板藍(lán)根及所含靛藍(lán)和靛玉紅強(qiáng)烈抑制小鼠腎主要有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體Oat1，Oat2和Oat3

奇錦峰，孫 晨，王永輝，余文浩，韓 堅(jiān)，林 梅，張 娜

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東廣州 510006；2.河南省駐馬店市人民醫(yī)院藥劑科，河南駐馬店 463000；3.廣州市佛山南海中醫(yī)院西藥房，廣東廣州 528200)

板藍(lán)根及所含靛藍(lán)和靛玉紅強(qiáng)烈抑制小鼠腎主要有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體Oat1，Oat2和Oat3

奇錦峰1，孫 晨1，王永輝2，余文浩1，韓 堅(jiān)1，林 梅3，張 娜1

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東廣州 510006；2.河南省駐馬店市人民醫(yī)院藥劑科，河南駐馬店 463000；3.廣州市佛山南海中醫(yī)院西藥房，廣東廣州 528200)

目的 探討板藍(lán)根顆粒劑(GRI)和飲片水煎劑(DRI)及其所含主要成分靛藍(lán)和靛玉紅對(duì)小鼠腎有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(OAT)中3個(gè)主要亞型Oat1,Oat2和Oat3的影響。方法 NIH小鼠分別ig給予GRI 0.615和2.460 g·kg－1,DRI 1.6和6.4 g·kg－1(生藥量),靛藍(lán)0.008和0.640 mg·kg－1,靛玉紅0.0192和1.5360 mg·kg－1,每組60只(雌雄對(duì)半),每天2次,連續(xù)5 d。同時(shí)設(shè)丙磺舒(0.05 g·kg－1)陽(yáng)性對(duì)照組和兩種溶媒〔純水和0.5%羧甲纖維素鈉(CMC-Na)水溶液〕對(duì)照組及糊精加蔗糖(各1.5 g·kg－1)添加劑組。最后1次給予供試物后實(shí)施對(duì)-氨基馬尿酸(PAH,iv,0.03 g·kg－1)清除實(shí)驗(yàn),即在iv PAH后1.0,2.5,5.0, 7.5,10.0和20.0 min時(shí)每組分別各取10只小鼠(雌雄對(duì)半),安樂(lè)處死收集全血制備血清,并迅速摘取雙腎,右腎進(jìn)行組織勻漿后測(cè)定PAH蓄積量,左腎組織用于提取總mRNA。每組另取10只小鼠(雌雄各半),同樣給藥處理,按Nakakariya法做腎切片進(jìn)行攝取PAH實(shí)驗(yàn)。用Kiguchi法測(cè)定血清和腎組織勻漿液中PAH濃度。以藥動(dòng)學(xué)軟件(DAS 2.0)計(jì)算血清及腎組織中PAH的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。以實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定小鼠腎組織Oat1,Oat2及Oat3 mRNA表達(dá)。結(jié)果 與純水對(duì)照組比較,0.5%CMC-Na對(duì)照組各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均無(wú)顯著差異。與兩種溶媒對(duì)照組相比,GRI 2.460 g·kg－1,靛藍(lán) 0.640 mg·kg－1和靛玉紅1.5360 mg·kg－1組消除半衰期(t1/2β)顯著延長(zhǎng)(P＜0.05)；各供試物組分布容積(Vd)和清除率(Cl)均顯著減少(P＜0.01),曲線下面積(AUC0→20min)均顯著增加(P＜0.01)；由采血時(shí)間段內(nèi)各組腎組織中的PAH蓄積量所求得的AUC0→20min顯著大于同期對(duì)照組(P＜0.05,P＜0.01),且腎AUC0→20min與血液AUC0→20min的比值在各組間無(wú)顯著差異。各劑量供試物均可使腎切片攝取PAH的量顯著少于對(duì)照組(P＜0.05,P＜0.01)。與純水/CMC對(duì)照組相比,GRI 2.460 g·kg－1,DRI 6.4 g·kg－1,靛藍(lán)0.640 mg·kg－1,靛玉紅1.5360 mg·kg－1組小鼠腎組織Oat1,Oat2及Oat3 mRNA表達(dá)除靛玉紅組Oat2 mRNA(P＜0.05)、GRI組Oat3 mRNA(P＜0.01)表達(dá)水平被顯著上調(diào)外,其余均被顯著下調(diào)(P＜0.05,P＜0.01)。結(jié)論 GRI、DRI、靛藍(lán)、靛玉紅在所用劑量下對(duì)小鼠腎組織Oat1,Oat2及Oat3均有明顯抑制作用,GRI和DRI的這種抑制作用可能主要來(lái)自其所含的靛藍(lán)和靛玉紅成分。

板藍(lán)根；靛藍(lán)；靛玉紅；對(duì)-氨基馬尿酸；有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體

板藍(lán)根(Radix Isatidis)別名靛青根、藍(lán)靛根或靛根，分為北板藍(lán)根和南板藍(lán)根，是中醫(yī)清熱解毒的常用中藥[1]。北板藍(lán)根來(lái)源于十字花科植物菘藍(lán)(Isatis tinctoria L.)和草大青(I.indigotica Fort.)的根；南板藍(lán)根為爵床科植物馬藍(lán)〔Baphicacanthus cusia(Nees)Brem.〕的根莖和根[1]。板藍(lán)根主要活性成分被認(rèn)為是靛藍(lán)(indigo)和靛玉紅(indirubin)，分別含0.0001～0.0957%和0.0012～0.1118%[2－4]，此外，還含有其他幾十種成分[5－6]。近年來(lái)有不少大眾媒體報(bào)道，板藍(lán)根曾引發(fā)腎毒性等諸多不良反應(yīng)[6－9]，然而至今未見(jiàn)有正規(guī)的實(shí)驗(yàn)研究或臨床調(diào)查報(bào)告證明板藍(lán)根本身或其所含主要化學(xué)成分如靛藍(lán)和靛玉紅確實(shí)能引發(fā)腎毒性。

有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(organic anion transporters，OAT)是溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體(solute carrier，SLC)超家族中 SLC22A基因家族的成員[10]，其主要成員OAT1，OAT2和OAT3多在腎近曲小管上皮細(xì)胞基底膜側(cè)表達(dá)，介導(dǎo)眾多內(nèi)、外源性有機(jī)陰離子型化合物(包括環(huán)境毒素、藥物及其代謝產(chǎn)物)從細(xì)胞外液或血液進(jìn)入腎小管腔上皮細(xì)胞[10－11]，再由其他外排性轉(zhuǎn)運(yùn)體將它們分泌送入腎小管腔[11]，以便經(jīng)尿液排出體外，即OAT在哺乳動(dòng)物排泄體內(nèi)廢棄物及毒物方面具有不可替代的作用[12－13]。

研究發(fā)現(xiàn)，OAT一旦被進(jìn)入體內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)(包括藥物、毒物及飲食當(dāng)中的某些成分)所抑制，將擾亂機(jī)體的正常生理活動(dòng)乃至出現(xiàn)傷害作用[11]，如β-內(nèi)酰胺類中的頭孢曲松、抗病毒藥中的阿昔洛韋、抗腫瘤藥中的甲氨蝶呤和鉑類等的腎毒性均與OAT1和OAT3介導(dǎo)的有機(jī)陰離子的攝取功能受阻有關(guān)[14－16]，而馬兜鈴酸所導(dǎo)致的腎毒性機(jī)制也約在4年前被證實(shí)是抑制OAT1和OAT3的結(jié)果[14－15]。

鑒于眾多研究表明，化學(xué)物質(zhì)所引發(fā)的人類腎損害多與OAT被抑制有關(guān)[14－16]，與人類 OAT1，OAT2和 OAT3相對(duì)應(yīng)的同源小鼠Oat分別是Oat1，Oat2和Oat3[17]，故本研究檢測(cè)了市售板藍(lán)根顆粒(granules of Radix Isatidis，GRI)和自制板藍(lán)根飲片水煎劑(decoction of Radix Isatidis，DRI)以及板藍(lán)根中含量較多的成分靛藍(lán)和靛玉紅對(duì)小鼠腎組織3個(gè)主要Oat亞型Oat1，Oat2和Oat3的轉(zhuǎn)運(yùn)功能及其基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

GRI，廣州市香雪制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z44020344，批號(hào)201301203；DRI，廣州市采芝林藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院黃海波教授鑒定為北板藍(lán)根；靛藍(lán)(純度98%)、靛玉紅(純度＞95%)和對(duì)-氨基馬尿酸(para-aminohippuric acid，PAH)(純度98%)，均為阿拉丁公司；丙磺舒(probenecid)(純度 98%)，美國(guó) Sigma公司；Tusda試劑(純度＞98%)，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；靛藍(lán)、靛玉紅和丙磺舒等均用0.5%羧甲纖維素鈉(CMC-Na)溶液充分研磨成細(xì)膩的混懸液。蛋白質(zhì)定量試劑盒，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司；總RNA提取試劑、PrimeScriptTMRT 試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，日本TaKaRa公司；特異性引物序列[18](表1)由上海生工生物工程有限公司合成；其他常用試劑均為市售分析純級(jí)。Himac CR22G高速冷凍離心機(jī)，日本日立制作所；AsOne數(shù)控組織勻漿機(jī)，日本 As One公司；WFG7200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯上海儀器有限責(zé)任公司；SmartSpec plus核酸蛋白檢測(cè)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 板藍(lán)根水提物的制備及板藍(lán)根類供試物所含靛藍(lán)和靛玉紅的定量

參照《中國(guó)藥典》2010版中“板藍(lán)根顆?！钡闹品╗1]，取96 g板藍(lán)根飲片煎煮2次(每次加純水1 L)，第1次2 h，第2次1 h，濾液合并后濃縮至0.3 L(其生藥含量為320 g·L－1)，－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。DRI和GRI中靛藍(lán)和靛玉紅的定量參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行。

1.3 動(dòng)物、動(dòng)物分組和給藥

12組SPF級(jí)NIH小鼠(雌雄對(duì)半)，體質(zhì)量22～30 g(廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(粵)2013-0020。飼養(yǎng)條件為室溫20～26℃，濕度50%～70%，明暗交替12 h/12 h，隨意攝食飲水。動(dòng)物福利和實(shí)驗(yàn)均符合相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。將受試小鼠隨機(jī)分為12個(gè)組，每組60只，純水對(duì)照組，0.5%CMC-Na對(duì)照組，糊精加蔗糖添加劑對(duì)照組(各1.5 g·kg－1)，丙磺舒陽(yáng)性對(duì)照組(0.05 g·kg－1)，GRI 0.615和2.460 g·kg－1，DRI 1.6和6.4 g·kg－1(生藥量)，靛藍(lán) 0.008和0.640 mg·kg－1，靛玉紅 0.0192和1.5360 mg·kg－1。各 劑 量 供 試 物 ig 給 予(20 mL·kg－1)，每天2次，連續(xù)5 d。

1.4 PAH清除實(shí)驗(yàn)[20]

最后1次給予供試物60 min后，所有受試小鼠均尾靜脈注射PAH 0.03 g·kg－1，然后在1.0，2.5，5.0，7.5，10.0及20.0 min時(shí)從各組分別取10只小鼠(雌雄各半)，安樂(lè)處死取全血，室溫放置60 min后3000×g離心5 min，取血清－20℃保存；迅速摘取雙腎并即刻置－80℃保存待用。取出在－80℃冰箱中的小鼠右腎，剪成2 mm小塊放入電動(dòng)勻漿器中，加入5倍量的磷酸緩沖液(pH 7.4)進(jìn)行勻漿[21](20 s×5次，每杵間隔10 s)，20 000×g離心30 min后棄沉淀，取上清液用Folin酚法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。血清中及腎勻漿上清液中的PAH含量參考文獻(xiàn)[22]測(cè)定。

Tab.1 Primer sequences of mouse organic anion transporters(mOat)for reaI-time RT-PCR

1.5 腎切片攝取PAH實(shí)驗(yàn)[21，23]

另取 SPF級(jí) NIH小鼠(雌雄對(duì)半)，每組10只，除未設(shè)糊精加蔗糖對(duì)照組外，分組和給藥同1.3。最后1次給藥后60 min處死小鼠，迅速摘取左腎，將其置于消過(guò)毒的瓷板上。用無(wú)菌手術(shù)刀片從腎門(mén)沿長(zhǎng)軸將腎平均切成2份。每份沿長(zhǎng)軸均等切成3條(約2 mm厚)，再將其均等切成3塊。冰冷PBS涮洗后用濾紙吸干，放入12孔培養(yǎng)板(內(nèi)有充足了氧氣的PBS 1 mL，含PAH 2 mmol·L－1，每孔放1個(gè)腎的切塊)，置CO2培養(yǎng)箱，37℃，5% CO2中溫育20 min，每隔5 min震搖5 s。取出培養(yǎng)板后迅速加入250 μL 10%三氯醋酸溶液并震搖混勻以終止反應(yīng)。上述孵育的腎組織塊的勻漿操作及其所含PAH濃度的測(cè)定同1.4。PAH的攝取量以g·L－1·g－1蛋白表示(即每升勻漿液中單位蛋白質(zhì)所對(duì)應(yīng)的PAH)，并求出各組實(shí)際攝取量所占對(duì)照組的百分率。

1.6 用實(shí)時(shí)熒光PCR測(cè)定腎組織Oat mRNA水平

－80℃冰箱中取左腎提取總RNA，步驟嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用紫外分光光度法測(cè)定A260nm和A280nm，A260nm/A280nm比值在1.8～2.2之間的樣本用于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用PrimeScriptTMRT試劑盒進(jìn)行。用ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為37℃15 min，85℃31 s，1個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，體系為20 μL，其中含10 μL SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，上、下游引物各0.8 μL，0.4 μL ROX Reference DyeⅡ，2 μL前述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用DEPC處理水補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)待檢基因重復(fù)做3個(gè)反應(yīng)孔。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)入循環(huán)階段，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸31 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照，用2－△△Ct方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

血清中PAH的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(t1/2β，Vd，Cl和AUC0－20min)及腎組織中PAH蓄積量的藥-時(shí)曲線下面積(AUC0－20min)由藥動(dòng)學(xué)軟件(DAS2.0)算出[24]并由Bailer法[25－26]計(jì)算AUC及腎與血清AUC比值。所有定量數(shù)據(jù)均用表示。以SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所求得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析及最小顯著性檢驗(yàn)(LSD)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GRI和DRI中靛藍(lán)和靛玉紅的含量

靛藍(lán)和靛玉紅含量測(cè)定結(jié)果表明，本研究所用GRI中，每克藥材含靛藍(lán)3.03 μg，靛玉紅3.92 μg；DRI中每克藥材含靛藍(lán)29.45 μg，靛玉紅3.12 μg。

2.2 PAH清除實(shí)驗(yàn)中藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的改變

由PAH標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度范圍0.0586～30.0000 mg·L－1，10個(gè)梯度)得標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y＝0.3937X－0.0025，R＝0.9986)，以此標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出血清和2種腎組織勻漿液中PAH濃度(此法日內(nèi)變動(dòng)0.41%～9.52%，日間變動(dòng) 4.65%～10.85%，重現(xiàn)性 90.81%～109.14%)。

小鼠體內(nèi)PAH的藥-時(shí)曲線符合二室模型，可用等式Cs＝Ae－at＋Be－βt來(lái)描述雙指數(shù)濃度-時(shí)間曲線，其中Cs是在給PAH后時(shí)間t(min)時(shí)的血清PAH濃度(mg·L－1)。用藥動(dòng)學(xué)軟件(DAS2.0)計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)消除半衰期(tβ1/2)、分布容積(Vd)、清除率(Cl)和AUC0→20min(表2)。純水組、CMC-Na組與糊精加蔗糖組3個(gè)對(duì)照組之間所測(cè)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均無(wú)差異；與純水對(duì)照組(或CMC-Na組)相比，GRI 2.460 g·kg－1、靛藍(lán)0.640 mg·kg－1和靛玉紅 1.5360 mg·kg－1組 t1/2β顯著延長(zhǎng)(P＜0.05)，4種供試物各劑量組Vd和Cl均顯著減少 (P＜0.01)而 AUC0→20min則 均 顯 著 增 加(P＜0.01)。

2.3 小鼠腎組織中PAH蓄積量的改變

靜注PAH后由各采血點(diǎn)對(duì)應(yīng)的腎組織內(nèi)的PAH蓄積量所得AUC0－20min如表3所示。在純水、CMC-Na與糊精加蔗糖3個(gè)對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異；與對(duì)照組相比，各劑量的板藍(lán)根及其關(guān)聯(lián)供試物組的AUC0－20min(即PAH蓄積量)如同丙磺舒組(標(biāo)準(zhǔn)抑制劑)一樣均顯著地升高(P＜0.05)。腎AUC與血清 AUC比值[25－26]各組均在 0.325～0.431之間，說(shuō)明血中PAH濃度升高后腎組織中的蓄積量也同比例增加，即各組內(nèi)的增加量雖不同，但各自在血液和腎組織中增加的比例是相近的，提示該過(guò)程無(wú)代謝酶及其他轉(zhuǎn)運(yùn)體參與。

Tab.2 Effect of granuIes of Radix Isatidis(GRI)，decoction of Radix Isatidis(DRI)，indigo and indirubin on pharmacokinetic(PK)parameters of p-aminohippuric acid(PAH)

Tab.3 AUC0－20minof PAH in bIood and kidney and kidney-to-bIood AUC ratios of mice after treatment with GRI，DRI，indigo and indirubin

2.4 腎切片攝取PAH量的改變

各組受試小鼠左全腎切片孵育20 min后所攝取的PAH的定量結(jié)果如表4所示。所有供試物各劑量組的PAH攝取量均顯著低于純水和CMC-Na對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)。GRI 2.460 g·kg－1和靛玉紅1.5360 mg·kg－1組所攝取的PAH與丙磺舒組類似，僅為對(duì)照組的50.8%和55.6%，說(shuō)明腎近曲小管上皮細(xì)胞基底膜側(cè)的Oat被強(qiáng)烈抑制。

2.5 小鼠腎組織Oat1，Oat2及Oat3 mRNA表達(dá)水平的改變

各供試物組小鼠腎組織Oat1，Oat2及Oat3 mRNA表達(dá)水平如表5所示。與相應(yīng)對(duì)照組比較，4種供試物分別在 2.460 g·kg－1，6.4 g·kg－1，0.640 mg·kg－1和1.5360 mg·kg－1時(shí) Oat1，Oat2及Oat3 mRNA表達(dá)水平均顯著改變，除靛玉紅組Oat2 mRNA(P＜0.05)和GRI組Oat3 mRNA(P＜0.01)表達(dá)水平被顯著上調(diào)外，其他Oat mRNA表達(dá)均被顯著下調(diào)(P＜0.05，P＜0.01)。

3 討論

PAH是 OAT1，OAT2和 OAT3的共同底物[17]，丙磺舒為OAT1，OAT2和OAT3的共同抑制劑[27]。本研究以PAH為探針?biāo)?、丙磺舒為?yáng)性對(duì)照，分析對(duì)比了溶媒對(duì)照組和GRI、DRI、靛藍(lán)和靛玉紅組小鼠在PAH清除實(shí)驗(yàn)中的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(t1/2β，Vd，Cl和AUC等)和腎組織內(nèi)的PAH蓄積量以及體外腎切片孵育后的PAH攝取量的差異，并以定量實(shí)時(shí)-PCR最終驗(yàn)證了所測(cè)供試物對(duì)受試小鼠腎組織Oat基因的調(diào)控，以此推測(cè)板藍(lán)根及其所含靛藍(lán)和靛玉紅對(duì)人類腎主要OAT的可能影響。

有研究報(bào)道，小鼠Oat1，Oat2和Oat3與人類OAT1，OAT2和OAT3具有高度同源性[17，28－29]，并且同樣分布于腎近曲小管基底膜上[13－18，30]。OAT在不同種屬動(dòng)物的分布有些差異，在人類腎組織主要為OAT1和OAT3，而OAT2雖在腎組織有表達(dá)，但主要分布在肝，但在小鼠腎組織不僅有Oat1和Oat3，而且還有專屬性的Oat2[17]。因此，本研究一并檢測(cè)了Oat2及其對(duì)應(yīng)mRNA。

Tab.4 Effect of GRI，DRI，indigo and indirubin on PAH uptake by kidney sIices of mice

Tab.5 Expression of Oat1，Oat2 and Oat3 mRNA in kidney tissue of mice after treatment with GRI，DRI，indigo and indirubin

GRI臨床用量為5～10 g一次，一日3～4次(本研究取每人5 g)，而板藍(lán)根飲片臨床用量為10～15 g[1](本研究取每人13 g)。本研究依據(jù)黃繼漢等[31]的建議將小鼠等效于臨床劑量，設(shè)為臨床用量的8倍，而將高劑量設(shè)為臨床用量的32倍，為此本研究劑量分別為GRI 0.615及2.460 g·kg－1(生藥量)和DRI 1.6及6.4 g·kg－1(生藥量)。

據(jù)報(bào)道，靛藍(lán)和靛玉紅具有抗菌作用[1－2]，故長(zhǎng)期以來(lái)靛藍(lán)和靛玉紅一直被作為GRI、板藍(lán)根及大青葉等藥材的活性成分及質(zhì)控和工藝考察的指標(biāo)[3－4]。然而板藍(lán)根藥材中，靛藍(lán)和靛玉紅的含量跨度范圍 很 大[2－9，19]，分 別 為 0.000005% ～0.09574%(相差19 148倍)和0.0%～0.08639% (相差 8639倍)。因本研究假設(shè)靛藍(lán)的含量為0.0005%，靛玉紅的含量為0.0012%，故在所設(shè)DRI劑量 1.6和 6.4 g·kg－1中，靛藍(lán)含 0.008和0.032 mg·kg－1，靛玉紅含0.0192和0.0768 mg·kg－1。據(jù)報(bào)道，GRI中靛藍(lán)和靛玉紅的含量＜0.001% (10 μg·g－1藥材)[2－9，19]，由此推算，本研究所用GRI 0.615和2.460 g·kg－1中二者分別含 0.0062和0.0246 mg·kg－1(比本次所用劑量小1.3～62.4倍)。本研究測(cè)得本次所用DRI中靛藍(lán)含29.45 μg·g－1(0.002945%，比本次假設(shè)含量高5.9倍)，靛玉紅含3.12 μg·g－1(0.000312%，是本次假設(shè)含量的0.3倍)。GRI中靛藍(lán)含3.03 μg·g－1(0.000303%，是本次假設(shè)含的0.6倍)，靛玉紅含3.92 μg·g－1(0.000392%，是本次假設(shè)含量的0.3倍)。

雖然靛藍(lán)和靛玉紅的毒性很低(小鼠經(jīng)口給藥，靛藍(lán)LD50＞32 g·kg－1，而靛玉紅LD50為0.3 g·kg－1)[32]，在一定劑量范圍內(nèi)比較安全(靛玉紅在國(guó)內(nèi)外已有多年被用于抗腫瘤藥物[33])。然而，本研究的多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中二者所用劑量非常小，遠(yuǎn)低于藥材及制劑中的實(shí)際含量，但其對(duì)Oat的抑制作用卻依然非常明顯，這不得不引起我們的注意。板藍(lán)根中另含有幾十種其他成分，因其大多含量很少，來(lái)源困難，故本研究未觀察它們對(duì)Oat的抑制作用。雖不能排除這些成分也可能參與抑制Oat，但從靛藍(lán)和靛玉紅在本研究中所用劑量的效應(yīng)來(lái)看，板藍(lán)根抑制Oat的作用可能主要來(lái)自靛藍(lán)和靛玉紅。因此推測(cè)，凡含有靛藍(lán)和靛玉紅的草藥中可能均會(huì)影響腎Oat的功能。

GRI中除其水提物外作為添加劑還有糊精和蔗糖[1]，文獻(xiàn)檢索中未發(fā)現(xiàn)此兩種物質(zhì)對(duì)藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體有影響，但因一些藥代酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)許多化合物非常敏感，本研究在PAH清除實(shí)驗(yàn)中仍然增設(shè)了糊精加蔗糖對(duì)照組(二者1∶1混合物，各1.5 g·kg－1)，以驗(yàn)證它們是否參與GRI抑制Oat的作用。本研究結(jié)果表明，糊精加蔗糖組小鼠的各項(xiàng)PK參數(shù)與純水對(duì)照組或CMC-Na對(duì)照組比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因而在腎切片攝取PAH實(shí)驗(yàn)和PCR實(shí)驗(yàn)中均省略了該對(duì)照組。

為了選擇合適的采血時(shí)間范圍，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中分別給受試小鼠口服純水和丙磺舒1次，90 min后尾靜脈注入PAH 30 mg·kg－1，在注射PAH后1.0，2.5，5.0，7.5，10，12.5，15，20，25，30，40，50，60 min時(shí)分別采血并定量血中PAH含量，作出完整的PAH藥-時(shí)曲線圖。結(jié)果顯示，其AUC在丙磺舒組明顯大于純水組，說(shuō)明丙磺舒抑制了腎Oat對(duì)PAH的攝取和排泄，使血中的PAH殘留量增加。另外，血中PAH濃度在30 min前各采血點(diǎn)兩組間均有明顯差異，因此，在正式實(shí)驗(yàn)中本研究在0～20 min區(qū)間設(shè)計(jì)了6個(gè)采血點(diǎn)。

通常認(rèn)為AUC是最重要的PK參數(shù)，因此本研究也參照文獻(xiàn)[34－35]對(duì)不同劑量各供試物組的血清AUC及腎組織AUC予以了關(guān)注。與對(duì)照組相比，各劑量供試物組血清 AUC全部增加(增加39%～59%)，然而各組間腎組織AUC對(duì)血清AUC比值均無(wú)顯著差異。這說(shuō)明PAH幾乎不受除OAT以外的其他轉(zhuǎn)運(yùn)體或代謝酶的影響。當(dāng)血中濃度升高時(shí)，腎組織中濃度也以相似的比例升高，而AUC比值(腎組織/血清)在各組間幾乎相同，均在0.31～0.43范圍變化。

本研究在正式腎切片攝取PAH實(shí)驗(yàn)前，對(duì)孵育液中最佳PAH濃度和最佳孵育時(shí)間等進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，PAH濃度在1.0～2.0 mmol·L－1范圍時(shí)較合適，而孵育時(shí)間則以20 min為宜，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而呈下降趨勢(shì)(數(shù)據(jù)略)。當(dāng)腎小管表皮細(xì)胞的基底膜上的OAT被抑制時(shí)探針?biāo)嶱AH被攝入腎小管的量就減少[13]。因此，PAH清除實(shí)驗(yàn)是通過(guò)體內(nèi)方法測(cè)定血中PAH藥動(dòng)參數(shù)及腎組織(勻漿)中PAH蓄積量來(lái)反映腎小管上OAT的功能，而腎切片攝取PAH實(shí)驗(yàn)則是用體外方法驗(yàn)證OAT的功能是否受阻。

實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與相應(yīng)對(duì)照組比較，GRI、DRI、靛藍(lán)和靛玉紅4種供試物均顯著改變了腎組織Oat1，Oat2及Oat3 mRNA表達(dá)水平，除靛玉紅組Oat2 mRNA和GRI組Oat3 mRNA表達(dá)水平被顯著上調(diào)外，其他Oat mRNA表達(dá)均被顯著下調(diào)。由此進(jìn)一步表明，GRI、DRI、靛藍(lán)和靛玉紅可明顯抑制小鼠Oat的功能。至于靛玉紅上調(diào)Oat2 mRNA表達(dá)、GRI上調(diào)Oat3 mRNA表達(dá)，可能是Oat2和Oat3 mRNA表達(dá)與對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)水平不一致所致[36－39]。

本研究結(jié)果表明，小鼠給予GRI、DRI、靛藍(lán)和靛玉紅4種供試物后，在PAH清除實(shí)驗(yàn)中，t1/2β延長(zhǎng)25%～89%，Vd減少34%～54%，Cl下降25%～42%，AUC0→20min增加39%～59%，腎組織中 PAH蓄積量大幅增加；體外孵育的腎切片對(duì)PAH的攝取量明顯減少，Oat1，Oat2及Oat3 mRNA表達(dá)明顯改變，即上述作用與丙磺舒相似。由此提示，板藍(lán)根及其所含靛藍(lán)、靛玉紅可強(qiáng)烈抑制Oat1，Oat2和Oat3的功能。

對(duì)于板藍(lán)根及其主要成分抑制OAT1，OAT2和OAT3各亞型的程度，它們?cè)诨蛩缴蠈?duì)小鼠腎Oat所產(chǎn)生的抑制作用是否與某些核受體如組成型雄烷受體和孕烷X受體等或微小RNA等有關(guān)，以及對(duì)有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響及其動(dòng)力學(xué)參數(shù)尚待研究。

致謝:本校2009級(jí)畢業(yè)實(shí)習(xí)生陳怡蘭、曹小會(huì)、趙亞雷、王雪榮、張敏、王藝璇、曾思娜、李永斌、李麗君等參加了部分實(shí)驗(yàn)工作,在此表示謝意。

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Inhibition of Radix Isatidis and its constituents indigo and indirubin on major organic anion transporters Oat1，Oat2 and Oat3 in mouse kidneys

QI Jin-feng1，SUN Chen1，WANG Yong-hui2，YU Wen-hao1，HAN Jian1，LIN Mei3，ZHANG Na1
(1.Department of Pharmacology，College of Traditional Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2.Pharmacy Department，Zhumadian First People′s Hospital，Zhumadian 463000，China；3.Pharmacy Department，Nanhai Hospital of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)oushan 528200，China)

OBJECTIVE To investigate the inhibition of Radix Isatidis and its major constituents indigo and indirubin on three principal subtypes of organic anion transporters(OATs)，Oat1，Oat2 and Oat3 in vivo in mice.METHODS Granules of Radix Isatidis(GRI)0.615 and 2.46 g·kg－1，decoction of Radix Isatidis(DRI)1.6 and 6.4 g·kg－1，indigo 0.008 and 0.64 mg·kg－1and indirubin 0.0192 and 1.536 mg·kg－1were ig given to the NIH mice(60 mice per group)，twice a day，for 5 d while four control groups were set up，including vehicle of water，0.5%sodium carboxymethyl cellulose(CMC)，positive control probenecid(0.05 g·kg－1)and additives of sucrose plus dextrin(1.5 g·kg－1each)groups.After the last dosing of the test samples，para-aminohippuric acid(PAH)clearance test was conducted.All the mice were iv given PAH 0.03 g·kg－1and 1，2.5，5，7.5，10 and 20 min later before 10 mice per group were euthanized to collect whole blood and the kidneys were quickly removed.Each right kidney was homogenized to analyze the PAH accumulations and each left kidney to extract total mRNA for analysis of Oat1，Oat2 and Oat3 gene expressions using quantitative real-time PCR.The concentrations of PAH in sera and in kidney homogenates were determined by the method of Kiguchi.Major pharmacokinetic parameters of PAH in sera were calculated by pharmacokinetic software(DAS2.0).PAH uptake test for kidney slices was performed on another group of NIH mice according to the method of Nakakariya.RESULTS There was no significant difference between water control group and 0.5%CMC group in all the examined items.Compared with the vehicle control groups(water and 0.5%CMC group)，elimination half time (t1/2β)of PAH in GRI 2.46 g·kg－1，indigo 0.64 mg·kg－1and indirubin 1.536 mg·kg－1groups was significantly prolonged(P＜0.05)，the total clearance(Cl)and volume of distribution(Vd)were obviously reduced(P＜0.01)and the area under the curve(AUC0－20min)of PAH in all the tested groups was significantly increased(P＜0.01).AUC0－20minobtained from renal PAH accumulations within the checked time was significantly higher(P＜0.05，P＜0.01)than in the vehicle control group.But there was in no significant difference between all the study groups in kidney-to-plasma AUC ratios.PAH uptake results by kidney slices were significantly lower(P＜0.05，P＜0.01)than in vehicle control group in every two dosages of all the four samples tested.Compared with vehicle control group，the mRNA expressions of Oat1，Oat2 and Oat3 were obviously(P＜0.05，P＜0.01)and abnormally regulated in the groups of GRI 2.46 g·kg－1，DRI 6.4 g·kg－1，indigo 0.64 mg·kg－1and indirubin 1.536 mg·kg－1.CONCLUSION The renal Oat1，Oat2 and Oat3 of mice are significantly inhibited by GRI，DRI，indigo and indirubin.The inhibitory function of Radix Isatidis probably stems from indigo and indirubin contained in it.

Radix Isatidis；indigo；indirubin；para-aminohippuric acid；organic anion transporters

QI Jin-feng，E-mail:qijinfeng2005＠aliyun.com，Tel:13711301907

R285.1

:A

:1000-3002(2014)06-0878-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.010

2014-04-21 接受日期:2014-10-26)

(本文編輯:齊春會(huì))

奇錦峰(1956－)，男，醫(yī)學(xué)博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥代動(dòng)力學(xué)(藥物相互作用)研究。

奇錦峰，E-mail:qijinfeng2005＠aliyun.com，Tel:13711301907