微生物產(chǎn)β-木糖苷酶的研究進(jìn)展

范園園，李秀婷，滕超

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

木聚糖是半纖維素的主要組分，廣泛分布于高等植物的細(xì)胞壁中，是自然界中一類存量巨大的可再生資源，也是較容易提取、降解和利用的一類半纖維素。因木聚糖為異質(zhì)多糖，其降解和生物轉(zhuǎn)化需要多種酶的參與，主要包括木聚糖酶（β-D-xylanxylanohydrolase，EC 3.2.1.8）和β-木糖苷酶（β-D-xyloside xylo hydrolase，EC 3.2.1.37）、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰酯酶等[1]。

β-木糖苷酶是一種外切酶，主要催化水解木糖苷和以外切方式從非還原性末端水解聚合度較低的木寡糖（木二糖或木三糖）為木糖。同時β-木糖苷酶還可以作用于萜類、甾體等甙元與木糖形成的糖苷鍵，釋放出甙元。目前，包括β-木糖苷酶在內(nèi)的木聚糖酶系已廣泛應(yīng)用于包括食品、藥品、造紙、能源等多個領(lǐng)域。但相對木聚糖酶系其它水解酶（木聚糖酶等）而言，β-木糖苷酶的相關(guān)研究仍相對薄弱。本文將從酶的來源、定位與分類、酶學(xué)性質(zhì)、生產(chǎn)調(diào)控、基因的克隆與表達(dá)等幾個方面對木糖苷酶的研究進(jìn)展進(jìn)行論述，對研究現(xiàn)存問題和方向進(jìn)行分析，并對應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 β-木糖苷酶的來源

β-木糖苷酶在自然界中分布非常廣泛，現(xiàn)已從細(xì)菌、放線菌和真菌（包括霉菌、酵母、蕈菌）等微生物以及部分高等植物中分離得到。大多數(shù)細(xì)菌或真菌只產(chǎn)生一種β-木糖苷酶，例如細(xì)菌Bacillus thermantarcticus，以及真菌Aspergillus carbonarius、Aureobasidium等均只分泌一種β-木糖苷酶。但隨著研究的深入，迄今為止已發(fā)現(xiàn)可同時產(chǎn)生多種β-木糖苷酶微生物，例如Tsujibo 等從腐爛木材上分離到一株嗜熱鏈霉菌熱紫鏈霉菌（Streptomyces thermoviolaceus）OPC-520 在含木聚糖培養(yǎng)基上可以同時分泌2 種木糖苷酶（STX-I和STX-II），測定分子量分別為54 000 和33 000[2]。另外，試驗(yàn)結(jié)果顯示兩種木糖苷酶的性質(zhì)也存在較大差別（STX-I 和STX-II 等電點(diǎn)、酶最適反應(yīng)溫度分別為4.2 和8.0，以及70 ℃和60 ℃）。通過對兩種酶氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，STX-I 及STX-II 分別與糞肥桿菌外切葡聚糖酶以及短小芽孢桿菌木聚糖酶具有很高的序列同源性。Matsuo 等從Penicilluium wortmanni IFO 7237 中分離純化得到4 種木糖苷酶，其等電點(diǎn)各不相同[4]。Lorenz 等研究發(fā)現(xiàn)嗜熱厭氧細(xì)菌Thermoanaerobacterium sp.JW/SY485 可同時產(chǎn)3 種木糖苷酶，酶相關(guān)性質(zhì)（包括酶活力及與底物的親和性）均不相同[5]。實(shí)驗(yàn)據(jù)此推測，菌株在某種碳源物質(zhì)缺乏或豐富時可能會相應(yīng)的分泌不同種類的木糖苷酶，以保持對碳源較高的利用效率。

2 β-木糖苷酶分泌部位

根據(jù)酶分泌部位的不同，β-木糖苷酶可大體分為胞內(nèi)型、胞外型以及膜結(jié)合型三種，另外同種菌株還會隨著生長機(jī)制及培養(yǎng)條件的不同而有所變化[6]。例如，在大多數(shù)細(xì)菌及酵母中β-木糖苷酶是以溶質(zhì)狀態(tài)分布在細(xì)胞之內(nèi)的，在這些微生物生長過程中，低聚木糖必須以一定的方式進(jìn)入細(xì)胞中才可以被降解[7]。而在絲狀真菌中，有些木糖苷酶在菌絲生長初期位于菌絲體內(nèi)，而在后期則會分泌或者裂解分布到培養(yǎng)基當(dāng)中[8]，也有一些菌體所產(chǎn)木糖苷酶始終保留在細(xì)胞內(nèi)[9]。除此以外有些微生物（如Streptomyces sp.EC 10）所產(chǎn)木糖苷酶則為膜結(jié)合型[10]。通常大部分β-木糖苷酶僅具有單一活性，但研究也發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)比例的β-木糖苷酶為雙功能酶或多功能酶，例如Motoki 等從Aspergillus japonicas 中分離到的β-木糖苷酶即屬于多功能酶，除具有木糖苷酶活性外還具有β-葡糖苷酶以及α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性[11]。

3 β-木糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

1991 年，Henrisaat 等根據(jù)氨基酸序列的相似性把糖基水解酶分成不同的家族。2009 年，Cantarel 等將不同來源的β-木糖苷酶分別歸于第3、30、39、43、52 和54 等不同六個族糖基水解酶。而迄今為止發(fā)現(xiàn)真菌來源的β-木糖苷酶屬于第3、第43 及第54 等三個家族[12]。不同家族的木糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)均有所差別，而酶性質(zhì)的差異直接影響其使用條件及應(yīng)用領(lǐng)域。

3.1 pH 與β-木糖苷酶的活性

大部分木糖苷酶的最適pH 在3.0-6.0 之間。已報(bào)道的β-木糖苷酶的等電點(diǎn)多為弱酸性（見表1）。但也有部分菌株所產(chǎn)β-木糖苷酶為中性或偏堿性。例如Katapodis 等對一種來源于Sporotrichum thermophile 的β-木糖苷酶進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示其最適pH 為7.0[13]；而Tuohy 等從Talaromyces emersonii 中分離到的β-木糖苷酶的等電點(diǎn)為8.9[14]。不同來源的β-木糖苷酶對pH 得耐受性同樣存在明顯差異，例如吳華偉等從草菇中分離得到的β-木糖苷酶的最適pH 為6.4～6.8，在pH5.8～7.7 之間酶活力相對穩(wěn)定[15]；欒宏偉等從Leifsonia shinshuensis DICP 16 菌體分離出的β-木糖苷酶則在pH 6.0～11.0 之間具有很好的穩(wěn)定性[16]。

表1 不同來源β-木糖苷酶的性質(zhì)Table 1 The nature of β-xylosidases in different sources

續(xù)表1 不同來源β-木糖苷酶的性質(zhì)Continue table 1 The nature of β-xylosidases in different sources

3.2 溫度與β-木糖苷酶的活性

溫度對酶活性有很大的影響，在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)溫度升高酶的反應(yīng)速率相應(yīng)增加。但同時過高的溫度又容易導(dǎo)致酶蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而導(dǎo)致酶失活。因此，在工業(yè)應(yīng)用中，酶的熱穩(wěn)定性成為首要考慮的重要參數(shù)，較好的溫度耐受性將極大的擴(kuò)展酶的使用范圍及應(yīng)用領(lǐng)域。

β-木糖苷酶的最適反應(yīng)溫度范圍一般為40 ℃～60 ℃（見表1），而近年來從一些嗜熱細(xì)菌和耐熱真菌中分離到的β-木糖苷酶都有較高的熱穩(wěn)定性。Bachmann 等研究發(fā)現(xiàn)褐色高溫單孢菌（Thermomonospora fusca）的β-木糖苷酶最適溫度達(dá)82 ℃，其活性可在65 ℃保持8 h 以上，在70 ℃也可以保持1.5 h[18]。Xue等從海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）中分離到一株極耐高溫的β-木糖苷酶，它的最適反應(yīng)溫度為90 ℃，在95 ℃時酶半衰期為22 min[39]。

3.3 金屬離子與β-木糖苷酶的活性

大多數(shù)酶屬于蛋白質(zhì)，因此其結(jié)構(gòu)和活性都有可能會受到金屬離子的影響。研究表明，金屬離子的種類以及濃度均會對β-木糖苷酶的活性產(chǎn)生顯著影響。例如，K+、Ca2+一般對β-木糖苷酶酶活力具有促進(jìn)作用。王嵐研究了不同金屬離子對來源于嗜熱真菌β-木糖苷酶活力的影響，一定濃度的K+、Ca2+可以提高酶活力的22.4%和14.8%[40]。Zanoelo 等曾報(bào)道Ca2+不僅可以提高真菌Scytalidium thermophilum 的β-木糖苷酶的酶活，還可以提高酶的熱穩(wěn)定性，使其在65 ℃下的半衰期從11 min 延長至30 min[41]。Hayashi 等研究也表明Ca2+可顯著提高β-木糖苷酶的活性[42]。而一些金屬離子如Hg2+的則對酶活力具有明顯的抑制作用[43-44]。

4 β-木糖苷酶的生產(chǎn)調(diào)控

已有研究表明，利用微生物生產(chǎn)β-木糖苷酶的過程受到多種因素的影響，比如碳源、氮源、碳氮比、初始pH 等。

4.1 不同碳源對β-木糖苷酶合成的影響

發(fā)酵過程中碳源不僅是微生物生長代謝的能量來源，也是酶合成的誘導(dǎo)物。因此碳源的種類會直接影響酶的活力和產(chǎn)率。Gasparic 等研究發(fā)現(xiàn)，分別以木聚糖和葡萄糖為碳源對菌株P(guān)revotella ruminicola B1進(jìn)行發(fā)酵，所產(chǎn)β-木糖苷酶酶活相差約20 倍，木聚糖對此菌株產(chǎn)β-木糖苷酶具有明顯的誘導(dǎo)作用[45]。Tsujibo 等證明Streptomycesthermoviolaceus OPC-520 β-木糖苷酶的活性可被樺木木聚糖及木寡糖（木二糖和木三糖）誘導(dǎo)，而單糖（如木糖、阿拉伯糖和葡萄糖）則不能誘導(dǎo)β-木糖苷酶的合成；試驗(yàn)同時顯示當(dāng)向含有樺木木聚糖的培養(yǎng)基中加入葡萄糖時，β-木糖苷酶的合成受到強(qiáng)烈抑制[46]。Zanoelo 等對Scytalidium thermophilum 產(chǎn)β-木糖苷酶的研究也發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中加入葡萄糖后可顯著降低β-木糖苷酶的活性，同時發(fā)現(xiàn)放線菌酮能阻斷木聚糖對酶的誘導(dǎo)作用[41]。毛連山等考察了不同分子量大小木聚糖作為碳源對里氏木霉（Trichoderma Reesei）RutC-30 產(chǎn)木聚糖酶酶系組成的影響，結(jié)果顯示低分子質(zhì)量的木聚糖有利于內(nèi)切-β-木聚糖酶的生成，而較高分子質(zhì)量的木聚糖則有利于β-木糖苷酶的誘導(dǎo)合成[47]。

4.2 氮源及碳氮比對β-木糖苷酶合成的影響

β-木糖苷酶的合成同時受酶誘導(dǎo)物和酶蛋白質(zhì)前體的調(diào)控，酶誘導(dǎo)物主要為菌株可利用的碳源，而酶蛋白質(zhì)的前體則主要來自于氮源。因此氮源的種類和添加量同樣會影響β-木糖苷酶的活力和產(chǎn)率。例如，王嵐研究了不同氮源對嗜熱擬青霉產(chǎn)胞外β-木糖苷酶的影響，結(jié)果顯示以牛肉蛋白胨為發(fā)酵氮源時產(chǎn)胞外β-木糖苷酶酶活最高，尿素次之。但以尿素為氮源時，發(fā)酵液中雜蛋白比例較低[40]。

另外，碳氮比也是影響微生物發(fā)酵產(chǎn)酶水平的重要因素，一般來說碳氮比過低容易造成微生物因氮源過多而生長過旺，進(jìn)而對碳源消耗過快導(dǎo)致酶合成水平下降；而碳氮比過高則會造成菌株因氮源不足而生長緩慢，同樣不利于酶的合成。毛連山等在研究里氏木霉RutC-30 產(chǎn)木聚糖酶時發(fā)現(xiàn)，較高的碳氮比會顯著促進(jìn)菌株β-木糖苷酶的發(fā)酵得率但同時會抑制內(nèi)切木聚糖酶的合成[48]。另外結(jié)果還顯示在以天然纖維質(zhì)材料為碳源進(jìn)行發(fā)酵時，碳源的利用順序?yàn)槟揪厶嵌罄w維素，同時發(fā)酵后期纖維素分解生成的葡萄糖也會對β-木糖苷酶的合成產(chǎn)生明顯的抑制作用。

4.3 其它因素對β-木糖苷酶合成的影響

pH 對微生物生命活動的影響很大。pH 的改變會引起細(xì)胞膜正負(fù)電荷的改變，從而引起細(xì)胞膜透性的變化，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、酶的形成及活力以及微生物的代謝途徑等。發(fā)酵過程中pH 的變化會直接影響微生物的生長及酶的合成，因此通過發(fā)酵初期及培養(yǎng)過程中pH 的調(diào)控也可以有效促進(jìn)特定酶系的合成。洪楓在研究初始pH 對里氏木霉合成木聚糖酶影響時發(fā)現(xiàn)，低pH 有利于β-木糖苷酶的合成，而且在低pH 條件下木糖苷酶表現(xiàn)出較高的活性，水解木聚糖效率提高了2-3 倍[49]。另外也有研究證實(shí)通過在培養(yǎng)基中添加合適的表面活性劑也可以促進(jìn)β-木糖苷酶的合成[50]。

5 β-木糖苷酶基因的克隆與表達(dá)

目前，已發(fā)現(xiàn)的天然菌株產(chǎn)β-木糖苷酶水平普遍不高并且所產(chǎn)酶系成分復(fù)雜難于純化。因此現(xiàn)階段要實(shí)現(xiàn)β-木糖苷酶較大規(guī)模生產(chǎn)還存在一定困難。而通過相關(guān)工程菌的構(gòu)建則是解決這一生產(chǎn)瓶頸的重要途徑。

相對國外而言，我國關(guān)于重組β-木糖苷酶的研究還比較有限。薛業(yè)敏等從Thermoanaerbacter ethanolicus JW200 克隆出編碼高度耐熱穩(wěn)定性的β-木糖苷酶的基因，以高拷貝質(zhì)粒pAlter2Ex1 在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，酶的熱穩(wěn)定性得到很大提升，重組酶的β-木糖苷酶在75 ℃時半衰期為1 h[51]。吳愛蓮以Thermoanaerobacterium sp.JW/SL YS485 中的β-木糖苷酶基因xylC 為研究對象，經(jīng)基因定點(diǎn)突變后在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，結(jié)果顯示利用工程菌株發(fā)酵產(chǎn)酶水平提高了55 倍（較天然菌株）[52]。梁艷麗等將Bacillus halodurans C-125 中編碼β-木糖苷酶的基因BH1068克隆到大腸桿菌中得到高效表達(dá)，使其穩(wěn)定性提高，并增加了酶對木糖的耐受性，對木糖的耐受能力由56 mmol/L 增加到300 mmol/L[53]。

國外關(guān)于β-木糖苷酶克隆及表達(dá)的研究相對較多。細(xì)菌有Aeromonas caviae ME-1、Bacillus pumilus、Butyrivibrio fibrisolvens、Streptomyces thermoviolaceus OPC-520、Thermotoga maritime 等，真菌有Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Trichoderma reesei、Talaromy ces emesonii 等。例如，Xue 等將海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）β-木糖苷酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，重組酶最適反應(yīng)溫度達(dá)到90 ℃[39]。Kitamoto 等將來源于Aspergillus oryzae KBN616 中的β-木糖苷酶基因在強(qiáng)啟動子調(diào)控下高效表達(dá)，產(chǎn)酶水平較對照組高出13 倍以上[54]。

6 β-木糖苷酶的應(yīng)用前景

隨著對β-木糖苷酶研究的深入，其應(yīng)用領(lǐng)域也越來越廣。能源工業(yè)方面，利用β-木糖苷酶與木聚糖酶的協(xié)同水解能夠高效降解木聚糖為木單糖，而木糖可以被繼續(xù)轉(zhuǎn)化為大宗化工原料（如乙醇、乳酸等）[55]。造紙工業(yè)中，β-木糖苷酶可作為生物漂白劑，已有文獻(xiàn)報(bào)道β-木糖苷酶單獨(dú)或者與木聚糖酶協(xié)同作用對麥草漿進(jìn)行預(yù)處理可以明顯提高漂白漿的白度[56]。在醫(yī)藥工業(yè)，還可以利用β-木糖苷酶水解去除木糖殘基來制造具有重要生理功能的紫杉醇[57]。在食品領(lǐng)域，β-木糖苷酶被應(yīng)用于食品焙烤、低聚木糖制備、酒類釀造等方面并取得了良好的使用效果。在環(huán)境保護(hù)方面，β-木糖苷酶的應(yīng)用使許多工農(nóng)業(yè)廢棄物以及一些生活垃圾可以更徹底的降解，有利于環(huán)境保護(hù)，同時β-木糖苷酶的使用減少了許多有害的有機(jī)或者無機(jī)化學(xué)試劑的應(yīng)用，有利于環(huán)境社會的可持續(xù)發(fā)展。

7 β-木糖苷酶研究的現(xiàn)存問題及方向

相對木聚糖酶系其它水解酶而言，β-木糖苷酶的相關(guān)研究仍相對薄弱，還存在一些問題需要進(jìn)行更加深入的研究。首先，目前用于較大規(guī)模生產(chǎn)的β-木糖苷酶多來自于轉(zhuǎn)基因微生物，而關(guān)于轉(zhuǎn)基因微生物的安全性評價方面還存在一些爭議，而目前發(fā)現(xiàn)的天然菌株產(chǎn)β-木糖苷酶水平普遍不高，高產(chǎn)β-木糖苷酶天然菌株的獲取仍是今后研究的重要組成部分。其次，當(dāng)前關(guān)于β-木糖苷酶的研究還主要集中在β-木糖苷酶的分離、生產(chǎn)、純化以及性質(zhì)研究等方面，局限在酶蛋白的整體層面，而對于其三維分子結(jié)構(gòu)和分子作用機(jī)制方面的研究還相對欠缺。到目前為止，還無法徹底解釋β-木糖苷酶與其他木聚糖降解酶系組分的協(xié)同機(jī)理、底物選擇專一性、底物誘導(dǎo)專一性以及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系等方面的問題。同時，隨著研究的不斷深入，一些新的問題不斷出現(xiàn)，需要作出合理的解釋，例如，在某種特定微生物當(dāng)中，β-木糖苷酶多樣性對于該微生物的意義及多種β-木糖苷酶之間的功能分配與協(xié)作問題等。在應(yīng)用方面，由于各應(yīng)用領(lǐng)域的工藝要求的不同，對β-木糖苷酶的性質(zhì)及穩(wěn)定性要求各不相同，而目前對于特定領(lǐng)域需要的β-木糖苷酶的針對性研究相對較少，使得β-木糖苷酶的應(yīng)用存在一定的局限性，有待進(jìn)一步研究。

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