RhoA基因在胰腺癌組織中的表達及其與腫瘤臨床病理特征的關系

李金海，戴華衛(wèi)，張海峰

（溫州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院 普通外科，浙江 溫州 325200）

·論 著·

RhoA基因在胰腺癌組織中的表達及其與腫瘤臨床病理特征的關系

李金海，戴華衛(wèi)，張海峰

（溫州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院 普通外科，浙江 溫州 325200）

目的：探討RhoA基因在胰腺癌組織中的表達情況及其與胰腺癌臨床病理特征的關系。方法：應用實時熒光定量PCR與Western blot同步檢測48例胰腺癌患者癌組織及對應癌旁組織中RhoA mRNA及蛋白的表達情況，分析RhoA基因的表達與胰腺癌組織臨床病理參數(shù)的關系。結果：腫瘤組織中RhoA mRNA的表達量明顯高于癌旁組織（t=3.669，P=0.0007），RhoA mRNA在胰腺癌中的表達水平與腫瘤分化程度、有無門脈及淋巴結轉移、pTNM病理分期密切相關，在中、低分化腫瘤（t=2.447，P=0.006）、門靜脈受侵犯（t=2.544，P=0.008）、淋巴結轉移（t=2.351，P=0.041）和pTNM分期較晚（Ⅲ和Ⅳ期，t=2.667，P=0.025）的患者中明顯升高。Western blot結果顯示腫瘤組織中RhoA蛋白的表達水平明顯高于癌旁組織（t=3.461，P=0.0003）；RhoA蛋白表達量與腫瘤侵襲能力以及腫瘤分期相關，RhoA蛋白的含量在中、低分化腫瘤（t=2.323，P=0.016）、門靜脈受侵犯（t=2.119，P=0.036）、淋巴結轉移（t=2.117，P=0.029）和pTNM分期較晚（Ⅲ和Ⅳ期，t=2.776，P=0.004）的患者中明顯升高。結論：RhoA基因可能成為一種新的腫瘤標志物，用于判斷腫瘤分化程度、轉移能力和預后評估。

胰腺腫瘤；病理學，臨床；基因表達；RhoA

胰腺癌是惡性程度高、病死率高的消化道惡性腫瘤，早期診斷和治療一直是本專業(yè)領域的難題。隨著分子診斷水平的提高，開發(fā)早期分子標志物以加強對胰腺癌的早期診斷、治療及預后判斷是目前研究的重點[1-2]。Rho蛋白屬于小G蛋白超家族的亞家族成員，不僅參與細胞凋亡過程，而且決定細胞凋亡的開始[3-4]。RhoA基因與腫瘤浸潤轉移關系密切，但其在胰腺癌組織中的研究甚少。本研究目的在于探討RhoA基因在胰腺癌組織中的表達情況并分析其與胰腺癌臨床病理特征的關系。

1 材料和方法

1.1 材料選取我院2009-2012年行手術切除后經病理診斷為胰腺癌的標本48例，并以癌旁胰腺組織作為對照。組織學分級依據(jù)國際腫瘤組織學胰腺癌腫瘤分級標準。腫瘤的臨床分期按照國際抗癌協(xié)會pTNM分期。

1.2 實時熒光定量PCR檢測取所有標本的癌組織和癌旁胰腺組織各約40 mg，對每例標本的總RNA進行提取。樣品進行目的基因的PCR擴增，產物做梯度稀釋，用于做標準曲線樣品。在同一塊96孔板中加入制備好的樣品及標準曲線樣品。RhoA上游引物序列為5’-GAGCACACAAGGCGGGAG-3’，下游引物序列為5’-TGCCATATCTCTGCCTTCTTCA-3’；探針序列為5’-CCAAGATGAAGCAGGA-GCCGGTGA-3’。PCR循環(huán)條件：50個循環(huán)內50 ℃變性2 min，95 ℃退火10 min，95 ℃延伸30s，60 ℃再延伸30 s。重復3次。然后把加好樣品的96孔板放在ABI 7700 Sequence Detector（購于上?？祷镉邢薰荆┥线M行反應，對標準曲線和樣品的質量及濃度范圍進行檢測，標準曲線的相關系數(shù)應接近1。樣品定量結果與βactin（購自美國eBioscience公司）相比為標本所測mRNA濃度。

1.3 Western blot測定三去污裂解液（購自美國eBioscience公司）提取細胞總蛋白，所得總蛋白經15%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉移至硝酸纖維素膜上，NBT/BCIP顯色，計算機掃描蛋白質條帶做灰度分析。以β-actin作內參照，RhoA/β-actin（灰度值的比值）代表RhoA的相對表達量，每個樣本重復3次。

1.4 免疫組織化學染色按常規(guī)方法操作，ABC法染色。RhoA抗體（購自美國Bioworld生物科技有限公司）1:50稀釋。

1.5 統(tǒng)計學處理方法應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用Student’s t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RhoA mRNA的表達通過實時熒光定量PCR方法對胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中RhoA mRNA的表達水平進行檢測。圖1顯示胰腺癌組織中RhoA mRNA的表達量明顯高于癌旁胰腺組織（t=3.669，P=0.0007）。由表1可見RhoA mRNA胰腺癌組織中的表達水平與腫瘤分化程度、門脈轉移、淋巴結轉移及pTNM分期相關，在中、低分化腫瘤、門靜脈受侵犯、有淋巴結轉移和pTNM分期較晚（I I I和I V期）的患者中明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 胰腺癌的臨床特征與RhoA mRNA和蛋白表達的關系

圖1 實時熒光定量PCR方法檢測胰腺癌和癌旁胰腺組織中RhoA mRNA的表達

2.2 RhoA蛋白的表達通過Western blot對胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中RhoA蛋白的表達情況進行檢測，結果顯示胰腺癌組織中RhoA蛋白的表達水平明顯高于癌旁胰腺組織（t=3.461，P=0.0003）。表1顯示RhoA蛋白的含量在不同腫瘤大小、不同腫瘤灶數(shù)量間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但在中、低分化腫瘤、門靜脈受侵犯、有淋巴結轉移和pTNM分期較晚（I I I和I V期）的患者中明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），表明RhoA蛋白的表達與胰腺癌的分化程度、有無門靜脈侵犯、有無淋巴結轉移及pTNM分期相關。見表1、圖2。

圖2 Western blot檢測RhoA蛋白的表達

2.3 免疫組織化學染色結果48例胰腺癌組織中RhoA表達陽性者有35例（占72.9%），癌旁胰腺組織中表達陽性者有21例（占43.8%），胰腺癌組織RhoA蛋白陽性率高于癌旁胰腺組織。RhoA蛋白主要沿細胞膜內側呈線性分布，并在胞漿內呈散在棕色顆粒分布，胰腺癌組織表達主要為彌漫性分布，亦有較多局部或灶性分布，癌旁胰腺組織陽性表達以彌漫性分布為主，局部或灶性分布偏少（見圖3）。

3 討論

圖3 胰腺癌和癌旁胰腺組織中RhoA蛋白的表達（ABC，×100）

Rho家族蛋白作為一種具有GTP酶活性的小分子G蛋白，含有Rho、Rac、Cdc42三個亞家族，23個成員，主要通過參與調節(jié)肌動蛋白（細胞骨架）的活動、細胞分裂增殖、細胞變形的過程，繼而達到發(fā)揮調控腫瘤生長轉移的作用。Rho家族蛋白幾乎參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的每個環(huán)節(jié)，其中包括調節(jié)細胞骨架和細胞周期，改變細胞黏附和運動，改變細胞轉化，參與腫瘤細胞侵襲轉移，腫瘤細胞傳代等。體外實驗表明，Rho家族蛋白可以決定乳腺癌、前列腺癌及宮頸癌等多種腫瘤細胞的浸潤、轉移能力[5]。Ariake等[6]實驗證實GCF2/LRRFIP1通過整合依賴RhoA蛋白活性來提高結腸癌的轉移及肝臟浸潤能力。此外，在肝癌、頭頸部惡性腫瘤及膀胱癌等多種腫瘤的癌細胞和細胞外基質中均有RhoA蛋白的高表達，其高度表達與腫瘤的遠處轉移、侵襲關系密切[7-9]。陳碧君等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Rho-ROCK細胞信號內途徑參與胰腺纖維化，并對慢性胰腺炎、胰腺癌及糖尿病的治療有重要意義。Paul等[11]通過熒光實時影像系統(tǒng)技術（fluorescence lifetime imaging microscopy-fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)LIM-FRET）檢測RhoA蛋白活性的研究證實，突變型P53基因通過抑制RhoA蛋白活性來抑制胰腺癌細胞侵襲及轉移。

由于受到病程、個體情況、治療干預等因素的影響，要準確判斷腫瘤組織的侵襲性存在困難，目前也沒有公認的標準。根據(jù)腫瘤的臨床病理特點進行分類簡單易行，而且具有較高的準確性[12]。因此，本研究中我們按照腫瘤大小、數(shù)目、腫瘤分化程度、有無門靜脈侵犯、有無淋巴結轉移和腫瘤的pTNM分期等條件將所有胰腺癌分為兩組，并應用實時熒光定量PCR、Western blot技術檢測胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中RhoA mRNA和蛋白的相對表達水平，結果提示，RhoA在胰腺癌組織中高表達，其表達量與胰腺癌的分化程度、門靜脈轉移、淋巴結轉移以及pTNM分期相關。隨著胰腺癌惡性程度及pTNM分期的增高，RhoA蛋白表達也增加，由此結果推測，RhoA蛋白可能參與了胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程。Brad等[13]認為RhoA蛋白可以通過血管內皮生長因子誘導血管生成，從而促使腫瘤細胞向周圍血管侵襲。本研究結果顯示有門靜脈侵犯或淋巴結轉移的胰腺癌組織中RhoA mRNA和蛋白的表達量明顯高于無門靜脈侵犯及無淋巴結轉移的胰腺癌組織，提示RhoA基因表達與胰腺癌的轉移能力密切相關。

綜上所述，RhoA蛋白不但在胰腺癌組織中表達增高，而且與胰腺癌的分化程度、門靜脈侵犯及淋巴結轉移與否及惡性程度密切相關。RhoA蛋白及其表達水平有望作為診斷及評判胰腺癌惡性程度的腫瘤標志物之一。

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（本文編輯：丁敏嬌）

RhoA gene expression and clinicopathology parameters in pancreatic carcinoma

LI Jinhai, DAI Huawei,

ZHANG Haifeng.Department of General Surgery, the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325200

Objective: To investigate the expression of RhoA gene in tissues of pancreatic cancer and to discuss its significance during carcinogenesis and progression of tumor.Methods:Intratumor RhoA expression level was determined and compared with that in adjacent nontumorous pancreatic tissues using quantitative real time polymerase chain reaction and Western blot in 48 samples of pancreatic carcinoma.Results:The mRNA levels of RhoA were significantly higher in tumor tissues than that in the unaffected portions (t=3.669, P=0.0007). The expression of RhoA mRNA in the primary lesion was higher in patients with low and middle differentiation cancer (t=2.447, P=0.006), protal vein invasion (t=2.544, P=0.008), lymph node metastasis (t=2.351, P=0.041), and advanced pTNM stage (stage III/IV, t=2.667, P=0.025) than in those without. There was a significant difference between high RhoA protein levels in the tumor tissues and noncancerous tissues in pancreatic carcinoma patients(t=3.461, P=0.0003), the quantity of RhoA expression associated with tumor invasion and metastasis. There was a significant association between high tumor RhoA protein levels and low and middle differentiation cancer (t=2.323, P=0.016), and the presence of protal vein invasion (t=2.119, P=0.036), lymph node metastasis (t=2.117, P=0.029), and advanced pTNM stage (t=2.776, P=0.004).Conclusion:There is a significant correlation among RhoA expression, tumor stage, and metastasis. The expression of RhoA can be used as a good tumor marker for invasive and advanced pancreatic carcinoma as well as a prognosis predictor.

pancreatic neoplasms; pathology, clinical; gene expression; RhoA

R735.2

A

1000-2138（2014）02-0130-04

2013-04-27

李金海（1983-），男，山東棗莊人，住院醫(yī)師，碩士。