均可使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期；索拉非尼單藥組、表阿霉素單藥組S期細(xì)胞比率與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）,提示表阿霉素使細(xì)胞阻滯于S期；表阿霉素單藥組、索拉非尼單藥組G0/G1期細(xì)胞比率與聯(lián)合組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組S期細(xì)胞比率高于索拉非尼單藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組S期細(xì)胞比率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示，聯(lián)合組對細(xì)胞周期S期無明顯阻滯作用。見表1、圖2。

3 討論

乳腺癌是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致女性高病死率的主要因素，全球每年大約有100萬女性診斷為乳腺癌[9]。當(dāng)前主要靠化療來控制乳腺癌的進(jìn)展，然而，只有少數(shù)患者能夠根治[10]。因此，迫切需要新的化療方案來改善乳腺癌患者的生存質(zhì)量。

細(xì)胞周期調(diào)控是一個精細(xì)的生物學(xué)過程，涉及了多個基因和蛋白的參與，進(jìn)而形成了復(fù)雜的信號分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。因此，了解細(xì)胞周期及其相關(guān)基因的表達(dá)可以從基礎(chǔ)生物學(xué)研究的角度深入發(fā)掘腫瘤的本質(zhì)，闡明癌癥的發(fā)生機(jī)制，并為腫瘤的早期診斷提供標(biāo)志分子。此外，細(xì)胞周期蛋白的深入研究還能夠為設(shè)計特異性抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物和發(fā)展個體化的臨床治療方案提供理論基礎(chǔ)，為選擇特異性藥物靶點、優(yōu)化治療措施提供科學(xué)基礎(chǔ)[5]。近些年來出現(xiàn)的一些細(xì)胞周期阻滯藥，如異黃酮類能夠在低劑量時使細(xì)胞阻滯于G2/M期，高劑量時使細(xì)胞阻滯于S期，進(jìn)而抑制多種腫瘤細(xì)胞生長。萜類化合物棉子酚能夠使腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于S期，而多萜類及半萜類化合物能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的G1期。苦參堿能夠使肝癌細(xì)胞系和慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系阻滯于S期，同時抑制端粒酶活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長。此外，從檳榔樹果中提取的檳榔堿能夠使口腔上皮癌細(xì)胞系阻滯于G2/M期，起到細(xì)胞毒作用[5]。

表1 索拉非尼、表阿霉素單藥及聯(lián)合用藥對MCF-7細(xì)胞周期的影響（%±s，n=3）

表1 索拉非尼、表阿霉素單藥及聯(lián)合用藥對MCF-7細(xì)胞周期的影響（%±s，n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與聯(lián)合組比較，#P＜0.05

組別G0/G1S對照組索拉非尼單藥組表阿霉素單藥組聯(lián)合組P值49.250±0.826 62.837±0.511*#50.980±0.403*#64.373±0.429*＜0.05 23.473±1.009 18.475±0.912*#24.976±0.409 25.334±0.954*＞0.05

圖2 索拉非尼、表阿霉素單藥及聯(lián)合用藥對MCF-7細(xì)胞周期的影響

有報道稱，周期蛋白依賴性激酶（CDK）與相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白結(jié)合是啟動和進(jìn)行細(xì)胞周期各類分子事件的必要條件，其通過對細(xì)胞周期蛋白的磷酸化修飾使細(xì)胞周期跨時相改變。不同種類的細(xì)胞周期蛋白可以結(jié)合不同種類的周期素依賴性蛋白激酶（CDKS），從而參加調(diào)控細(xì)胞周期的不同時相[11]。當(dāng)CDK2酶活性受到抑制后，促使CDK2活性降低或喪失，從而影響細(xì)胞周期的表型導(dǎo)致細(xì)胞G1期阻滯，抑制細(xì)胞DNA合成及增殖[12-13]。高雙全等[14]發(fā)現(xiàn)，CDK2-AP1基因能夠調(diào)控細(xì)胞周期，降低了細(xì)胞復(fù)制能力，這一結(jié)果證明了此基因表達(dá)對抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖具有良好的作用。這結(jié)果也說明了針對CDK2-AP1基因的靶向策略能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性增殖，為乳腺癌患者的后期治療提供理論基礎(chǔ)，CDK2-AP1基因能夠調(diào)控細(xì)胞周期，降低了細(xì)胞復(fù)制能力，這一結(jié)果證明了此基因表達(dá)對抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖具有良好的作用，也說明了針對CDK2-AP1基因的靶向策略能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性增殖，為乳腺癌患者的后期治療提供了理論基礎(chǔ)。索拉非尼作為多種酪氨酸激酶受體抑制劑能夠抑制各種生長信號及激酶受體本身對下游促細(xì)胞周期分子特別是對CDKS的激活效應(yīng)，進(jìn)而間接地起到細(xì)胞周期阻滯作用。

Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼通過抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2的RAF/ERK通路，使MEK和ERK的磷酸化水平下降，下調(diào)Cyclin D1，使增殖期細(xì)胞不能通過“G1～S”調(diào)節(jié)點，影響細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡。Wei等[16]研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼聯(lián)合維生素K能在體外通過抑制p-ERK和Bcl-2的表達(dá)，增加p-JNK，c-Jun和FALS的表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。一項索拉非尼用于治療轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的臨床Ⅱ期多中心不受控試驗中，56例患者中，至少54例患者使用單劑量的索拉非尼進(jìn)行治療。1例患者局部緩解（2%），20例患者病情穩(wěn)定（37%），沒有觀察到完全緩解。有12例患者病情穩(wěn)定長于或等于16周（22%），7例患者病情穩(wěn)定長于或等于6個月（13%）。不推薦進(jìn)一步研究索拉非尼單劑量的使用，但是聯(lián)合其他化療試劑使用值得深入研究[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼單藥能夠抑制乳腺癌癌細(xì)胞株的生長，且先用表阿霉素，后用索拉非尼的序貫給藥方式，有明顯的協(xié)同效應(yīng)。索拉非尼能夠誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G0/G1期。表阿霉素使乳腺癌MCF-7細(xì)胞阻滯在S期。此外，本研究中應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的結(jié)果表明，索拉非尼和表阿霉素單藥均能使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，尤其是聯(lián)合用藥組阻滯更明顯；聯(lián)合組S期細(xì)胞比率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示，聯(lián)合組對細(xì)胞周期S期無明顯阻滯作用。

本研究表明表阿霉素和索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用的生物化療模式提高了抗腫瘤活性，為進(jìn)一步探討乳腺癌的治療方法提供了參考，未來生物化療模式將逐漸體現(xiàn)出其治療優(yōu)勢。

[1]JemalA，Bray F，CenterMM，etal.Global cancer statistics[J]. CA Cancer JClin，2011，61（2）：69-90.

[2]彭衛(wèi)軍，顧雅佳.重視乳腺影像學(xué)檢查技術(shù)和診斷水平的普及與提高為降低我國乳腺癌發(fā)病率而努力[J].中華放射學(xué)雜志，2009，43（5）：453-454.

[3]Qian XL，Li YQ，Yu B，et al.Syndecan binding protein（SDCBP）is overexpressed in estrogen receptor negative breast cancers，and is a potential promoter for tumor proliferation[J].PLoSOne，2013，8（3）：e60046.

[4]ChoiMG，Sohn TS，Park SB，et al.Decreased expression of p12 is associated with more advanced tumor invasion in human gastric cancer tissues[J].Eur SurgRes，2009，42（4）：223-229.

[5]詹啟敏，陳杰.細(xì)胞周期與腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)[J].中國腫瘤臨床，2014，41（1）：1-7.

[6]Dy GK，Hillman SL，Rowland KM，et al．A front-line window of opportunity phaseⅡstudy of sorafenib in patients with advanced nonsmall cell lung cancer：north central cancer treatment group study N0326[J].Cancer，2010，116（24）：5686-5693.

[7]Liu L，Cao Y，Chen C，et al.Sorafenib blocks the RAF/ MEK/ERK pathway，inhibits tumor angiogenesis and induces tumor cell apoptopsis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF/5[J].Cancer Res，2006，66（24）：11851-11858.

[8]江漫，吳燕，馬亞中，等.表阿霉素和紫杉醇單用或聯(lián)合使用對乳腺腫瘤細(xì)胞ZR75-1的體外細(xì)胞毒性[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2012，28（4）：342-344.

[9]Vaz JA，F(xiàn)erreira IC，Tavares C，et al.Suillus collinitusmet hanolic extract increases p53 expression and causes cell cycle arrest and apoptosis in a breast cancer cell line[J]. Food Chem，2012，135（2）：596-602.

[10]Kang N，Wang MM，Wang YH，et al.Tetrahydrocurcumin induces G2/M cell cycle arrest and apoptosis involving p38 MAPK activation in human breast cancer cells[J]. Food and Chemical Toxicology，2014，67：193-200.

[11]Hiyoshi Y，Watanabe M，Hirashima K，et al.p12CDK2-AP1 isassociated with tumor progression and a poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma[J].Oncol Rep，2009，22（1）：35-39.

[12]陳嘉，申良方，鐘美佐，等.E1A抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖及其分子機(jī)制[J].中南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2008，33（7）：582-586.

[13]楊瀾，王磊，王旭芬，等.乳腺癌中細(xì)胞周期素D1的表達(dá)及其臨床意義[J].中國醫(yī)藥，2012，7（2）：179-181.

[14]高雙全，高雙榮，肖高芳，等.乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖及周期與CDK2-AP1基因的表達(dá)的相關(guān)性研究[J].海南醫(yī)學(xué)，2013，24（17）：2499-2501.

[15]Liu L，Cao Y，Chen C，et al.Sorafenib blocks the RAF/ MEK/ERK pathway，inhibits tumor angiogenesis，and induces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF/5[J].Cancer Res，2006，66（24）：11851-11858.

[16]Wei G，Wang M，Carr BI.Sorafenib combined vitamin K induces apoptosis in human pancreatic cancer cell lines through RAF/MEK/ERK and c-Jun NH2-terminal kinase pathways[J].JCell Physiol，2010，224（1）：112-119.

[17]BianchiG，LoiblS，ZamagniC，etal.PhaseⅡmulticenter，uncontrolled trial of sorafenib in patients with metastatic breast cancer[J].Anticancer Drugs，2009，20（7）：616-624.

A ffect of the Coadm inistration of Sorafenib and anthracycline chemotherapy drug on the cell cycle of breast cancer MCF-7 cell

HU Yan WU Bing ZHANG Jun WANG Lianghe GEWei LUORongcheng
Oncology Center,Renmin Hospital ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430060,China

Ob jective To investigate the affect of Sorafenib combined with anthracycline chemotherapy Epirubicin on the proliferation of breast cancer MCF-7 cell cycle.Methods Cells growth curvewere drawn after the MTT experiment. Four different groups were set up:control group,Sorafenib group,EPIgroup and Sorafenib+EPI(combination)group. The change of cell cycles were detected by PI single staining and flow cytometry.Results Cell growth curve showed, passaged cells began to proliferate,and reached the peak after 4-5 days,with the prolongation of time,cell proliferation was inhibited more and more obvious.The cell cycle by flow cytometry showed that,the Sorafenib group[(62.837± 0.511)%]induced G0/G1phasemitosis arrest,compared with control group[(49.250±0.826)%],the difference was statistically significant(P＜0.05);the EPIgroup(24.976±0.409)%]induced accumulation of Sphasemitosis arrest,compared with control group[(23.473±1.009)%],the difference was statistically significant(P＜0.05);and the combination group[(64.373±0.429)%]showed greater increase of G0/G1phase,compared with control group and EPI group [（50.980±0.403）%],the differenceswere statistically significant(P＜0.05).Conclusion The combined application of Sorafenib and Epirubicin can make the breast cancer MCF-7 cells arrested in G0/G1,provide certain theoretical basis for the combination chemotherapy for breast cancer.

Breast cancer;Biochemotherapy;Sorafenib;Epirubicin

R979.1

A

1673-7210（2014）09（c）-0035-04

2014-04-25本文編輯：任念）

胡燕（1983.4-），女，碩士研究生，主要從事腫瘤放射治療工作。

戈偉（1960.6-），男，碩士研究生，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師；研究方向：腫瘤靶向治療。羅榮城（1958.10-），男，碩士研究生，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師；研究方向：腫瘤多學(xué)科綜合診療與生物治療。