頜面部發(fā)育畸形與維甲酸及信號分子通路

肖 晶

(大連醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔基礎(chǔ)教研室，遼寧 大連116044)

頜面部發(fā)育主要經(jīng)歷5 個(gè)階段，首先是在外胚層和神經(jīng)外胚層交界處的顱神經(jīng)嵴細(xì)胞(cranial neural crest cells，CNCC)被誘導(dǎo)，游走并遷移到面部始基，隨后CNCC 的區(qū)域性增殖導(dǎo)致面部原基的外向性生長，即面部突起的形成，然后面部突起融合初步完成了面部形態(tài)，最后骨骼的定向生長決定了面部的外形［1］。

1 顱頜面部骨骼的發(fā)育、腭裂的形成及分子機(jī)制

1.1 顱頜面部骨骼的起源、發(fā)生及分子機(jī)制

顱頜面部骨骼大部分來源于神經(jīng)褶背側(cè)邊緣的顱神經(jīng)嵴，少部分細(xì)胞為中胚層來源［2-4］。以小鼠為例，其額骨是神經(jīng)嵴來源，頂骨是中胚層來源，襯在額骨和頂骨內(nèi)的硬腦膜來源于神經(jīng)嵴，而冠狀縫和矢狀縫處的結(jié)締組織則來源于中胚層。顱頜面部骨包括腦顱骨和面骨，面顱以及腦顱頂和兩側(cè)的骨頭由膜內(nèi)骨化形成，而支撐顱底骨大多由軟骨內(nèi)骨化形成。頜面部大部分骨通過膜內(nèi)骨化方式成骨，如上頜骨，下頜骨體。

CNCC遷徙至鰓弓和額鼻突后，與原有的中胚層構(gòu)成外胚層間充質(zhì)，在相鄰上皮作用下，外胚間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)生移行、識別、聚集及增生，進(jìn)而形成凝集區(qū)。凝集區(qū)的細(xì)胞進(jìn)一步產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)并分化成骨和軟骨。CNCC 最終能否分化成骨細(xì)胞，取決于其與上皮細(xì)胞間的相互作用。在此過程中，基因和轉(zhuǎn)錄因子如Barx1，Dlx1，Dlx2，Dlx5，Msx1，Hoxa2，Hoxa3，Twist，BMP4，TGFα［5］及維甲酸的目的基因Hoxa1，Hoxb1 和其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子AP -2，Pax3 等對形成顱面骨形成過程中神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷徙和分化起重要作用［6］。

在顱頜面骨的發(fā)育中，成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)的調(diào)控較為重要且研究較深入［7-8］。哺乳動物的FGF 基因家族有22 個(gè)成員，人和鼠FGF 受體(FGF receptor，F(xiàn)GFR)有4 種基因型(FGFR1 ～4)，絕大多數(shù)的FGF 作為細(xì)胞外蛋白，通過結(jié)合并活化細(xì)胞表面FGFR 發(fā)揮作用。在脊椎動物中4 個(gè)FGFR 基因產(chǎn)生7 個(gè)FGF 受體蛋白，即FGFR1b、1c、2b、2c、3b、3c 和4，各自均有不同的配體特異性，每種FGFR 至少可以被5 個(gè)FGF 配體激活［9］。FGFR1 和FGFR2 在發(fā)育中的頜面始基廣泛地表達(dá)。FGFR1 功能衰減但不完全消失，小鼠出現(xiàn)許多頭面部骨和軟骨的畸形，而且80%發(fā)生腭裂。通過將神經(jīng)嵴細(xì)胞中的FGFR1 亞等位基因恢復(fù)到野生型可以修復(fù)已發(fā)生的發(fā)育缺陷，這也證明了FGF 信號分子在面部始基中的神經(jīng)嵴細(xì)胞分布以及模式發(fā)生中是不可或缺的［10］。FGF8 與維甲酸關(guān)系密切［11-12］，并在頜面部早期的模式發(fā)生中起重要作用。在面部始基活躍生長時(shí)(E10.5)，F(xiàn)GF8 基因突變小鼠表現(xiàn)為心臟發(fā)育異常以及廣泛的頭顱面畸形。在早期面部發(fā)育和前腦形成中，F(xiàn)GF8 是Wnt/β-catenin 通路的目的基因［13］。過量或缺乏維甲酸可引起發(fā)育畸形，而且在胚胎早期發(fā)育中，除了FGF8，維甲酸與SHH 以及WNT 信號密切相關(guān)［11-12，14］。

1.2 腭的發(fā)育

腭的發(fā)育是一個(gè)動態(tài)的過程，被分為垂直生長期，上抬及水平生長期及接觸融合期。在人胚胎第6 周末(小鼠胚胎11.5 天，E11.5)，從左右兩個(gè)上頜突的口腔側(cè)中部向原始口腔內(nèi)各長出一個(gè)突起，稱側(cè)腭突或繼發(fā)腭，是繼發(fā)腭的形成起始期;在胎兒第6 周晚期至第7 周早期(小鼠E12.5 -E13.5)，兩側(cè)的側(cè)腭突向中線方向生長，但由于此時(shí)舌發(fā)育得很快，形態(tài)窄而高，幾乎完全充滿了口鼻腔，并且與發(fā)育中的鼻中隔有所接觸，所以側(cè)腭突很快便轉(zhuǎn)向下即垂直方向生長，稱垂直生長期，此時(shí)的側(cè)腭突位于舌的兩側(cè);在人胚胎第7 周晚期至第8 周早期(小鼠E14 -E14.5)，由于下頜骨的生長發(fā)育使其長度和深度有所增加，頭顱向上抬高以及側(cè)腭突內(nèi)細(xì)胞的增殖等因素，舌的形態(tài)逐漸變?yōu)楸馄?，位置下降進(jìn)入口腔之中，隨之，側(cè)腭突發(fā)生水平向的轉(zhuǎn)動并朝中線方向生長，即上抬及水平生長期;人胚胎第8 周(小鼠E14.5 -E15.5)，左右兩側(cè)的側(cè)腭突與前腭突自外向內(nèi)、向后方逐漸融合并與向下生長的鼻中隔發(fā)生融合，即接觸融合期［15-16］。

腭裂發(fā)生的原因一是由于腭突內(nèi)部的缺陷，二是繼發(fā)于頜面部其他組織的缺陷，如臨床上頜發(fā)育不足和下頜后縮，導(dǎo)致舌位置異常，從而物理性地阻礙腭突上抬，最終導(dǎo)致腭裂［4］。

腭中嵴上皮(middle edge epithelium，MEE)細(xì)胞是腭突融合前位于腭突近中邊緣嵴的外胚層細(xì)胞［17］，其轉(zhuǎn)歸形式的改變可能與腭裂發(fā)生關(guān)系密切。MEE 細(xì)胞在融合期發(fā)生凋亡，從而使兩側(cè)EPM細(xì)胞互相長入，完成腭突的最終融合。本課題組以往的研究發(fā)現(xiàn):在腭突的接觸融合過程中，在對照組，雙側(cè)腭突沿水平方向生長延伸，兩側(cè)腭突接觸后，MEE 細(xì)胞形成腭中嵴上皮帶，后斷裂形成上皮島，MEE 細(xì)胞發(fā)生凋亡，MEE 逐漸消失，雙側(cè)腭突的間充質(zhì)相互貫通;在E10 給予維甲酸，胎鼠雙側(cè)腭突形態(tài)發(fā)育障礙，未相互接觸，腭突內(nèi)MEE 細(xì)胞未發(fā)生凋亡，而分化為口腔樣復(fù)層鱗狀上皮。

2 舌的來源及發(fā)育機(jī)制

舌的結(jié)締組織及血管結(jié)構(gòu)來源于CNCC，其觸發(fā)了舌始基的形成，而且對舌間質(zhì)結(jié)締組織有作用，這些結(jié)締組織最終將舌肌分隔并為其提供附著點(diǎn)。研究表明:CNCC 比舌肌細(xì)胞先到達(dá)舌原基部位，只是包圍在舌肌細(xì)胞周圍。CNCC 來源的間充質(zhì)在發(fā)育過程中的兩個(gè)主要作用:(1)為舌肌細(xì)胞的組織、遷移提供支架;(2)調(diào)控舌肌細(xì)胞的生存、增殖和分化。舌肌細(xì)胞起源于軸旁中胚層的體節(jié)，枕區(qū)第2至5 體節(jié)腹側(cè)細(xì)胞喪失其上皮細(xì)胞形態(tài)，變成單個(gè)細(xì)胞，即形成肌原祖細(xì)胞。來自不同體節(jié)的肌原祖細(xì)胞形成單向細(xì)胞流，沿特定部位——舌下神經(jīng)，遷移至舌原基部位。舌肌原祖細(xì)胞遷移到第一腮弓和舌原基不需要CNCC 的參與。當(dāng)肌原祖細(xì)胞進(jìn)入顱面部，就與CNCC 緊密接觸。這種關(guān)系在舌形態(tài)發(fā)育的整個(gè)過程都存在［18］。

舌的組織結(jié)構(gòu)和功能的主體是舌肌，舌肌屬于骨骼肌。四肢和軀干肌肉的發(fā)育過程和分子機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，這些為頜面部肌肉的發(fā)育提供了信息。骨骼肌發(fā)育經(jīng)歷一系列過程，包括確定、遷移、增殖、分化和成熟。其發(fā)育分化的過程可分為以下幾個(gè)階段:前體細(xì)胞期、成肌細(xì)胞期、從成肌細(xì)胞分化成為合胞肌管的肌管期以及分化成熟后進(jìn)入肌纖維期。這些過程通過內(nèi)在信號因子如Pax3，Pax9 以及成肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors，MRFs)的調(diào)節(jié)，包括MyoD，Myf5，Myogenin 和Myf6(也稱MRF4 或herculin)［19-20］。MRFs 均為MyoD家族基因所編碼，MyoD 家族是bHLH 蛋白家族中的重要一員，多數(shù)骨骼肌受bHLH 的調(diào)節(jié)。成肌調(diào)節(jié)因子成員Myf5 和MyoD 基因在增殖的未分化肌原細(xì)胞中都有表達(dá)，控制著成肌細(xì)胞的分化方向，Myf5還對未分化的肌細(xì)胞如肌衛(wèi)星細(xì)胞起到維持作用，MyoD 則在肌生成早期參與肌管形成。Myogenin 在肌管形成中通過控制成肌細(xì)胞的融合和肌纖維的形成對肌分化起關(guān)鍵作用，而Myf4 則與肌纖維的成熟和保持有關(guān)［21］。因此，MRFs 與肌原纖維粗絲的組成單位——肌球蛋白(Myosin)一起常被作為骨骼肌發(fā)育分化的標(biāo)記物。

舌復(fù)雜的來源及其重要的功能使得研究雖然困難卻很有價(jià)值。雖與軀干和四肢肌來源不同，舌肌的發(fā)育仍需要成肌調(diào)節(jié)因子的調(diào)控［22］。舌發(fā)育早期，間充質(zhì)中可檢測到Fgf7 和Fgf10 的高表達(dá)，表明它們是舌發(fā)育時(shí)期的主要配體。Fgfrs 和某些Fgfs在舌旺盛增殖時(shí)期的高表達(dá)，可能是在胚胎早期發(fā)揮促有絲分裂的作用。Fgf2 在胚胎晚期以及出生后的舌肌中仍能檢測到，提示其與舌的分化也相關(guān)［23］。神經(jīng)嵴細(xì)胞即非肌原細(xì)胞中缺乏Tgfbr2 導(dǎo)致小舌畸形，F(xiàn)gf10 表達(dá)下調(diào)，成肌細(xì)胞增殖減少，舌肌細(xì)胞數(shù)量減少以及舌肌組織紊亂［24］。TGF-β 通過細(xì)胞自分泌的方式誘導(dǎo)Scx 的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴細(xì)胞分泌生長因子以及組織之間的相互作用調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖。另外，TGFβ -Smad4 -Fgf6 信號級聯(lián)調(diào)控舌肌的成肌分化以及肌細(xì)胞的融合［25］。到目前為止，對于調(diào)控舌肌發(fā)育的分子機(jī)制仍知之甚少。

3 腭、舌發(fā)育過程中的互動及關(guān)聯(lián)

舌是參與發(fā)音與吞咽等功能的重要器官，舌的正常發(fā)育對口腔內(nèi)相關(guān)結(jié)構(gòu)的正常發(fā)育是很重要的，尤其與腭的發(fā)生過程密不可分。以小鼠為例，E11.5 天腭突與舌幾乎同時(shí)進(jìn)入發(fā)育起始期，舌始基在口腔底部隆起;E12.5 天(相當(dāng)于腭突垂直生長期)側(cè)腭突與舌共同經(jīng)歷快速增殖期，舌繼續(xù)增大并占據(jù)整個(gè)口腔，但尚缺乏組織分化;之后舌間充質(zhì)出現(xiàn)區(qū)域性密集，少數(shù)細(xì)胞伸長分化為成肌細(xì)胞。在E14 ～14. 5 天，腭與舌二者經(jīng)歷關(guān)鍵的位置互動，舌的形態(tài)逐漸變?yōu)楸馄讲⑾陆滇尫懦隹臻g后，原先在舌兩側(cè)垂直向生長的側(cè)腭突才可發(fā)生水平向翻轉(zhuǎn)并朝中線方向生長。至E15 天，當(dāng)側(cè)腭突逐漸向中線靠攏時(shí)，舌肌分化完成，肌細(xì)胞成束排列，胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多肌原纖維，舌肌收縮給予腭部壓力，并促使腭最終關(guān)閉［26-27］。因此，腭突與舌發(fā)生位置互換、水平向轉(zhuǎn)動及腭關(guān)閉的發(fā)育過程均依賴于舌與腭的協(xié)調(diào)運(yùn)動。在小鼠動物模型中，腭的發(fā)育(E13.5)較舌(E11.5)開始的較晚。胚胎期舌的快速下降是腭正常發(fā)育的關(guān)鍵，這一過程的延遲可能擾亂了正常的腭突的上抬，進(jìn)而可能導(dǎo)致腭裂。

如前所述，TGF -β 通路不但參與包括舌肌在內(nèi)的骨骼肌的發(fā)育，而且與腭發(fā)育相關(guān)，Tgfbr2 基因敲除小鼠發(fā)生腭裂［28］。RA 可提高TGF -β2 雜合子小鼠腭裂的發(fā)生率，可誘導(dǎo)鼠腭胚間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TGF-β2 mRNA 及蛋白，誘導(dǎo)的TGF -β2 至少可部分介導(dǎo)RA 對這些細(xì)胞增殖的抑制作用。RA信號通過其(RARE)抑制心肌的Tbx2 -Tgfβ2 通路從而參與心臟血管的發(fā)育［29］。這些信息提示，信號分子的協(xié)同作用，共同參與包括腭和舌在內(nèi)的口腔頜面部發(fā)育。

4 維甲酸通路與腭裂及舌發(fā)育異常的相關(guān)性

4.1 維甲酸通路

維甲酸(retinoic acid，RA)是維生素A 的衍生物，包括多種同分異構(gòu)體，如全反式RA(ATRA)、9 -順式RA、3 -4 雙脫氫RA 等。在RA 信號通路中，通過與其膜上受體結(jié)合，被RA 結(jié)合蛋白(cellular retinol - binding proteins，CRBPs)從細(xì)胞漿運(yùn)輸?shù)胶藘?nèi)染色體上的受體部位，RARs 和RXRs 兩個(gè)家族均為核內(nèi)受體，每個(gè)都包含由不同基因編碼的α、β 與γ3 個(gè)亞類。與受體結(jié)合后，核內(nèi)的維甲酸受體(RA receptors，RARs)和視黃醇X 受體(Retinoid X receptors，RXRs)的二聚體RAR/RXR 的配體結(jié)合域發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，繼而啟動由RNA 多聚酶Ⅱ、TATA結(jié)合蛋白(TATA -binding protein，TBP)和TBP 相關(guān)因子(TBP associated factors，TAFs)構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物而調(diào)控下游靶基因的功能。與受體結(jié)合的靶序列被稱為維甲酸效應(yīng)元件(RARE)，它一般存在于靶基因的啟動子及調(diào)控順序部分［11-12，14］。維甲酸信號的功能最終是通過基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的，如生長因子、細(xì)胞因子及其受體、激素、轉(zhuǎn)錄因子、激酶等，都受維甲酸的調(diào)節(jié)。隨著研究的深入越來越多的RA 靶基因被發(fā)現(xiàn)，如Fibroblast growth factor 8(Fgf8)，Sonic hedgehog(Shh)，Left -right determination factor 1 (Lefty1)等信號分子，生長激素、同源框基因以及一些核受體等［11-12］。

RA 的表達(dá)水平和分布受其合成酶(Raldh1，2，3)和分解酶(Cyp26a1，b1，c1)的嚴(yán)格控制，從而形成一定分布梯度以調(diào)節(jié)胚胎的模式發(fā)生和分化［11-12，14］。在研究較多的后腦節(jié)段發(fā)育過程中，信號分子和RA 合成酶及分解酶呈明顯的梯度分布模式，例如一種基于降解的分布模式:首先RA 的初始產(chǎn)物受Raldh2 的正調(diào)節(jié)，之后RA 又正調(diào)節(jié)Cyp26以使自身降解，同時(shí)又受FGF 信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)，可以說RA 的濃度梯度受兩種相斥作用因子梯度分布的影響［11］。

4.2 維甲酸通路在腭裂及舌發(fā)育異常中的作用

RA 與WNT、FGF、TGF 及SHH 等信號分子通路共同參與頜面部發(fā)育的調(diào)控，在模式發(fā)育、面突和鰓弓的分化及融合過程中有嚴(yán)格的時(shí)間和空間順序［30］。過多量或過少的維甲酸都會引起發(fā)育畸形［12］。由于被廣泛應(yīng)用為惡性腫瘤和皮膚疾病的治療藥物，懷孕的母親很容易通過各種途徑接觸和攝入，RA 成為新生兒頜面畸形的較常見環(huán)境因素［31］。RA 導(dǎo)致畸形機(jī)制主要是影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的游走，通過干擾DNA 合成而抑制間充質(zhì)細(xì)胞的增殖，并導(dǎo)致腭突間充質(zhì)的異常凋亡，引起包括腭裂在內(nèi)的顱頜面先天性發(fā)育缺陷［32-34］。維甲酸的功能是通過與其相應(yīng)的膜上受體結(jié)合，通過細(xì)胞漿內(nèi)的維甲酸結(jié)合蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)，最終通過影響基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的。Wnt、FGF、BMP 和Shh 等信號分子通路中的重要基因都已被證明參與到維甲酸致腭裂的發(fā)病過程。

維甲酸誘導(dǎo)的腭裂伴發(fā)舌發(fā)育異常(本課題組未發(fā)表數(shù)據(jù))。有趣的是，維甲酸通路及其相關(guān)基因被敲除后也出現(xiàn)了舌發(fā)育異常和/或頜骨發(fā)育畸形所導(dǎo)致的腭裂。T - box 轉(zhuǎn)錄因子成員Tbx1 是DiGeorge/Velo-cardio -facial 綜合征的候選基因，該綜合征是人類最常見的染色體缺失型先天性遺傳病，常伴有心臟畸形和腭裂，Tbx1 基因缺陷小鼠的表型與人類相似，且維甲酸合成的減少，成肌調(diào)節(jié)因子MyoD 和Myf5 在咽弓不表達(dá)，并出現(xiàn)第一腮弓來源的下頜舌骨肌和二腹肌前部缺失或發(fā)育不全，雖然腭發(fā)育相對正常，但張口和降下頜肌群導(dǎo)致張口受限，使腭板不能上抬而發(fā)生腭裂［35-36］。Homeobox (Hox)是一類具有同源異型盒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子，是維甲酸通路的重要靶基因。在Hoxa2突變小鼠中，出現(xiàn)了舌骨舌肌與舌骨附著異常導(dǎo)致舌不能下降，以致于干擾腭板上抬和融合導(dǎo)致腭裂發(fā)生［37-38］。Satb2 已被發(fā)現(xiàn)是Hoxa2 上游基因，可與Hoxa2 基質(zhì)連接區(qū)結(jié)合而直接調(diào)控Hoxa2 基因。SATB2 基因是人類2q32 -q33 刪除相關(guān)的腭裂以及頜面發(fā)育畸形的候選基因［39］，Satb2 基因敲除小鼠也出現(xiàn)了腭裂和舌畸形的表型，并引起Hoxa2 在額鼻部的表達(dá)上調(diào)［40-41］。并有報(bào)道Satb2 與頜骨發(fā)育相關(guān)，Satb2 基因缺失導(dǎo)致頜面部間充質(zhì)凋亡和與頜面發(fā)育基因Pax9，Alx4 及Msx1 表達(dá)模式的改變［42］。Sonic Hedgehog(Shh)信號分子通路被報(bào)道直接參與維甲酸對胚胎發(fā)育的調(diào)控，也是RA 的靶基因。Shh 通路中的Gli3 基因敲除小鼠出現(xiàn)腭裂以及舌形態(tài)與位置異常，但Gli3 基因敲除小鼠腭板在體外進(jìn)行器官培養(yǎng)時(shí)，腭板可相互接觸融合，提示舌發(fā)育異常是導(dǎo)致Gli3 敲除小鼠腭裂發(fā)生的原因［43］。

5 結(jié) 語

維甲酸作為抗腫瘤藥物已被臨床上廣泛應(yīng)用，但它對先天性發(fā)育畸形的致畸作用也不容忽視，尤其對頜面部發(fā)育的影響至關(guān)重要。關(guān)于維甲酸的靶分子的信息尚不完全清楚，信號分子之間的關(guān)系仍然紛繁復(fù)雜。對維甲酸誘導(dǎo)的先天性發(fā)育畸形動物模型的生物信息學(xué)分析顯得尤為重要，本課題組近期內(nèi)將同一模型組織的micro RNA 芯片結(jié)果與基因芯片結(jié)果加以比對后，發(fā)現(xiàn)非常有趣的對應(yīng)關(guān)系，這將為揭示維甲酸致先天性發(fā)育畸形的機(jī)制提供新的視角，同時(shí)為維甲酸臨床應(yīng)用以及先天性發(fā)育畸形的預(yù)防和再生修復(fù)提供支撐。

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