miR-34c對(duì)I I型子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響

李甫鑰，薛紀(jì)森，黃亦波，陳慧君，鄭飛云

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

miR-34c對(duì)I I型子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響

李甫鑰，薛紀(jì)森，黃亦波，陳慧君，鄭飛云

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325015）

目的：研究miR-34c對(duì)Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡的影響。方法：用hsa-miR-34c mimics轉(zhuǎn)染HEC-1-B細(xì)胞。流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后miR-34c的表達(dá)。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的改變。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察miR-34c對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的長(zhǎng)期抑制。流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果：細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為81.16%。相對(duì)于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組miR-34c表達(dá)明顯增加，細(xì)胞增殖、克隆形成能力減弱，凋亡增加（P＜0.05）。結(jié)論：miR-34c能明顯抑制Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，是Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌的潛在抑癌基因。

miR-34c；Ⅱ型子宮內(nèi)膜腫瘤；細(xì)胞；增殖；凋亡

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率正逐年上升[1-2]。手術(shù)是目前子宮內(nèi)膜癌的主要治療方法。根據(jù)組織學(xué)特征、生物學(xué)表現(xiàn)及臨床預(yù)后等，子宮內(nèi)膜癌分為I型和I I型兩種類型[3]。I型子宮內(nèi)膜癌為雌激素受體陽(yáng)性的高分化子宮內(nèi)膜樣腺癌，占子宮內(nèi)膜癌的80%左右，一般預(yù)后較好；I I型為雌激素受體陰性的子宮內(nèi)膜癌，較少見(jiàn)，主要包括漿液性腺癌、透明細(xì)胞癌及其他低分化癌[4]，分化較差，預(yù)后不良。因此，尋找新的治療方法對(duì)于改善I I型子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后具有重大意義。微RNA（miRNA）是一種長(zhǎng)約18～24個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，通過(guò)對(duì)mRNA剪切或翻譯抑制來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA可作為癌基因或抑癌基因參與多種癌的發(fā)生和發(fā)展（包括胃癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、淋巴瘤等）[6]。miRNA為腫瘤的治療提供了新的思路，并可能在分子水平對(duì)未來(lái)腫瘤治療產(chǎn)生巨大的影響。我們以前的研究[7]通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)子宮內(nèi)膜癌miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常子宮內(nèi)膜，miR-34c在I I型子宮內(nèi)膜癌中呈明顯低表達(dá)，提示miR-34c可能是I I型子宮內(nèi)膜癌的抑癌基因之一。本研究通過(guò)上調(diào)I I型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的miR-34c表達(dá)并對(duì)其生物學(xué)功能的改變進(jìn)行檢測(cè)，從而進(jìn)一步了解miR-34c在I I型子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器hsa-miR-34c mimics（5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’）、miRNA mimics陰性對(duì)照（5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’）及FAM標(biāo)記的hsa-miR-34c mimics（上海吉瑪公司），hsa-miR-34c上游引物（5’-AGGCAGTGTAGTTAGCTGATTGC-3’）及U6上游引物（5’-CGCAAGGATGACACGCAAATTC-3’）（Invitrogen公司），胎牛血清、低糖DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司），lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、CCK-8試劑（碧云天生物技術(shù)研究所），Trizol試劑、miRNA反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（Invitrogen公司），SYBR GREEN（TOYOBO公司）；ELX800酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-TEK公司），Applied Biosysystems 7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)B-D公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系的選擇及培養(yǎng)：HEC-1-B細(xì)胞系為雌激素受體ERα及ERβ均陰性的細(xì)胞系[8]，根據(jù)I I型子宮內(nèi)膜癌雌激素受體陰性的分類標(biāo)準(zhǔn)，我們選擇HEC-1-B細(xì)胞（購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)）作為I I型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系。

HEC-1-B細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶面積的90%以上時(shí)用胰酶消化，收集細(xì)胞，離心、重懸后，按1:3傳代。

1.2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染率檢測(cè)：轉(zhuǎn)染前24 h按約2×105個(gè)/孔的量將細(xì)胞接種于6孔板（96孔板接種2 500個(gè)/孔），24 h后細(xì)胞覆蓋約30%～50%的孔底面積時(shí)，按照l(shuí)ipofectamine 2000試劑說(shuō)明書(shū)操作分別轉(zhuǎn)染hsa-miR-34c mimics和NC。實(shí)驗(yàn)分三組：實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染hsa-miR-34c mimics）、NC組（轉(zhuǎn)染miRNA mimics陰性對(duì)照）、空白組（不轉(zhuǎn)染）。轉(zhuǎn)染后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的hsa-miR-34c mimics（記為FAM組），24 h后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光，拍照。將獲取的細(xì)胞用PBS洗滌、離心、重懸后，避光。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)帶熒光的細(xì)胞量，通過(guò)與空白組的比較得出細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率。

1.2.3 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定miR-34c的表達(dá)：用6孔板鋪板、轉(zhuǎn)染后48 h，用Trizol試劑提取總RNA（其中包含miRNA），用核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA純度，保證A260/A280在1.8～2.0范圍內(nèi)。根據(jù)miRNA反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明，對(duì)提取的RNA中的miRNA加多聚A尾，然后進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄為cDNA。完成反轉(zhuǎn)錄后，以U6作為內(nèi)參進(jìn)行下一步的實(shí)時(shí)定量熒光PCR，反應(yīng)為10 μ L體系：5μ L的SYBR-Green試劑、1μ L濃度為1μmol/ L的特異性miR-34c或U6上游引物、1 μL濃度為1 μmol/L的下游通用引物（試劑盒內(nèi)提供）、1μL之前合成的cDNA模板（1:10稀釋后），2μ L的DEPC水。將反應(yīng)體系置于實(shí)時(shí)定量PCR儀內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃變性3 min后，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min）。反應(yīng)完成后，根據(jù)各組的miR-34c及內(nèi)參U6的CT值用2-△△Ct法計(jì)算每組miR-34c的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 CCK-8測(cè)細(xì)胞增殖：轉(zhuǎn)染前24 h，以2 500個(gè)細(xì)胞/孔的濃度鋪96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。24 h后轉(zhuǎn)染（方法同前述），轉(zhuǎn)染后置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)96 h后用不含血清的DMEM培養(yǎng)液換液，每個(gè)孔各加10 μ L的CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱1 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔450 nm波長(zhǎng)的吸光度，通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組與NC組及空白組的吸光度來(lái)反映有活性的細(xì)胞數(shù)量的差別。

1.2.5 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)：為進(jìn)一步觀察miR-34c對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的長(zhǎng)期抑制作用，我們對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的克隆形成能力進(jìn)行研究。鋪板、轉(zhuǎn)染后72 h，胰酶消化、收集、離心各組細(xì)胞，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以800個(gè)細(xì)胞/孔的濃度鋪6孔板，混勻，使細(xì)胞均勻地分布于孔的底部。置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3～4 d換培養(yǎng)液，約14 d后，細(xì)胞在孔底形成肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞團(tuán)塊。用結(jié)晶紫染液對(duì)細(xì)胞團(tuán)染色30 min，PBS洗滌2～3次后，拍照、計(jì)數(shù)。

1.2.6 流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)細(xì)胞凋亡：鋪6孔板、轉(zhuǎn)染后72 h，胰酶消化、收集、離心各組細(xì)胞，棄上清，PBS洗滌、離心2次，根據(jù)Annexin V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒的說(shuō)明，使用100μ L緩沖液重懸細(xì)胞，用5 μ L的Annexin V和1 μ L的PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色15 min，再用400μ L緩沖液稀釋。用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。各組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，并用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率細(xì)胞轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的hsa-miR-34c mimics 24 h后，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)明顯的細(xì)胞內(nèi)熒光（見(jiàn)圖1A）。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)比較實(shí)驗(yàn)組與空白組帶熒光細(xì)胞量（見(jiàn)圖1B），實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)染效率為81.16%。

圖1 轉(zhuǎn)染后24 h細(xì)胞熒光及轉(zhuǎn)染效率

2.2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-34c的表達(dá)上調(diào)轉(zhuǎn)染48 h后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定miR-34c的相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)圖2A和圖2B的融解曲線判斷，miR-34c及U6的引物特異性較好，可認(rèn)為PCR結(jié)果可靠。用2-△△Ct法計(jì)算miR-34c相對(duì)表達(dá)量顯示：實(shí)驗(yàn)組為373.43±74.95，NC組為1.01±0.19，空白組為1.14±0.16。實(shí)驗(yàn)組的miR-34c表達(dá)量明顯高于NC組及空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖2C）。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-34c能抑制細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)染96 h后，加入CCK-8后，用酶標(biāo)儀測(cè)得每組的450 nm波長(zhǎng)的吸光度，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組為0.56±0.02，NC組為1.00±0.04，空白組為1.03±0.02。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖明顯受抑制，抑制率約為44%，與NC組及空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖3）。

2.4 miR-34c抑制細(xì)胞克隆的形成細(xì)胞生長(zhǎng)14 d后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4A，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞克隆形成能力明顯下降。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆數(shù)（見(jiàn)圖4B），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆數(shù)明顯少于NC組和空白組（實(shí)驗(yàn)組為48.7 ±2.5，NC組為149.6±4.0，空白組為143.0± 2.6），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-34c的表達(dá)情況（2-△△Ct法）

圖3 轉(zhuǎn)染后96 h細(xì)胞增殖情況（450 nm波長(zhǎng)）

2.5 miR-34c促進(jìn)細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染72 h后，流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)細(xì)胞的凋亡（見(jiàn)圖5），右下象限為早期凋亡細(xì)胞，右上象限為晚期凋亡細(xì)胞，兩者之和為細(xì)胞總的凋亡。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率高于NC組和空白組（實(shí)驗(yàn)組為11.96±0.90，NC組為5.05±0.43，空白組為5.25±0.83），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

3 討論

miRNA為近年來(lái)腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。越來(lái)越多的研究顯示其通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)，顯著改變多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期及侵襲能力等[6，9]，在腫瘤診斷及治療方面有著極大的潛力。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miR-34家族成員（包括miR-34a、miR-34b和miR-34c）是p53抑癌基因的靶點(diǎn)，通過(guò)與p53的相互作用而起到抑癌作用[10]。研究證實(shí)miR-34家族參與多種腫瘤的形成與發(fā)展，包括肝癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤及白血病等[11-12]。目前，關(guān)于miR-34c對(duì)子宮內(nèi)膜癌的生物學(xué)作用的研究甚少，尤其是對(duì)I I型子宮內(nèi)膜癌的作用國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

在分子學(xué)水平理解腫瘤的發(fā)病機(jī)制是成功找到新的治療方法的重要途徑[13]。子宮內(nèi)膜癌I I型較I型少見(jiàn)，但是預(yù)后明顯比I型差，病死率高，有學(xué)者認(rèn)為這與I I型子宮內(nèi)膜癌的高侵襲性和高復(fù)發(fā)率相關(guān)[14]。但從分子水平考慮其預(yù)后差是否與miRNA相關(guān)還不清楚，鑒于我們之前研究發(fā)現(xiàn)的miR-34c在I型子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)與正常子宮內(nèi)膜無(wú)明顯差別，而在I I型子宮內(nèi)膜癌中呈明顯低表達(dá)[7]，我們認(rèn)為I型和I I型子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的差別可能與miR-34c相關(guān)。為進(jìn)一步研究miR-34c的抑癌作用，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染hsa-miR-34c mimics上調(diào)I I型子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞miR-34c的表達(dá)。流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)染率達(dá)80%以上。實(shí)時(shí)熒光定量PCR再次驗(yàn)證，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組miR-34c表達(dá)明顯上調(diào)，與流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果一致，證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。用CCK-8試劑測(cè)細(xì)胞增殖能力的改變，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖明顯被抑制。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-34c對(duì)I I型子宮內(nèi)膜癌有長(zhǎng)期抑制作用。更重要的是，流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)凋亡發(fā)現(xiàn)miR-34c也能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過(guò)實(shí)驗(yàn)的觀察，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凋亡能進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖及細(xì)胞克隆形成能力。根據(jù)以上結(jié)果，我們認(rèn)為miR-34c是I I型子宮內(nèi)膜癌的潛在抑癌基因。

Tanaka等[15]對(duì)間皮細(xì)胞中miR-34的作用進(jìn)行研究，證明miR-34通過(guò)調(diào)節(jié)MET蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，并調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這與我們?cè)贗I型子宮內(nèi)膜癌中觀察到的結(jié)果一致，但miR-34c在I I型子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制及其是否也與MET和Bcl-2有關(guān)仍需進(jìn)一步研究證明。

綜上所述，miR-34c能明顯抑制I I型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并可能與I I型子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后差相關(guān)。miR-34c作為I I型子宮內(nèi)膜癌的潛在抑癌基因，可能為將來(lái)I I型子宮內(nèi)膜癌在分子水平的早期診斷及治療提供新的方法，成為手術(shù)之外更有效的治療方法之一。但目前大部分miRNA的作用機(jī)制尚未研究清楚，miR-34c的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

圖5 流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)凋亡

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（本文編輯：吳健敏）

The influence of miR-34c on growth and apoptosis of type II endometrial carcinoma cell line HEC-1-B

LI Fuyao, XUE Jisen, HUANG Yibo, CHEN Huijun, ZHENG Feiyun.Department of Gynecology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To investigate the effect miR-34c on the growth and apoptosis of type II endometrial carcinoma cells (HEC-1-B cell line).Methods:Up-regulated the expression of miR-34c by transfecting cells with hsa-miR-34c mimics, the transfection efficiency was detected by flow cytometry and further verified by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Cell proliferation assay by CCK-8 and colony formation assay applied to demonstrate that miR-34c could inhibit the growth of HEC-1-B cells. Cells apoptosis assay was analyzed by flow cytometry.Results:The transfection efficiency was 81.16%. The overexpression of miR-34c (detected by qRT-PCR) could inhibit cell proliferation, colony formation and promote cells apoptosis (P <0.05).Conclusion:MiR-34c can inhibit the growth and promote apoptosis of HEC-1-B cells significantly, and function is a potential tumor suppressor in type II endometrial carcinoma.

miR-34c; type II endometrial carcinoma; cell; proliferation; apoptosis

R711

A

1000-2138（2014）02-0086-05

2013-09-25

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2 090 69 9）。

李甫鑰（1989-），男，浙江蒼南人，碩士生。

鄭飛云，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：zfy5710 @163.com。