美洲大蠊提取物CII-3體內(nèi)外抗HSV-2實(shí)驗(yàn)研究

普小菲，羅亦佳，彭 麗，李 嬌 ，曾 菁，牛春麗，彭 芳*

（1.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000；3.大理學(xué)院外國(guó)語(yǔ)學(xué)院，云南大理 671003；4.德宏州芒市人民醫(yī)院，云南德宏 678400）

近年來(lái)，生殖器皰疹（genital herpes，GH）的發(fā)病率在許多國(guó)家不斷上升，它已成為日益普遍的性傳播疾病，據(jù)WHO估計(jì)每年GH的新發(fā)病例約2000萬(wàn)〔1〕。目前引起GH最常見(jiàn)的病因是HSV感染，其中90%的病原體是HSV-2（Ⅱ型單純皰疹病毒，Herpes simplex virus-2）。目前，臨床上抗HSV的首選藥物為阿昔洛韋（acyclovir，ACV），它是核苷類藥物，選擇性高，對(duì)正常細(xì)胞毒性較小。然而，ACV口服吸收差，約15%～30%由胃腸道吸收，長(zhǎng)期使用有一定副作用，可引起接觸性皮炎及容易產(chǎn)生耐藥性〔2〕。因此，研發(fā)高效、低毒、不易產(chǎn)生耐藥性的抗HSV新藥具有重要意義。昆蟲(chóng)是自然界中最大的生物類群，有著獨(dú)特的免疫體系，它為天然藥物的開(kāi)發(fā)提供了一種新的資源。美洲大蠊（Periplaneta Americana）屬昆蟲(chóng)綱蜚蠊目蜚蠊科，俗稱“蟑螂”。自70年代以來(lái)，有研究人員對(duì)美洲大蠊進(jìn)行了大量研究，先后開(kāi)發(fā)出了美洲大蠊系列昆蟲(chóng)藥品，如康復(fù)新液〔3〕、肝龍膠囊〔4〕、心脈隆注射液〔5〕等。但蟑螂藥材中是否存在著抗病毒活性成分是不清楚的，因此本實(shí)驗(yàn)用美洲大蠊提取物CII-3進(jìn)行了體內(nèi)外抗HSV-2作用的研究，為美洲大蠊臨床抗病毒應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物 美洲大蠊提取物CII-3為黃褐色凍干粉末，由大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院張成桂博士提供。制備方法：將美洲大蠊干燥蟲(chóng)體粉碎后，用15倍量95%乙醇冷浸提取3次，所得乙醇液合并、濃縮后得到浸膏。將浸膏上聚酰胺柱，依次用水和不同比例的含水甲醇洗脫，定量收集，分別濃縮。其中某一劃段成分經(jīng)冷凍干燥后即得到所需的樣品。經(jīng)過(guò)計(jì)算，所提取物占生藥的比率為0.2%。注射用阿昔洛韋（湖北科益藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20120704-2）。

1.2 細(xì)胞與病毒 Vero細(xì)胞株（非洲綠猴腎細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)饋贈(zèng)）；HSV-2（II型單純皰疹病毒，江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng)）。

1.3 動(dòng)物 昆明種雌性小鼠，SPF級(jí)，體重（18±2）g，許可證號(hào)：SCXK（滇）NO.0020922，購(gòu)于昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.4 試劑盒 小鼠α腫瘤壞死因子（TNF-α）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒；小鼠γ干擾素（IFN-γ）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒；小鼠白細(xì)胞介素-2（IL-2）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.5 儀器 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司，METTLERAE240型）；電動(dòng)離心機(jī)（金壇市恒豐儀器廠，LXJ-A型）；超低速離心機(jī)（SiG?mA 1-14型）；CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司，BB16UV/BB5060UV型）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司，SN255939型）；超級(jí)純水機(jī)（成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠，KL-UP-UV-20型）；電熱恒溫水浴鍋（上海-恒科技有限公司，HWS12型）；旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司，XW-80A型）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)HSV-2的體外藥效學(xué)試驗(yàn)

細(xì)胞存活率（%）=給藥組OD值/正常細(xì)胞對(duì)照組OD值×100%

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=100%-細(xì)胞存活率

TC50=Antilog［B+（50-＜50%抑制百分率）/（＞50%抑制百分率-＜50%抑制百分率）］×C

其中C=A-B，A=log（抑制率＞50%的藥物濃度），B=log（抑制率＜50%的藥物濃度）。

2.1.2 病毒滴度測(cè)定 待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后棄生長(zhǎng)液，將稀釋度為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9的病毒液分別加到板內(nèi)，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72～96 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopatic effect，CPE），并判斷結(jié)果，按下列公式計(jì)算組織細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量（Tissue culture half infection dosage ，TCID50）〔6-7〕。

TCID50=病變率大于50%組稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比×稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)

距離比=（大于50%組的病變率-50%的病變率）/（大于50%組的病變率-小于50%組的病變率）

其中“病變率大于50%組”是指病變率超過(guò)50%的最低組；“病變率小于50%組”是指病變率小于50%的最高組。

協(xié)議書(shū)附圖主要是對(duì)陜西省鄉(xiāng)級(jí)行政區(qū)域界線與1∶50 000制圖數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合，并對(duì)界線兩側(cè)核實(shí)修正后的重要地物、地貌及主要地名等信息進(jìn)行修改，利用附圖模板通過(guò)制圖編輯而成。

2.1.3 藥物抗病毒實(shí)驗(yàn)（CPE法） 待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后棄生長(zhǎng)液，用維持液分別將樣品CII-3以2倍稀釋至 5個(gè)系列濃度（100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL 和 6.25 μg/mL），陽(yáng)性對(duì)照藥ACV稀釋至5個(gè)系列濃度（2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL、0.3125 μg/mL和0.156 μg/mL）。分別將上述系列濃度藥液各100 μL與病毒稀釋液（100TCID50）等體積混合后直接加到板內(nèi)，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，設(shè)病毒對(duì)照組、正常細(xì)胞對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72～96 h，當(dāng)病毒對(duì)照組的細(xì)胞病變達(dá)到“++++”，細(xì)胞對(duì)照組正常時(shí)，CPE觀察系列濃度藥液對(duì)HSV-2感染細(xì)胞的綜合作用〔8-9〕。

CPE的記錄方法為：無(wú)細(xì)胞病變?yōu)椤?”；1%～25%細(xì)胞出現(xiàn)病變?yōu)椤?”；26%～50%細(xì)胞病變?yōu)椤?+”；51%～75%細(xì)胞病變?yōu)椤?++”；76%～100%的細(xì)胞病變?yōu)椤?+++”。判斷結(jié)果，并計(jì)算藥物的IC50（半數(shù)抑制濃度，50%Inhibitory concentration）和TI（治療指數(shù)，Therapeatic index）。

2.2 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)GH小鼠的治療作用取體重為18～22 g健康昆明種雌性小鼠72只，隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性藥ACV對(duì)照組，CII-3高、中、低劑量組。用微量移液器吸取50 μL HSV-2病毒原液于小鼠陰道內(nèi)，用3 mm×3 mm×3 mm大小的明膠海綿塞住小鼠陰道口，1次/d，連續(xù)7 d。肉眼可見(jiàn)紅腫、皰疹、破損、糜爛及分泌物增多等癥狀時(shí)視為造模成功。造模成功后，開(kāi)始分別灌胃給藥治療，1次/d，連續(xù)給藥10 d。CII-3的低、中、高劑量分別為50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg。ACV為100 mg/kg，給藥容量為0.02 L/kg·d，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組給予0.5 mL等量的生理鹽水。在給藥治療10 d后，各組小鼠眼球取血于塑料試管內(nèi)，于冰浴中放置1～2 h后，以4℃、4000 r/min，離心10 min，取上清于Eppendorf離心管內(nèi)，-20℃保存待檢。分別用ELI?SA試劑盒檢測(cè)小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2的水平變化。各組小鼠眼球取血后，處死小鼠，取小鼠的胸腺和脾臟，用電子天平精密稱其重量，并按如下公式計(jì)算臟器指數(shù)〔10-11〕。

臟器指數(shù)＝相應(yīng)臟器重量（mg）/小鼠體重（g）

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 美洲大蠊提取物CII-3的細(xì)胞毒性測(cè)定 經(jīng)MTT法所測(cè)得的系列濃度藥液的細(xì)胞存活率（%）結(jié)果顯示：隨著藥物濃度的增大，美洲大蠊提取物CII-3的細(xì)胞毒性增大。當(dāng)濃度為250 μg/mL、500 μg/mL、1000 μg/mL時(shí)，可見(jiàn)明顯的細(xì)胞毒性，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、縮小和溶解破碎的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。CII-3的 TC50值為190.55 μg/mL，TC0為100 μg/mL；陽(yáng)性對(duì)照藥ACV對(duì)正常Vero細(xì)胞的細(xì)胞毒性很小，其 TC50和 TC0值均大于 100 μg/mL；溶劑對(duì)照組（0.5%DMSO）沒(méi)有細(xì)胞毒性，Vero細(xì)胞形態(tài)與正常細(xì)胞對(duì)照組無(wú)明顯差別。見(jiàn)表1。

表1 美洲大蠊提取物CⅡ-3對(duì)Vero細(xì)胞的細(xì)胞毒性（±s，n=3）

表1 美洲大蠊提取物CⅡ-3對(duì)Vero細(xì)胞的細(xì)胞毒性（±s，n=3）

注：①ACV的濃度為100 μg/mL；②與正常細(xì)胞對(duì)照組比較*P＜0.05，▲P＞0.05。

CII-3 ACV 0.5%DMSO細(xì)胞對(duì)照20.7±0.8*99.4±3.00▲100.8±2.05▲100.0±0.0017.9±1.51*26.2±2.09*94.2±9.42112.0±9.12*115.0±4.58*

3.2 病毒滴度測(cè)定 CPE觀察結(jié)果所示，HSV-2的TCID50為 10-4.52，即接種滴度為 10-4.52的 HSV-2 病毒液每孔100 μL，可導(dǎo)致50%的培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變，實(shí)驗(yàn)用的病毒滴度為100 TCID50。見(jiàn)表2。

3.3 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)病毒所致CPE的作用 美洲大蠊提取物CII-3有抗HSV-2活性，從最低稀釋濃度藥液至最高稀釋濃度藥液，其細(xì)胞病變程度逐漸減輕。陽(yáng)性對(duì)照藥ACV表現(xiàn)出很好的抗HSV-2活性，當(dāng)ACV在0.625 μg/mL時(shí)仍能較好的抑制病毒所致病變。見(jiàn)表3。

表2 HSV-2的病毒滴度測(cè)定

美洲大蠊提取物CII-3的IC50值為28.71 μg/mL；ACV能顯著抑制HSV-2，其IC50值小于0.31 μg/mL。以TC50/IC50計(jì)算TI結(jié)果，美洲大蠊提取物CII-3和ACV對(duì)HSV-2的TI值分別為6.64 μg/mL和大于322.58 μg/mL。見(jiàn)表4。

表3 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)HSV-2所致細(xì)胞病變的作用

表4 美洲大蠊提取物CII-3抗HSV-2活性結(jié)果

3.4 GH小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2的水平變化

3.4.1 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)TNF-α的影響給藥組的TNF-α水平與正常組和模型組比較均有所升高；ACV組，CII-3高、中劑量組與正常組和模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明CII-3能使小鼠血清中TNF-α的含量增加；CII-3高、中劑量組與ACV組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表5。

表5 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)TNF-α的影響（± s,n=12）

表5 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)TNF-α的影響（± s,n=12）

注：與正常組比較*P＜0.05，與模型組比較▲P＜0.05，與ACV組比較★P＜0.05。

89.09±22.71★86.63±10.90★138.73±28.06*▲125.84±21.48*▲133.59±21.57*▲108.73±25.23★正常組模型組ACV組CII-3（高）CII-3（中）CII-3（低）— —10020010050

3.4.2 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)IFN-γ的影響 與正常組比較，感染病毒后模型組小鼠血清中IFN-γ的水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ACV組、CII-3組與正常組比較IFN-γ的水平亦顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明CII-3能使小鼠血清中IFN-γ的含量增加；CII-3中劑量組與ACV組比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表6。3.4.3 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)IL-2的影響 與正常組比較，感染病毒后模型組小鼠血清中IL-2的水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CII-3中劑量組與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明CII-3中劑量組能夠增加小鼠血清中IL-2的水平。模型組、CII-3低劑量組與ACV組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表7。

表6 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)IFN-γ的影響（± s,n=12）

表6 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)IFN-γ的影響（± s,n=12）

注：與正常組比較*P＜0.05，與模型組比較▲P＜0.05，與ACV組比較★P＜0.05。

44.31±11.07▲★99.91±19.62*★127.49±34.69*▲81.45±27.39*★109.16±37.17*81.40±21.90*★正常組模型組ACV組CII-3（高）CII-3（中）CII-3（低）— —10020010050

表7 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)IL-2的影響（± s,n=12）

表7 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)IL-2的影響（± s,n=12）

注：與正常組比*P＜0.05，與模型組比較▲P＜0.05，與ACV組比較★P＜0.05。

33.37±4.82▲23.64±1.58*★36.82±2.39▲38.30±3.72▲41.6±8.59*▲27.87±1.42*★正常組模型組ACV組CII-3（高）CII-3（中）CII-3（低）— —10020010050

3.5 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)GH小鼠免疫器官指數(shù)的影響 感染病毒后模型組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與正常組和ACV組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CII-3高、中、低劑量組的胸腺指數(shù)與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CII-3各劑量組的脾臟指數(shù)與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CII-3高劑量組與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；說(shuō)明CII-3能夠增加小鼠的臟器指數(shù)。見(jiàn)表8。

表8 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)小鼠胸脾指數(shù)的影響（±s,n=12）

表8 美洲大蠊提取物CII-3對(duì)小鼠胸脾指數(shù)的影響（±s,n=12）

注：與正常組比較*P＜0.05，與模型組比較▲P＜0.05，與ACV組比較★P＜0.05。

2.91±0.63▲1.83±0.11*★3.44±0.99▲4.06±1.28*▲3.54±1.04▲3.45±0.63▲正常組模型組ACV組CII-3（高）CII-3（中）CII-3（低）— —100200100503.09±0.80▲2.11±0.56*★3.17±0.69▲3.51±1.03▲3.37±0.63▲2.70±1.44

4 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，美洲大蠊提取物CII-3隨著給藥濃度的增大，對(duì)正常Vero細(xì)胞的毒性逐漸增強(qiáng)，CII-3 的 TC50值 為 190.55 μg/mL。CII-3 有 抑 制HSV-2致細(xì)胞病變的作用，其IC50值為28.71 μg/mL，TI值為6.64 μg/mL。ACV對(duì)正常Vero細(xì)胞的細(xì)胞毒性很小，其TC50值＞100 μg/mL。ACV具有很好的抗HSV-2活性，其IC50值＜ 0.31 μg/mL，TI值大于322.58 μg/mL。美洲大蠊提取物CII-3有一定的細(xì)胞毒性，與低毒的ACV比較，TI值相距甚遠(yuǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，在細(xì)胞培養(yǎng)中用濃度為0.5%的DMSO溶解藥物〔12〕，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，而本次實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)。病毒感染人體后，可引起免疫反應(yīng)，機(jī)體在抗HSV-2感染中主要依賴于細(xì)胞免疫反應(yīng)。Th1是CD4+T細(xì)胞中的一類亞群，主要分泌TNF-α、IFN-γ和IL-2等細(xì)胞因子，從而介導(dǎo)細(xì)胞免疫〔13〕。TNF-α在體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)活性，它是免疫應(yīng)答中的一種中間介質(zhì)，有著抗病毒作用。IFN-γ能激活T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞活性及增加它們對(duì)病毒感染細(xì)胞的殺傷力。IL-2是一種比較重要的淋巴因子，其主要生物學(xué)活性是促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖以及促進(jìn)B細(xì)胞分化和增殖，并促進(jìn)抗體的生成〔14-15〕。胸腺和脾臟是機(jī)體的免疫器官，其中胸腺是首要的中樞免疫器官，脾臟是最大的外周免疫器官，它們?cè)诿庖呦到y(tǒng)中均發(fā)揮著重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，美洲大蠊提取物CII-3能夠提高小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2的水平，還能使小鼠的免疫器官重量增加。上述研究結(jié)果表明，美洲大蠊提取物CII-3有抗HSV-2作用，分析其可能是通過(guò)提高機(jī)體免疫功能而發(fā)揮抗病毒作用，具有良好的應(yīng)用前景。

〔1〕袁靜，錢(qián)芳.單純皰疹病毒感染在婦產(chǎn)科疾病的研究現(xiàn)況〔J〕.疾病監(jiān)測(cè)與控制雜志，2013，7（11）:676-677.

〔2〕趙勤，馮寶平，胡銳，等.朱砂七抗Ⅱ型單純皰疹病毒的體外研究〔J〕.中藥藥理與臨床，2012，28（3）：79-81．

〔3〕梁麗.康復(fù)新液治療小兒皰疹性口腔炎的療效分析〔J〕.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（19）:3618-3619.

〔4〕李武，段麗芳，何貴清，等.美洲大螊提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的影響〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（5）:1137-1138.

〔5〕黃鋰新，吳星恒.心脈隆對(duì)窒息新生鼠心肌缺氧誘導(dǎo)因子-1α的影響〔J〕.中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2009，11（8）:683-686.

〔6〕左婭，朱慧娟，劉軍.板藍(lán)根多糖抗單純皰疹病毒Ⅱ型的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.華西藥學(xué)雜志，2013，28（3）∶267-269.

〔7〕王芳宇，張啟鋒，何麗芳，等.殼聚糖碘液體外抗人單純皰疹病毒2型的作用〔J〕.中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2011，25（2）：101-103.

〔8〕瞿暢，賴志才，裴贏，等.余甘子提取物體外抗單純皰疹病毒1型和2型的初步研究〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（4）:784-786.

〔9〕張少華，孟紅.翼果苔草提取物體外抗病毒的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.山東中醫(yī)雜志，2010，29（4）：262-263.

〔10〕周至品，梁華娟，萬(wàn)新祥，等.皺瘤海鞘體外抗單純皰疹病毒2型感染及其作用機(jī)制〔J〕.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（10）：827-831．

〔11〕劉卉，程培華.生殖器皰疹的研究和治療進(jìn)展〔J〕.實(shí)用皮膚病學(xué)雜志，2010，3（1）：21-27.

〔12〕張麗娟，王鳳斌，梁靜，等.二甲基亞砜對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響〔J〕.濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，30（6）:487-489.

〔13〕莫翔，韋又銘.復(fù)發(fā)性生殖器皰疹患者免疫細(xì)胞功能研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（15）：2385-2387.

〔14〕滿潔，倪吉志，王雪寧，等.初發(fā)和復(fù)發(fā)生殖器皰疹患者NK、LAK細(xì)胞活性和T細(xì)胞亞群的比較〔J〕.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2010，5（16）:128-129.

〔15〕賴迪輝，朱威，連石.單純皰疹病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2010，6（177）:380-381.