馬鈴薯AGPase活力反饋調(diào)控光合速率定量分析

白樺崔雪瓊白少星姚新靈

（1.寧夏農(nóng)業(yè)學(xué)校，銀川 750021；2.鄭州第二人民醫(yī)院，鄭州 450063；3.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021）

馬鈴薯AGPase活力反饋調(diào)控光合速率定量分析

白樺1崔雪瓊2白少星3姚新靈3

（1.寧夏農(nóng)業(yè)學(xué)校，銀川 750021；2.鄭州第二人民醫(yī)院，鄭州 450063；3.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021）

為了揭示ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）改變對(duì)葉片光合作用的反饋調(diào)控，以改變AGPase活力的馬鈴薯轉(zhuǎn)化株系為材料，測定了其AGPase活力（AA）、塊莖淀粉積累量（SC）、葉片光合速率（PR）、葉綠素（CC）和蔗糖含量（SUC）等；測定結(jié)果分析顯示，各株系的AGPase活力（AA）、塊莖淀粉積累量（SC）和葉片光合速率（PR）間存在顯著差異，且均顯著高于對(duì)照；株系間AGPase活力、塊莖淀粉含量和葉片光合速率呈顯著正相關(guān)性；每單位AGPase活力上升可貢獻(xiàn)貯藏器官淀粉積累增加2.5%，且是影響葉片光合速率的重要因素；結(jié)果表明，AGPase不僅是下游淀粉積累的限速酶，而且可向上游反饋調(diào)控光合速率。

淀粉含量 光合速率 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶 相關(guān)性

盡管合成途徑中的代謝物通過異構(gòu)和氧化還原等途徑調(diào)控淀粉積累，但就從碳固定到淀粉積累過程中對(duì)淀粉生物合成調(diào)控的理解則十分有限［1］。轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析表明，營養(yǎng)缺乏條件下，淀粉生物合成相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，而淀粉消耗及光合作用途徑基因則下調(diào)表達(dá)［2］。

營養(yǎng)脅迫使植物更傾向于光合產(chǎn)物用于淀粉積累，在聯(lián)系光合產(chǎn)物與淀粉積累間的代謝途徑中，晝夜周期通過Rubisco介導(dǎo)的CO2的固定調(diào)控光合作用，還調(diào)控著葉片轉(zhuǎn)運(yùn)淀粉的降解速度，確保夜間生長對(duì)碳的需求［3］。在途徑下游，腺苷二磷酸葡萄糖焦化酶（AGPase）也受到晝夜周期調(diào)控［4］。

AGPase以磷酸葡萄糖為底物，代謝合成腺苷二磷酸葡萄糖（ADP-葡萄糖），后者是淀粉生物合成的底物；在細(xì)菌和植物中AGPase分別是糖原和淀粉生物合成的限速酶，植物AGPase是由大亞基和小亞基組成的異源四聚體；葉片中AGPase不同isoform受到長短日照的光周期調(diào)控，呈現(xiàn)分化表達(dá)［5］。

大腸桿菌不同菌株中g(shù)lgC的突變，可顯著改變其編碼AGPase的活力，表達(dá)glgC的馬鈴薯，其塊莖淀粉含量提高30%以上［6］；植物中過量表達(dá)具有催化代謝功能的AGPase小亞基編碼基因，可顯著提高AGPase活力，增加貯藏器官及其它組織的淀粉積累［7-9］。

在光合與淀粉積累間的代謝途徑中，AGPase通過其活力改變，調(diào)控其下游淀粉的積累；AGPase催化的底物磷酸葡萄糖來自光合作用，盡管已明確AGPase小亞基cysteine 81是介導(dǎo)晝夜周期調(diào)控、形成二聚體所必需的［10］，但AGPase對(duì)途徑上游、尤其是如何影響光合作用尚屬未知。

1 材料與方法

1.1 材料

前期研究完成了由大腸桿菌glgC、馬鈴薯淀粉粒結(jié)合淀粉合成酶基因和AGPase小亞基基因組成的重組基因構(gòu)建及轉(zhuǎn)化，獲得表達(dá)了不同目的基因的8個(gè)株系，2株SG株系（株系SG1、SG2）表達(dá)了單拷貝大腸桿菌glgC（編碼AGPase），2株AG株系（株系A(chǔ)G1、AG2）表達(dá)單拷貝glgC和馬鈴薯AGPase小亞基基因（SS）反義cDNA，4株GG（株系GG1-4）表達(dá)單拷貝glgC和馬鈴薯淀粉粒結(jié)合淀粉合成酶基因（GBSSI）反義cDNA株系；本研究以此8個(gè)株系和其宿主紫花白對(duì)照為材料進(jìn)行其后的測定及分析。

實(shí)驗(yàn)室條件下繁殖各株系試管苗，待試管苗生長至8 cm，移栽于盛有品氏托普基質(zhì)的營養(yǎng)缽內(nèi)，每2 d澆水1次，在溫度25℃，光照強(qiáng)度12 kLx、15 h光照下培養(yǎng)到15 d后，移至同樣光照強(qiáng)度8 h光照下培養(yǎng)誘導(dǎo)結(jié)薯，誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d后，隨即分別在各株系個(gè)體上、中、下3個(gè)部分采集生長良好、大小一致的葉片1 g，用于葉綠素含量、蔗糖含量和ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活力測定，樣品隨采隨用。第30天收獲塊莖，風(fēng)干3 d后儲(chǔ)藏于4℃用于塊莖淀粉含量測定。

1.2 方法

光照誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d后，采用英國產(chǎn)CIRAS-Ⅰ型便攜式光合測量儀測定凈光合速率（以下簡稱光合速率），測定操作步驟按照說明書進(jìn)行；上午10時(shí)，在每個(gè)個(gè)體上、中、下3個(gè)部位，選擇大小相似、充分伸展的8個(gè)葉片，取均值為單次測定結(jié)果，間隔1 d測定第2次，同前測定計(jì)算的數(shù)據(jù)為第2次重復(fù)，測定共重復(fù)3次。

按照Wickliff等［11］的方法進(jìn)行葉綠素含量（w/w，%），蔗糖含量（w/w，‰）用蔗糖含量測定試 劑 盒（Glucose and Sucrose Assay Kit、ab65334，ab-cam，USA）進(jìn)行。采用淀粉測定試劑盒（EnzyChromTMStarch Assay Kit BioAssay Systems，USA）完成塊莖淀粉含量測定。塊莖ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活力測定按照姚新靈等［12］的方法進(jìn)行。

為了便于直觀比較分析，SG、AG和GG株系3個(gè)群體各個(gè)體葉綠素含量、光合速率和蔗糖含量除以群體中的最大均值后，以得到的商為統(tǒng)計(jì)變量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；群體各個(gè)體塊莖淀粉含量減去對(duì)照株系塊莖淀粉含量所得所得差作為塊莖淀粉含量統(tǒng)計(jì)變量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 AGPase活力、塊莖淀粉含量和光合速率差異顯著

面對(duì)迅猛的城市化浪潮，新一輪針對(duì)城市發(fā)展的研究和實(shí)踐將迎來熱潮。古希臘哲學(xué)家赫拉克利特曾經(jīng)說過：“看不見的和諧比看得見的和諧更美。”以文化營銷的方式，為城市的發(fā)展注入新的可持續(xù)發(fā)展動(dòng)力。通過充分挖掘城市文化資源、有效將文化資源轉(zhuǎn)變?yōu)槲幕Y產(chǎn)、增強(qiáng)城市文化認(rèn)同、提升城市治理能力等途徑，以打造城市多元文化景觀空間、尋求城市準(zhǔn)確清晰定位、運(yùn)用“文化+”、進(jìn)行多產(chǎn)業(yè)融合、巧用新媒介平臺(tái)拓寬城市宣傳渠道等方式，不僅可以完善城市文化營銷的理論，也能更好地推動(dòng)城市的良性發(fā)展，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和前瞻性。

8個(gè)轉(zhuǎn)化株系A(chǔ)GPase活力、塊莖淀粉含量、葉片葉綠素、葉片蔗糖含量和葉片光合速率測定結(jié)果分析顯示，8個(gè)株系塊莖淀粉含量、AGPase活力、葉片光合速率間及塊莖淀粉含量間存在顯著差異（P ＜0.05），且極顯著高于對(duì)照株系（P＜0.01）（圖1-圖3）；葉片葉綠素和蔗糖含量在各株系間存在不顯著差異（P ＜0.05）（圖4）。

2.2 AGPase活力、塊莖淀粉含量和光合速率的相關(guān)性

2.2.1 AGPase活力與塊莖淀粉含量呈正相關(guān)性 轉(zhuǎn)化株系塊莖AGPase活力間、塊莖淀粉含量間及葉片光合速率間差異顯著，且顯著高于對(duì)照。為了明確三者聯(lián)系，相關(guān)分析顯示，盡管AGPase活力與葉片光合速率無顯著相關(guān)性，但光合速率與塊莖淀

粉含量間相關(guān)系數(shù)為0.651，呈顯著Pearson相關(guān)性（P ＜0.05）。

圖1 株系塊莖淀粉含量比較

圖2 株系A(chǔ)GPase活力比較

圖3 株系葉片光合速率比較

轉(zhuǎn)化株系間塊莖淀粉含量和AGPase活力相關(guān)分析顯示，兩指標(biāo)相關(guān)系數(shù)為0.875，呈顯著Pearson相關(guān)性（P＜0.01）；塊莖淀粉含量和AGPase活力回歸模型方差分析顯示，回歸模型顯著（P＜0.01），回歸系數(shù)為2.47；t檢驗(yàn)顯示其統(tǒng)計(jì)顯著（P＜0.01），常數(shù)為5.45；所以塊莖淀粉含量（SC）和AGPase活力（AA）一元線性方程為：SC = 2.47AA + 5.45（圖5）。

圖4 株系葉綠素及葉片蔗糖含量比較

圖5 塊莖淀粉含量（SC）和AGPase活力（AA）線性方程

2.2.2 塊莖淀粉含量與光合速率呈正相關(guān)性 光合速率與塊莖淀粉含量回歸模型方差分析顯示，回歸模型顯著（P＜0.05），回歸系數(shù)為0.22；t檢驗(yàn)顯示其統(tǒng)計(jì)顯著（P＜0.05），常數(shù)為0.55；所以光合速率（PR）與塊莖淀粉含量（SC）一元線性方程為：PR=0.22 SC+0.55（圖6）。

2.2.3 AGPase活力與與光合速率呈正相關(guān)性 AGPase活力與光合速率回歸模型方差分析顯示，回歸模型顯著（P＜0.05），回歸系數(shù)為0.42；t檢驗(yàn)顯示其統(tǒng)計(jì)顯著（P＜0.05），常數(shù)為2.382；所以，光合速率（PR）與塊莖淀粉含量（SC）一元線性方程為：PR = 0.42AA + 2.38（圖7）。

2.3 AGPase活力、塊莖淀粉含量和光合速率相關(guān)性比較

以各回歸顯著的3個(gè)指標(biāo)AGPase活力、光合

速率、塊莖淀粉含量的回歸系數(shù)的倒數(shù)表示其各自的相關(guān)程度的直觀結(jié)果如圖8所示，其中數(shù)字越小表示兩者越接近，相關(guān)程度越高；AGPase與光合作用的相關(guān)程度遠(yuǎn)不及其與淀粉積累，但光合作用與AGPase的相關(guān)程度遠(yuǎn)高于光合作用與淀粉積累的相關(guān)程度。

圖6 光合速率（PR）與塊莖淀粉含量（SC）線性方程

圖7 AGPase活力（AA）與光合速率（PR）線性方程

圖8 回歸系數(shù)倒數(shù)表示的相關(guān)程度結(jié)果的直觀示意圖

3 討論

各株系A(chǔ)GPase活力、塊莖淀粉含量、葉片光合速率間及塊莖淀粉含量間存在顯著差異，且極顯著高于對(duì)照株系，這一結(jié)果表明，大腸桿菌glgC重組基因體內(nèi)表達(dá)，提高了AGPase活力，增加了轉(zhuǎn)化株系塊莖淀粉積累，這與以往研究報(bào)道的結(jié)果一致［7］，AGPase活力提高增加了ADP葡萄糖的合成，高水平淀粉合成底物—ADP葡萄糖增強(qiáng)了淀粉積累。

塊莖淀粉含量（SC）和AGPase活力（AA）一元線性方程（SC = 2.47AA + 5.45）的結(jié)果表明，AGPase活力每增加1單位，可使塊莖淀粉含量提高2.5%；盡管以往就植物淀粉積累依賴于AGPase活力的定性報(bào)道諸多［7］，但尚未見塊莖淀粉含量在多大程度上依賴于AGPase活力的定量報(bào)道，本研究所得出比率屬首次提出。

光合速率受到內(nèi)外多種因素影響，本研究光合速率與塊莖淀粉含量顯著正相關(guān)的結(jié)果表明，貯藏器官淀粉積累的增加可反饋調(diào)控光合速率提高，在本試驗(yàn)條件下，回歸系數(shù)為0.22的結(jié)果意味著影響光合速率提高的2%來自貯藏器官淀粉積累的增加。

AGPase與光合作用的相關(guān)程度遠(yuǎn)不及其與淀粉積累，而光合作用與AGPase的相關(guān)程度遠(yuǎn)高于光合作用與淀粉積累的相關(guān)程度，這一結(jié)果表明AGPase活力的改變不僅直接調(diào)控其下游淀粉的積累，而且向上游通過反饋調(diào)控光合作用間接調(diào)控淀粉積累，近年研究證據(jù)也支撐了AGPase反饋調(diào)控光合作用。

光合電子傳遞鏈產(chǎn)生的氧化還原信號(hào)，參與卡爾文循環(huán)、ATP合成及NADPH從葉綠體輸出［13］，抑制電子傳遞鏈中硫氧還蛋白（Trx f1）表達(dá)，導(dǎo)致光激活的還原態(tài)AGPase活力衰減，淀粉合成隨之下降［14］，AGPase與磷酸丙糖相關(guān)功能缺失的雙突變體（adg1-1/tpt-2），在高光強(qiáng)下碳水化合物合成減少［15］；因此，AGPase通過光合電子傳遞反向影響光合作用。

葉綠素含量和蔗糖含量并未隨貯藏器官淀粉積累的增加而改變，同時(shí)也未受光合速率的影響，這一結(jié)果表明，光合速率提高并未改變?nèi)~片葉綠素含量和蔗糖含量相關(guān)的代謝平衡。結(jié)果同時(shí)也表明，AGPase活力改變并未通過葉綠素含量和蔗糖含量反饋調(diào)控光合作用，而是通過其它目前尚不明確的途徑調(diào)控光合作用，這有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）AGPase不僅是下游淀粉積累的限速酶，而且可向上游反饋調(diào)控光合速率。（2）AGPase對(duì)光合作用的反饋調(diào)控關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Quantitative Analysis on Feedback of AGPase to Photosynetic Rate in Potato

Bai Hua1Cui Xueqiong2Bai Shaoxing3Yao Xinling3
（1. Ningxia Agriculture School，Yinchuan 750021；2. Zhengzhou 2ndRenmin Hospital，Zhengzhou 450063；3. Life Science School，Ningxia University，Yinchuan 750021）

To reveal feedback regulation of ADP-pyrophosphrolase（AGPase）to photosynthesis, AGPase activities（AA）, starch contents（SC）in tuber, photosynthetic rates（PR）, chlorophyll contents（CC）and sucrose contents（SUC）in leafs were assayed with potato transgenic lines showing difference on ADP-pyrophosphrolase activities. The data analysis showed that AA, SC and PR in transgenic lines were significantly higher than control line. Significantly differences were found between AA, SC and PR among the lines. Correlation analysis showed that there were positive correlations between AA, SC and PR. Per unit rising of AGPase activities can contributed 2.5% increase of starch contents in sink tissue. AGPase was a factor playing a role in regulation of photosynthetic rates. The result indicated that AGPase not only regulates starch accomulation on the downstream, also feedback to modulate photosynthetic rate.

Starch contents Photosynthetic rate ADP-pyrophosphrolase Correlation

2014-04-09

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30660079），2012年寧夏科技支撐計(jì)劃

白樺，女，副教授，研究方向：植物生理學(xué)；E-mail：1486814368@qq.com

姚新靈，博士，教授，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：chinanoahl@163.com