綠頭鴨IFN-α的可溶性表達(dá)及其活性分析

劉瀾瀾莊艷娜于曉紅曾祥偉

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱 150040）

綠頭鴨IFN-α的可溶性表達(dá)及其活性分析

劉瀾瀾1莊艷娜2于曉紅1曾祥偉2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱 150040）

為了利用原核表達(dá)系統(tǒng)研制有生物活性的鴨IFN-α。以pMD18T-MaIFN-α為模板擴增綠頭鴨IFN-α成熟肽基因，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-32a中，在大腸桿菌BL21中進(jìn)行變溫誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析表達(dá)結(jié)果，并用Western blotting進(jìn)行驗證。Ni2+樹脂柱純化目的蛋白后，測定其生物活性。結(jié)果表明，重組pET-32a（+）-MaIFN-α在大腸桿菌BL21成功表達(dá)，主要以可溶性形式存在，Western blotting分析顯示目的蛋白具有良好的抗原性。細(xì)胞病變抑制法測定重組鴨IFN-α的抗病毒活性約為8×104U/mL；熒光定量PCR方法檢測顯示表達(dá)的重組鴨IFN-α使NDV在DEF上的復(fù)制受到了明顯的抑制，48 h時間點相對抑制率高達(dá)91%。這些都表明表達(dá)的重組鴨IFN-α具有良好抗病毒活性。

綠頭鴨 IFN-α 可溶性表達(dá) 活性分析

干擾素（Interferon，IFN）是具有良好的抗病毒、抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子［1-3］。目前IFN可分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型IFN 主要包括IFN-α、β、ω、δ、κ、ε、ξ 和τ 等，Ⅱ型IFN 只有IFN-r一種［4］。其中α-干擾素以其突出的抗病毒效應(yīng)而備受重視，其抗病毒、抗腫瘤活性作用要明顯強于Ⅱ型IFN；同時也具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，但要弱于Ⅱ型IFN。

鴨IFN-α的開放閱讀框架由576個核苷酸組成，編碼191個氨基酸，前30個氨基酸為信號肽，后161個氨基酸為成熟活性蛋白。1995年Schultz等［5］首次成功克隆了鴨I型干擾素基因。國內(nèi)從2000年開始陸續(xù)有關(guān)于鴨干擾素的報道，目前北京鴨、番鴨、紹興鴨和四川麻鴨等的序列先后被克隆和測定［6-9］。國內(nèi)學(xué)者也先后利用不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了鴨IFN-α，原核表達(dá)重組鴨IFN-α蛋白表達(dá)量較高，

但多以包涵體形式存在，需要經(jīng)過復(fù)性才能獲得其生物活性［8］；真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組鴨IFN-α蛋白具有較好的生物活性，但表達(dá)量很低。這些都限制了鴨IFN-α在臨床實踐中的大量應(yīng)用。獲得高表達(dá)量并具有活性的鴨IFN-α是目前亟待解決的問題。

本研究嘗試對綠頭鴨的IFN-α成熟肽基因進(jìn)行表達(dá)，仍然應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)，但是通過變溫誘導(dǎo)來優(yōu)化表達(dá)條件，力求減少包涵體的形成，增加融合蛋白的可溶性，旨在獲得具有較高生物活性的鴨IFN-α重組蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體菌株、毒株和試驗動物 含有綠頭鴨IFN-α基因的重組質(zhì)粒pMD18T-MaIFN-α、pMD18TDNV-F由本實驗室構(gòu)建并保存，原核表達(dá)載體pET 32a（+）、感受態(tài)E.coli BL21受體菌購于美國Invitrogen 公司。新城疫病毒（NDV）F48E9株、水泡口炎病毒（vsv）、鴨胚由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.1.2 試劑 DNA凝膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III、Ex Taq酶、T4 DNA連接酶、 One Step SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit II、蛋白Marker等購自大連寶生物公司?？笻is標(biāo)簽單抗、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購自Sigma公司。

1.1.3 引物 參考GenBank上發(fā)表的鴨IFN-α基因（登錄號：X84764）和NDV的F基因（登錄號：AY508514）相關(guān)基因序列，設(shè)計了2對引物。其中IFNA-F、IFNA-R用于擴增鴨IFN-α成熟肽基因上游引物分別加入了EcoRⅠ、Hind III酶切位點（酶切位點用下劃線標(biāo)注）；Ffp、Frp用于擴增新城疫病毒（NDV）的F基因。引物由上海英駿公司合成，具體見表1。

表1 本研究中所使用的引物

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及目的基因的表達(dá) 以pMD18T-MaIFN-α為模板，以IFNA-F、IFNA-R為引物，使用Ex Taq酶對鴨IFN-α成熟肽基因進(jìn)行常規(guī)擴增反應(yīng)，將擴增產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pET-32a（+）分別用EcoRⅠ和Hind III雙酶切，回收、連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）-Ma-IFN-α，并且測序鑒定重組質(zhì)粒的正確性。將鑒定后的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行變溫誘導(dǎo)表達(dá)，在新鮮的含有Amp+的LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600nm達(dá)到0.6時，加入IPTG，使其在菌液中的終濃度為0.5 mmol/L，25℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。然后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.2 表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting鑒定 將SDSPAGE凝膠電泳的蛋白帶通過半干法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉配制的封閉液中，4℃封閉過夜，以封閉無關(guān)蛋白結(jié)合位點。一抗使用抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體、二抗為HRP-羊抗鼠IgG，進(jìn)行Western blotting檢測，使用DAB顯色試劑盒顯色。

1.2.3 重組蛋白的可溶性分析與純化 收集10 mL誘導(dǎo)后的菌液沉淀，經(jīng)PBS洗滌后重懸于10 mL PBS（pH8.0）中，加入溶菌酶至終濃度為1 mg/mL，冰浴30 min。冰浴后進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎（350 W，工作2 s，間隙3 s，作用10 min），之后4℃10 000 r/min離心20 min，分別收集上清和沉淀，沉淀用等體積量的PBS溶解，SDS-PAGE電泳分析。按照His.Bind純化試劑盒說明書，利用Ni2+樹脂柱對原核表達(dá)的鴨IFN-α進(jìn)行純化。并利用紫外分光光度計對純化的蛋白進(jìn)行濃度的測定。

1.2.4 細(xì)胞病變抑制法測定IFN-α重組蛋白抗病毒活性 制備鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF），待長成單層后每孔加入5×102、1×103、2×103、4×103、8×103、

1.6×104、3.2×104和6.4×104倍稀釋的純化后的鴨IFN-α 0.1 mL，每個稀釋度設(shè)6孔平行樣，37℃作用過夜，每孔加入100TCID50的劑量的水泡口炎病毒（vsv）感染細(xì)胞。同時設(shè)立病毒組、干擾素+病毒組、空白對照組，24-48 h內(nèi)觀察結(jié)果，在陽性對照孔出現(xiàn)75%以上病變時，判斷結(jié)果。以能抑制50%細(xì)胞病變的樣品的干擾素稀釋度定義為一個單位干擾素。

1.2.5 熒光定量PCR方法檢測 IFN-α重組蛋白抗病毒活性 試驗分為3組：第1組正常生長細(xì)胞組；第2組NDV接種組（細(xì)胞接種NDV病毒）；第3組保護(hù)組（加重組蛋白后再接種病毒）。將單層DEF細(xì)胞中的培養(yǎng)液去掉，第1、2組接入等量維持液，第3組加入10倍稀釋的重組蛋白2 mL。過夜培養(yǎng)后，第2、3組接種100TCID50的NDV。在接毒的6 h、12 h、24 h和48 h，以Ffp、Frp檢測引物，應(yīng)用熒光定量RT-PCR方法檢測DEF中NDV的含量；同時按照Reed-Muench兩氏法測算病毒的滴度。反應(yīng)完成后根據(jù)其Ct值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線換算病毒核酸拷貝數(shù)來反映IFN-α重組蛋白抗NDV病毒的效果，用SPSS15軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并計算相對抑制率：

相對抑制率（%）=（接種組病毒含量-保護(hù)組病毒含量）/接種組病毒含量×100%。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET-32a-MaIFN-α的鑒定

重組質(zhì)粒pET-32a-MaIFN-α經(jīng)測序，結(jié)果顯示插入的MaIFN-α基因大小、序列和開放閱讀框架均正確無誤，表明成功構(gòu)建了pET 32a-MaIFN-α原核表達(dá)重組質(zhì)粒。

2.2 重組鴨IFN-α融合蛋白的表達(dá)

pET-32a-MaIFN-α重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE分析（圖1）顯示出現(xiàn)了一條特異的蛋白質(zhì)增強條帶，大小約為39 kD，與預(yù)期結(jié)果一致，而空載體對照中并無此條帶，由此說明重組鴨IFN-α融合蛋白成功表達(dá)。

圖1 表達(dá)重組蛋白的SDS-PAGE分析

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting鑒定

對pET-32a-MaIFN-α融合蛋白進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)在分子量約為39 kD處出現(xiàn)一條特異條帶，表明融合蛋白能與His標(biāo)簽鼠單克隆抗體發(fā)生特異免疫反應(yīng)，具有良好的抗原性。

圖2 表達(dá)重組蛋白的Western blotting分析

2.4 重組蛋白的可溶性分析和純化

SDS-PAGE電泳分析顯示破碎受體菌的上清和沉淀中均有目的蛋白表達(dá)，但沉淀中目的蛋白很少，而上清中的目的蛋白含量很多，經(jīng)蛋白掃描系統(tǒng)分析，目的蛋白越占總蛋白的70%，可見該重組蛋白以可溶性表達(dá)為主。

表達(dá)的重組蛋白純化后，經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果（圖3）顯示在大小約為39 kD處可見一條清晰的蛋白帶，經(jīng)測定蛋白濃度約為0.98 mg/mL。

2.5 細(xì)胞病變抑制法測定IFN-α重組蛋白抗病毒活性

在重組鴨IFN-α樣品進(jìn)行500-4 000倍稀釋的細(xì)胞孔中均未見細(xì)胞病變，而稀釋倍數(shù)為8 000的細(xì)胞孔中有一半細(xì)胞孔出現(xiàn)了細(xì)胞病變，因此其抗病毒活性（U/mL）=1 U×抑制50%細(xì)胞病變的樣品的干擾素稀釋倍數(shù)/加入干擾素的體積（mL）= 1 U×8 000/0.1 mL=8×104U/mL。這表明表達(dá)的重組鴨IFN-α具有較好的抗病毒活性。

圖3 表達(dá)重組蛋白的純化

2.6 熒光定量PCR方法檢測 IFN-α重組蛋白抗病毒活性

應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測了各組不同時間點NDV的含量。結(jié)果（圖4）顯示，在接種NDV的12 h內(nèi)，添加重組鴨IFN-α的保護(hù)組的病毒拷貝數(shù)和病毒接種組之間相比基本保持一致，兩組的差異并不顯著（P＞0.05）。在24 h出現(xiàn)變化，兩組的病毒拷貝數(shù)都有增加，但保護(hù)組的病毒拷貝數(shù)的增加數(shù)量明顯低于病毒接種組，兩組差異顯著（P＜0.05）；在48 h兩組的病毒拷貝數(shù)仍在增加，特別是病毒接種組的病毒拷貝數(shù)的數(shù)量級達(dá)107，相比而言保護(hù)組的病毒拷貝數(shù)增加不多，兩組數(shù)據(jù)差異顯著（P＜0.05），在該時間點相對抑制率為91.0%而正常細(xì)胞組在各個時間點取樣未檢測到病毒核酸。

圖4 NDV拷貝數(shù)動態(tài)變化的分析

病毒的滴度也呈現(xiàn)了相似的變化趨勢，12 h以內(nèi)兩組病毒的滴度差異不大（P＞0.05），24-48 h兩組病毒的滴度差異比較明顯（P＜0.05），具體見表2。在48 h，病毒接種組細(xì)胞出現(xiàn)部分圓縮、壞死和脫落等細(xì)胞病變，而保護(hù)組的細(xì)胞基本維持正常形態(tài)，未見明顯的細(xì)胞病變。這都表明表達(dá)的重組鴨IFN-α具有良好的抗病毒活性。

表2 NDV病毒滴度（TCID50）動態(tài)變化的分析

3 討論

原核系統(tǒng)表達(dá)的干擾素的表達(dá)量較高，但多以包涵體形式存在，需要經(jīng)過復(fù)性才能獲得其生物活性。包涵體的復(fù)性是個費時、費力的過程，而且復(fù)性后的蛋白其生物活性通常不高。因此，選擇合適的原核表達(dá)載體、優(yōu)化表達(dá)條件來提高IFN-α的可溶性表達(dá)尤為重要。本研究中選擇了pET-32a（+）這一高效表達(dá)載體，它能快速、高效和穩(wěn)定地表達(dá)基因產(chǎn)物，成本低廉，適合應(yīng)用于工業(yè)化批量生產(chǎn)。該載體表達(dá)的目的片段前融合有硫氧還蛋白，它有助于蛋白的折疊，提高可溶性蛋白的含量［10］。此外，研究中使用變溫誘導(dǎo)表達(dá)的方法，即在加入IPTG后使用相對較低的溫度（25℃）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，降低了表達(dá)產(chǎn)物形成包涵體的幾率，結(jié)果表明目前蛋白絕大部分在處理細(xì)胞的上清中以可溶形式表達(dá)。這些都為重組鴨IFN-α的發(fā)酵生產(chǎn)奠定了良好基礎(chǔ)。

在干擾素生物活性的檢測方法中最經(jīng)典的就是應(yīng)用vsv/wish細(xì)胞系統(tǒng)通過細(xì)胞病變抑制試驗方法來測定干擾素的抗病毒活性［11］。該方法需要滴定每個孔病毒的滴度，十分費時費力。此外，干擾素與其受體細(xì)胞間的結(jié)合具有種屬特異性［12］，因此評價不同的干擾素要選擇不同的指示細(xì)胞，這也影響了評價系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。為了更好地測定表達(dá)的重組鴨IFN-α的生物活性，本研究在初步應(yīng)用經(jīng)典試驗方法的基礎(chǔ)上，應(yīng)用熒光定量PCR的方法檢測了IFN-α重組蛋白體外抗病毒的效果，不僅直觀地反映干擾素對病毒復(fù)制的抑制效果，同時還能實時對病毒復(fù)制的抑制過程進(jìn)行觀察。

細(xì)胞病變抑制試驗方法來測定重組鴨IFN-α的抗病毒活性約為8×104U/mL，明顯高于一些研究中經(jīng)過包涵體復(fù)性的重組鴨IFN-α［8，13］。熒光定量PCR方法檢測重組鴨IFN-α的抗病毒活，從24-48 h

這段時間里，保護(hù)組由于表達(dá)的重組鴨IFN-α的作用，NDV在DEF上的復(fù)制受到了明顯的抑制，相對抑制率高達(dá)91%，各組病毒滴度的動態(tài)變化結(jié)果也進(jìn)一步驗證了重組鴨IFN-α能有效抑制NDV的復(fù)制和增殖。這些都表明，本研究中所表達(dá)的重組鴨IFN-α具有良好的抗病毒活性，為今后的大規(guī)模的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用pET-32a原核表達(dá)系統(tǒng)，采用變溫誘導(dǎo)的方法成功表達(dá)了可溶性的重組鴨IFN-α，經(jīng)細(xì)胞病變抑制法和熒光定量PCR的方法檢測，表達(dá)的重組鴨IFN-α具有良好抗病毒活性。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Soluble Expression and Activity Analysis of Mallard IFN-α

Liu Lanlan1Zhuang Yanna2Yu Xiaohong1Zeng Xiangwei2
（1. College of Basic Medical Science，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040；2. College of Wildlife Resources，Northeast Forestry University，Harbin 150040）

In order to acquire efficient expression and production of biologically active duck IFN-α, the mature protein gene of duck IFN-α was amplified from pMD18T-MaIFN-α. The fragment was linked to the prokaryotic expression vector pET-32a to construct the recombinant expression plasmids pET-32a（+）-MaIFN-α, and then converted into E.coli BL21 cells. The fusion protein was induced to express in the change temperature condition. SDS-PAGE and western blotting analysis were used to examine the fusion protein. After purified by Ni2+resin column, the activity of the expression product was determined. The results showed that the recombinant pET-32a（+）-MaIFN-α expressed a soluble protein after being induced by IPTG. Western blotting analysis showed the fusion protein had expected antigenicity. The activity of the expressed duck IFN-α detected by inhibiting cytopathic effect was about 8×104U/mL. The activity detected by the Real-time PCR showed that the expressed duck IFN-α had a strong inhibition of NDV replication in DEF. This indicated that the expressed duck IFN-α was verified to be of high antiviral activity.

Mallard IFN-α Soluble expression Activity analysis

2014-05-19

黑龍江省自然科學(xué)基金項目（C201223），黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)?？蒲谢痦椖浚˙S201402）

劉瀾瀾，女，博士，講師，研究方向：微生物與免疫；E-mail：lanlan0112@126.com

曾祥偉，男，博士，副教授，研究方向：病毒與免疫；E-mail：xiangwei_zeng@163.com