TMSG-1蛋白不同功能域重組質(zhì)粒構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071 1 病理學(xué)教研室； 2 附屬醫(yī)院病理科； 3 附屬醫(yī)院血管外科)

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因1(TMSG-1)是馬春樹等[1]于2002年應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)，在人前列腺癌細(xì)胞系中首先克隆出來的一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)基因。TMSG-1定位于染色體1q21.3，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA長約2.4 kb，編碼蛋白質(zhì)全長為380個氨基酸，相對分子質(zhì)量為45 000。TMSG-1可以抑制前列腺癌、肺癌、乳癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力，又被稱為LASS2或CerS2，LASS2主要促進(jìn)長鏈脂酰神經(jīng)酰胺C22:0和C24:0-CoA特異的神經(jīng)酰胺的合成[2]。目前，對于TMSG-1的研究主要集中于腫瘤轉(zhuǎn)移抑制和神經(jīng)酰胺合成方面，對該基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控的研究鮮有報道。研究結(jié)果顯示，TMSG-1蛋白含有Homeodomain結(jié)構(gòu)域和一個潛在的核定位信號(NLS)[3]，推測TMSG-1有可能作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮對特定基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。本文把TMSG-1分成長度不同、包含不同結(jié)構(gòu)域的片段，構(gòu)建不同截短體的真核表達(dá)載體，并進(jìn)一步研究各個截短體的亞細(xì)胞定位，探討TMSG-1蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

TMSG-1全長基因并帶有Flag標(biāo)簽蛋白的pcDNA3質(zhì)粒，來自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子病理室。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a、pfu DNA聚合酶、2×Taq PCR Master Mix及DNA Marker，均購自北京天根公司；細(xì)菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基、Agarose及氨芐青霉素鈉購自Amreso公司；限制性內(nèi)切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ、T4 DNA連接酶及dNTP Mixture均購自Takara公司；DNA凝膠回收試劑盒及構(gòu)建質(zhì)粒提取試劑盒購自Takara公司；質(zhì)粒中提精提試劑盒購自Promega公司；PCR引物由上海生工公司合成；所有重組質(zhì)粒由上海生工公司測序鑒定；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；Flag鼠抗人單克隆抗體購自Sigma公司。

1.2 PCR擴增各截短體基因序列

構(gòu)建不同截短體(圖1)，分別為TLC domain(T1)、Homeodomain+TLC domain(T2)、第一個跨膜區(qū)+Homeodomain(T3)、第一個跨膜區(qū)(T4)、Homeodomain(T5)及全長TMSG-1。根據(jù)Genbank提供的TMSG-1的cDNA序列設(shè)計引物，以帶Flag標(biāo)簽蛋白的TMSG-1全長質(zhì)粒為模板，引物信息見表1。上游和下游引物5′端分別加EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ進(jìn)行酶切。擴增體系100 μL,內(nèi)含：全長質(zhì)粒0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 8 μL，10×PS Buffer 10 μL及DNA聚合酶(5×106U/L)0.5 μL，最后加水至100 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min或30 s，30個循環(huán)；72 ℃恒育8 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。

1.3 截短體真核表達(dá)載體的構(gòu)建

將上述凝膠回收的截短體PCR產(chǎn)物和空質(zhì)粒pcDNA3.0-flag進(jìn)行EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ充分雙酶切，酶切產(chǎn)物再次回收目的片段。再將純化的截短體DNA片段與線性pcDNA3-flag按照1∶4(mol/L)比例進(jìn)行16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素挑選陽性克隆，搖菌擴大培養(yǎng)后菌液提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后凝膠電泳初步鑒定，鑒定正確的克隆進(jìn)一步測序鑒定。

表1 TMSG-1真核表達(dá)載體構(gòu)建引物表

1.4 Western blot鑒定截短體蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)細(xì)胞增殖至90%且狀態(tài)良好，應(yīng)用Promega試劑盒中量精提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染步驟[4]按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行，每瓶細(xì)胞轉(zhuǎn)染12 μg質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染4 h后更換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后用RIPA細(xì)胞裂解液收集總蛋白，Westren blot方法[5]鑒定截短體蛋白表達(dá)。

1.5 免疫熒光觀察截短體亞細(xì)胞定位

截短體重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染24 h后的Hela細(xì)胞爬片過夜，冷丙酮固定20 min，PBS漂洗后用體積分?jǐn)?shù)0.01的BSA常溫封閉30 min，加入抗Flag一抗37 ℃孵育2 h，PBS漂洗后加入FITC標(biāo)記的二抗，PBS漂洗后DAPI染核3 min，甲醇洗8 min，體積分?jǐn)?shù)0.90甘油封片。奧林巴斯BX43熒光顯微鏡下觀察，以出現(xiàn)綠色熒光信號為陽性表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增各截短體重組質(zhì)粒DNA片段

TMSG-1截短體T1長761 bp，為129～380位氨基酸，包括1個TLC結(jié)構(gòu)域；T2長945 bp，為71～380位氨基酸，包括Homeodomain和TLC結(jié)構(gòu)域；T3長390 bp，為1～128位氨基酸，內(nèi)部包含1個Homeodomain結(jié)構(gòu)域；T4長198 bp，為1～70位氨基酸，僅包含了結(jié)構(gòu)域前端的跨膜序列；T5長185 bp，為71～128位氨基酸，為Homeodomain結(jié)構(gòu)域。見圖2。

2.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定

各截短體及TMSG-1全長重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR Ⅰ和Xho1雙酶切均得到2條帶，分別為4 500 bp的質(zhì)粒條帶和TMSG-1基因各截短片段。酶切前后對比結(jié)果見圖3。

圖1 TMSG-1各截短體示意圖

圖2 PCR擴增TMSG-1全長及各截短體基因片段

圖3 各截短體及TMSG-1全長質(zhì)粒酶切結(jié)果

每相鄰兩泳道代表酶切前后的重組質(zhì)粒。酶切前僅一條大于4 500 bp的條帶；酶切后可見兩條帶，大者為約4 500 bp的空質(zhì)粒條帶，小者分別對應(yīng)各截短片段長度761、945、390、198、185及1 143 bp。

2.3 截短體蛋白表達(dá)

TMSG-1全長蛋白相對分子質(zhì)量為45 000，根據(jù)氨基酸片段長度，預(yù)測截短體T1～T5 Flag融合蛋白相對分子質(zhì)量約為2.5×104、3.4×104、1.6×104、1.0×104、1.0×104。Western blot獲得蛋白條帶位置與預(yù)測接近。見圖4。

2.4 截短體亞細(xì)胞定位

含有Homeodomain結(jié)構(gòu)域的截短體T2、T3及T5熒光信號主要位于細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的熒光信號較弱，其中T2熒光信號在核內(nèi)呈顆粒狀或團塊狀彌漫分布，T3及T5主要呈團塊狀分布，類似核仁的形態(tài)，考慮為核仁定位；T1、T4、TMSG-1全長及空載體主要在胞質(zhì)出現(xiàn)綠色熒光信號。見圖5。

圖4 Western blot鑒定TMSG-1全長及各截短體重組質(zhì)粒蛋白表達(dá)

3 討 論

TMSG-1是一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，它可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-9]。TMSG-1作為人LASS蛋白家族成員之一，其氨基端均含有1個Homeodomain結(jié)構(gòu)域(LASS1除外)[10]。Homeodomain被證實是一個DNA結(jié)合功能域，含有Homeoprotein的蛋白可能與染色體DNA結(jié)合，具有轉(zhuǎn)錄因子活性，有轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用，如Homeobox基因CDX2[11]。轉(zhuǎn)錄因子存在兩種亞細(xì)胞定位模式，一種是細(xì)胞核分布，另一種是細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)分布，在特定的信號刺激之下由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，核定位信號在這一轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機制中發(fā)揮了重要作用。另外，生物信息學(xué)預(yù)測也顯示，TMSG-1蛋白Homeodomain結(jié)構(gòu)域中的C末端119～128位氨基酸有連續(xù)4個精氨酸RRRR序列，這種結(jié)構(gòu)通常被認(rèn)定為核定位信號[3]。而潛在核定位信號的存在為TMSG-1有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的設(shè)想提供有力支持。

為了明確TMSG-1蛋白是否能入細(xì)胞核，哪段區(qū)域能入核，本文初步針對其基因序列進(jìn)行解體，成功構(gòu)建不同長度的截短體，分別包含TMSG-1蛋白不同結(jié)構(gòu)域，其中截短體T2、T3和T5均含有Homeodomain結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞免疫熒光觀察顯示，截短體T2、T3及T5定位于細(xì)胞核，其中T2在核內(nèi)呈顆粒狀彌漫分布，T3及T5則主要呈團塊狀定位于核仁。說明預(yù)測的Homeodomain結(jié)構(gòu)域中的核定位信號發(fā)揮作用，引導(dǎo)截短體蛋白入核的可能性極大；T3及T5主要定位于核仁，進(jìn)一步表明這一預(yù)測核定位信號極可能是核仁定位信號，類似情況以往有文獻(xiàn)報道過[12]。

TMSG-1基因自1999年被成功克隆之后一直作為一種膜蛋白被研究，未見有其轉(zhuǎn)錄因子活性的報道。但是膜蛋白同樣可以有轉(zhuǎn)錄因子活性，如甾醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白(SREBP-1)本身是一種膜結(jié)合蛋白，在細(xì)胞中被SREBP裂解激活蛋白(SCAP)降解之后入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能[13]。已有研究結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞中含有Homeodomain結(jié)構(gòu)域的截短體能夠入核，且已知約39%的含有Homeoprotein的蛋白為轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄激活或者抑制作用[14]。因此，我們提出以下設(shè)想：TMSG-1蛋白有可能作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，TMSG-1有可能和其他轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、STAT一樣在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有著更為廣泛的作用和更為重要的地位?；谶@一目標(biāo)，本文從基因結(jié)構(gòu)入手，構(gòu)建TMSG-1不同截短體的真核表達(dá)質(zhì)粒，初步確定各截短體的亞細(xì)胞定位，為研究其轉(zhuǎn)錄功能打下重要基礎(chǔ)。其確切的核定位信號及入核機制有待于進(jìn)一步研究。

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