OsPHGPx 基因的過量表達增強水稻抗氧化能力

宋建輝李甜吳秀云吳赴清劉進元

（1. 清華大學生命科學學院 植物生物學研究中心植物分子生物學實驗室，北京 100084；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081）

OsPHGPx 基因的過量表達增強水稻抗氧化能力

宋建輝1李甜2吳秀云1吳赴清2劉進元1

（1. 清華大學生命科學學院 植物生物學研究中心植物分子生物學實驗室，北京 100084；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081）

植物在生物或非生物脅迫下會通過表達磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（PHGPx）來抵御脅迫引起的氧化損傷，但是PHGPx在植物體內(nèi)抗氧化途徑中所扮演的生理角色目前尚不完全清楚。利用農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化技術，構建了過表達OsPHGPx基因的轉(zhuǎn)基因水稻，并對轉(zhuǎn)基因水稻進行了PCR、實時定量PCR以及Western blot等檢測分析，結果表明OsPHGPx基因已成功轉(zhuǎn)入水稻并正常表達。與野生型水稻相比，這些過量表達OsPHGPx的轉(zhuǎn)基因水稻抵御百草枯氧化傷害的能力提高。

OsPHGPx ROS 遺傳轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)基因水稻

谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）是一個含有多種同工酶的家族，它利用谷胱甘肽作為還原劑，清除生物體內(nèi)的H2O2，有機氫過氧化物和脂類氫過氧化物，從而起到保護生物體細胞免受氧化脅迫傷害的作用［1］。根據(jù)氨基酸序列差異，底物特異性以及組織分布的不同，GPx分為以下四類：（1）經(jīng)典GPx（Classical cellular glutathione peroxidase，c-GPx）；（2）血 漿 GPx（Plasma glutathione peroxidase，p-GPx）；（3）胃腸GPx（Gastrointestinal glutathione peroxidase，GI-GPx）；（4）磷脂氫過氧化物GPx（Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase，PHGPx）［2］。其中，由于PHGPx可以直接清除脂質(zhì)氫過氧化物，而GPx家族其他的成員則只能與磷脂酶協(xié)同才能發(fā)揮作用，因此PHGPx被看作是一類獨特的抗氧化酶，并被認為是主要的抗膜脂氧化脅迫因子［3-6］。

PHGPx首先發(fā)現(xiàn)于動物體內(nèi)［2］，對其進行了較深入的研究。對植物PHGPx的研究起步于20世紀90年代，目前已經(jīng)在多種植物中克隆到了動物PHGPx的同源基因，如水稻（Oryza sativa L.）［7］、煙草（Nicotiana sylvestris）［8］、苦瓜（Momordica charantia）［9］、柑桔（Citrus sinensis）［10］、擬南芥（Arabidopsis thaliana）［11］和蘿卜（Raphanus sativus）［12］等。Yang等［13］還從蘿卜中純化出了具有PHGPx活性的蛋白，并證明其定位是位于線粒體［14］，在柑桔

中也部分純化到了具有PHGPx活性的蛋白［15］。另外，到目前為止所鑒定到的植物PHGPx家族基因，都能夠響應生物或者非生物因素引起的氧化脅迫，并且相比較于H2O2，它們與脂質(zhì)過氧化氫的親和力更強［7，16-18］。 在擬南芥中已證明了PHGPx在過氧化氫清除、信號傳導以及抗光氧化脅迫等方面的作用［19，20］。研究者還成功地構建了過表達GPx-like蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草，提高了植物清除細胞膜上過氧化脂質(zhì)的能力，降低了煙草在各種脅迫條件引起的質(zhì)膜過氧化情況下的受傷害程度［21］。Li等［7，22］在水稻中克隆到了PHGPx基因，并分析了其表達特征以及抗氧化活性，結果發(fā)現(xiàn)，OsPHGPx的表達特征與水稻體內(nèi)的活性氧的分布有一定的關聯(lián)性，并且氧化脅迫條件可以顯著誘導該基因表達水平的升高。

水稻不僅是一種重要的糧食作物，也是一種重要的模式生物，在植物研究尤其是單子葉植物研究中占有重要的地位。為了進一步印證PHGPx在植物體抵抗膜脂過氧化方面的作用，本研究利用根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化技術構建過表達OsPHGPx的轉(zhuǎn)基因水稻，分析該基因在轉(zhuǎn)基因再生植株中的表達，以及氧化脅迫處理條件下再生植株的抗氧化水平，為進一步解析高等植物中PHGPx生理作用提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻品種為粳稻kitaake，轉(zhuǎn)基因過表達載體PYL436（也稱pC-TAPa）由清華大學劉玉樂教授實驗室提供；水稻遺傳轉(zhuǎn)化所用的農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens EHA105 菌株由中國農(nóng)科院作物科學研究所萬建民實驗室惠贈；大腸桿菌DH5α為本實驗室保存；Ex Taq、DNase、T4 DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶以及 Real-time 試劑盒購自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA PCR Kit（AMV）購于上海生物工程公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、植物總RNA提取試劑盒、DNA marker購自北京Tiangen公司；Gateway技術相關試劑購自Invitrogen公司；百草枯購自Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純以上。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉(zhuǎn)化 設計引物PHGPx-F和PHGPx-R（表1），引物兩端帶有attB1和attB2位點，從水稻cDNA文庫中擴增出目的基因水稻磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶基因OsPHGPx（Os03g0358100）。通過Gateway技術將目的基因轉(zhuǎn)入表達載體PYL436質(zhì)粒。pC-TAPa表達載體的結構如下：2×35S啟動子適合各種植物表達，attR1∷Cmr∷ccdB∷attR2序列用來通過Gateway技術插入目的基因，9×myc標簽用于Western blot檢測，6×His和2×IgG-BD標簽以及3C蛋白酶位點可用于純化蛋白復合體（圖1）。

表1 研究中所使用的引物序列

圖1 pC-TAPa載體示意圖

將構建好的表達載體先轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，然后通過農(nóng)桿菌侵染水稻成熟胚誘導有效愈傷組織，使目的基因TAP表達載體整合到水稻基因組中，獲得水稻轉(zhuǎn)基因植株，受體水稻品種為Kitaake，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程以及植株再生過程參考Hiei等［23］方法，具體如下：去殼成熟水稻種子依次用70%乙醇、2%次氯酸鈉溶液消毒，無菌水沖洗后接種于誘導培養(yǎng)

基。將培養(yǎng) 5-7 d的愈傷組織浸入農(nóng)桿菌菌液感染20 min 后取出并用無菌吸水紙吸干，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)。3 d 后切除胚芽并將愈傷組織轉(zhuǎn)入抗性選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)。2周后，取抗性篩選出的愈傷組織轉(zhuǎn)入新鮮的篩選培養(yǎng)基上，經(jīng)2 次篩選培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入預分化培養(yǎng)基培養(yǎng) 10 d 左右，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基于26℃，15 h/d 光照條件下分化培養(yǎng)。形成的小苗放入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，待形成完整根系后移栽。水稻轉(zhuǎn)基因工作由國家植物轉(zhuǎn)基因技術研究中心完成。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因水稻再生植株的鑒定分析

1.2.2.1 轉(zhuǎn)基因水稻再生植株的PCR鑒定 CTAB法提取培養(yǎng)15 d的水稻葉片基因組DNA，通過PCR分析進行陽性植株篩選，所用引物為35S-F和PHGPx-R’，引物序列，見表1。

1.2.2.2 轉(zhuǎn)基因水稻再生植株的Real-time PCR分析 使用植物RNA提取試劑盒（Tiangen，China）提取15 d水稻葉片RNA，反轉(zhuǎn)所得cDNA進行實時定量PCR，所用引物為RT-PHGPX-F和RTPHGPX-R，內(nèi)參為Actin基因，所用引物序列見表 1。

1.2.2.3 Western blot 水稻蛋白提取方法參照Cui等［23］方法并作了一些優(yōu)化：液氮中將2 g水稻葉片研磨成粉末，加入4 mL預冷蛋白提取液（50 mmol/L Tris-HCl，pH7.8，10%甘油，2% β-巰基乙醇，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L EDTA；冰上放置30 min后，4℃，16 000 r/min離心30 min；取上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，并加入5倍體積的丙酮，-20℃過夜沉淀；經(jīng)4℃，12 000 r/min離心30 min后，得到的蛋白沉淀加入0.5 mL的SDS上樣緩沖液，測定蛋白濃度后備用。每個樣品取10 μg蛋白上樣，電泳時先使用60 V 電壓預電泳，當溴酚藍前沿跑至分離膠和濃縮膠界面時，使用120 V 繼續(xù)電泳，溴酚藍前沿跑出凝膠后，結束電泳。半干轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結束后于20 mLTBS-T室溫洗膜 5 min，隨即轉(zhuǎn)移至25 mL封閉液中（TBS-T，5%脫脂奶粉）封閉8 h。洗膜3次后加入一抗溶液（TBS-T，0.5%脫脂奶粉，1∶1 000稀釋的一抗）室溫孵育 2 h。棄去一抗溶液，洗膜3次后倒入二抗溶液（TBS-T，0.5%脫脂奶粉，1∶5 000稀釋的二抗）室溫孵育1 h。棄去二抗溶液，4次洗膜后進行顯影、壓片及曝光。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因水稻抗氧化表型分析

1.2.3.1 水稻生長條件和脅迫處理 水稻種子經(jīng)表面消毒后，32℃浸泡24 h，然后32℃催芽萌發(fā)45 h。萌發(fā)后將水稻轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)箱（Percival，USA）中，水稻生長條件設定為：28℃/21℃（白天16 h/夜晚8 h），光照強度400 mmol/（m2·s），相對濕度70%，Hogland營養(yǎng)液提供水稻生長所需的全部營養(yǎng)，營養(yǎng)液每2 d更換1次。在溫室中生長的水稻用水稻營養(yǎng)液培養(yǎng)，待長到2-3周后，轉(zhuǎn)移到水田中生長。水稻的氧化脅迫處理是將培養(yǎng)15 d的水稻置于含100 mmol/L百草枯（Sigma，USA）的水稻培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，其他培養(yǎng)條件不變。

1.2.3.2 相對離子滲透率（Relative electrolyte leakage，REL）測定 取待測水稻新鮮葉片，用去離子水將其沖洗干凈后，剪成長約1 cm的小片段，放到干凈的15 mL離心管中，加入去離子水于28℃搖床中輕輕振蕩6 h。振蕩完畢后用DDS-11A型電導儀（Kangyi，China）測量每一管樣品溶液的電導率，記為C1。然后將試管放置在100℃的沸水中煮20 min，使水稻葉片的離子全部都滲入到溶液里，用流動水幫助試管冷卻到室溫后，再測定溶液的電導率，記為C2。計算每一管樣品的相對離子滲透率：REL=C1/C2×100%，本試驗有3次生物學重復，每次試驗各樣品平行3次重復。

1.2.3.3 丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測定 稱取新鮮水稻葉片0.3 g，放入預冷的研缽中并于冰上研磨，研缽中加入3 mL PBS，并加入少許二氧化硅輔助研磨，當水稻葉片研磨成勻漿時為止。將勻漿轉(zhuǎn)移至15 mL尖底離心管中，在4℃離心機中12 000 r/min離心10 min。取上清0.3 mL到新的15 mL離心管中，隨后按照MDA檢測試劑盒中的說明書加入各試劑，將離心管置于95℃水浴鍋中水浴40 min。然后于流動水中冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min，吸取上清，使用分光光度計檢測各管在532 nm處的吸光值，本試驗有3次生物學重復，每次試驗各樣品平行3次重復。

2 結果

2.1 OsPHGPx基因過表達水稻植株的再生

利用設計的引物從水稻cDNA文庫中克隆到

OsPHGPx基因，瓊脂糖電泳結果（圖2）顯示，所獲得的片段大小符合預期，約為510 bp，產(chǎn)物進行膠回收后構建TAP表達載體。將構建好的目的基因植物TAP表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，通過水稻成熟胚誘導有效愈傷組織及農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化技術，將目的基因整合到水稻基因組中，成功獲得相應的T0代水稻轉(zhuǎn)基因植株22株（圖3）。

圖2 OsPHGPx基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2 轉(zhuǎn)基因水稻再生植株的PCR鑒定

為了保證轉(zhuǎn)基因水稻的成功獲得，首先利用PCR對經(jīng)過抗性篩選所得到的轉(zhuǎn)基因水稻植株進行分子鑒定，從而排除假陽性植株。經(jīng)抗性篩選得到的22個轉(zhuǎn)基因水稻幼苗中，在21株中檢測到了預期大小的條帶，約為250 bp，初步判定為陽性植株。陽性篩選結果（圖3）表明我們的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法具有非常高的成功率，陽性率高達95%。

圖3 轉(zhuǎn)基因水稻的PCR鑒定

2.3 轉(zhuǎn)基因水稻的Real-time RCR分析

為了進一步確定OsPHGPx基因在各轉(zhuǎn)基因水稻株系中的轉(zhuǎn)入情況，從21株陽性植株中挑選了部分株系，提取RNA，并進行實時定量PCR分析。試驗結果（圖4）顯示，在絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因水稻株系中，OsPHGPx基因的表達水平有不同程度的明顯升高，最高的株系可以升高10倍左右。

圖4 轉(zhuǎn)OsPHGPx基因水稻再生植株Real-time PCR分析

2.4 轉(zhuǎn)基因水稻的Western blot分析

在轉(zhuǎn)基因水稻中選取OsPHGPx 基因表達水平呈現(xiàn)明顯高量表達的4個株系，檢測其體內(nèi)的OsPHGPx 蛋白水平表達情況。Western blot結果（圖5）顯示，在4個株系中，均檢測到帶有載體標簽的OsPHGPx蛋白的表達，蛋白大小約50 kD，符合預期分子量大小，而在野生型水稻中，則檢測不到帶有標簽的OsPHGPx蛋白。該結果表明，轉(zhuǎn)入水稻的OsPHGPx基因在體內(nèi)實現(xiàn)了正常的編碼表達。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株的Western blot分析

2.5 轉(zhuǎn)基因水稻對脂質(zhì)過氧化抵抗力的變化

2.5.1 轉(zhuǎn)基因水稻相對離子滲透率分析 為了探究過表達OsPHGPx的轉(zhuǎn)基因水稻的氧化脅迫能力是否增強，根據(jù)Western blot（圖5）結果，選取了兩個體內(nèi)OsPHGPx蛋白過量表達的株系L5和L10，分析其在百草枯處理后的相對離子滲透率變化。相對離子滲透率（REL）可以指示植物體細胞膜其滲透能力的大小，從而間接地反映細胞膜的通透性及其受損傷程度。結果如圖6所示，經(jīng)t檢驗，非轉(zhuǎn)基

因水稻處理前后存在極顯著差異（P＜0.01），而轉(zhuǎn)基因水稻兩個株系中，同株系處理前后的REL差異顯著性就相對降低（P＜0.05）。因此，對于野生型水稻，百草枯處理之后其相對離子滲透率有明顯地升高，說明其質(zhì)膜受到損傷，同時也證明了對水稻氧化脅迫處理手段的有效性。而在過表達OsPHGPx的轉(zhuǎn)基因水稻株系中，相對離子滲透率的升高幅度比野生型水稻降低很多，表明了處理對水稻產(chǎn)生的傷害程度明顯降低。說明OsPHGPx蛋白的高表達降低了質(zhì)膜過氧化傷害程度，轉(zhuǎn)基因水稻抵抗膜脂過氧化傷害的能力增強。

圖6 水稻幼苗葉片百草枯處理后的電解質(zhì)滲透率

2.5.2 轉(zhuǎn)基因水稻MDA含量變化 MDA是生物體細胞膜發(fā)生過氧化后產(chǎn)生的物質(zhì)，因此它可以作為細胞膜受損傷程度的一個標志性產(chǎn)物，其含量與細胞的膜脂過氧化程度呈正相關的關系［25］。因此又比較了非轉(zhuǎn)基因水稻、L5和L10兩個轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量變化。結果（圖7）顯示，與相對離子滲透率試驗結果比較一致，非轉(zhuǎn)基因水稻處理前后的MDA含量具有顯著差異（P＜0.05），處理后比處理前的MDA值明顯升高，而在轉(zhuǎn)基因水稻中同一株系處理前后MDA差異性不大，只能看出有微弱的升高趨勢。同樣證明了轉(zhuǎn)基因水稻抗抵抗膜脂過氧化傷害能力的提高。

3 討論

哺乳動物中的PHGPx參與細胞基本生理過程的控制，且其很多的生理功能已經(jīng)被研究的非常清楚。除了幫助細胞抵御由自由基和膜脂過氧化物造成的細胞死亡，它還作為一個巰基過氧化物酶并能夠調(diào)節(jié)ROS信號，從而在很多生理過程中扮演著重要角色，如抑制細胞凋亡、介導炎癥防御機制以及參與精子發(fā)生過程等［26］。最近研究發(fā)現(xiàn)它還在鼠科動物胚胎發(fā)育過程中有重要作用［27］。在植物中也克隆到了很多PHGPx的同源基因，也有研究表明其對很多生物和非生物條件造成的氧化脅迫可以產(chǎn)生應答反應，研究者發(fā)現(xiàn)蘿卜PHGPx基因能夠互補酵母PHGPx缺失突變體的表型，推測蘿卜PHGPx基因可能與酵母PHGPx3同樣有著保護細胞膜抵抗氧化脅迫的作用［12］。

圖7 水稻幼苗葉片百草枯處理后的MDA含量

本研究中選取pC-TAPa作為水稻遺傳轉(zhuǎn)化過程中的過表達載體，由于其含有多個標簽，常被用于串聯(lián)親和純化（Tandem affinity purification，TAP）技術，來研究生理條件下蛋白質(zhì)之間的相互作用［28，29］。近年來，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)體內(nèi)廣泛存在的抗氧化酶基因的作用可能不僅僅局限于清除 H2O2等 ROS 分子，它更重要的作用也許在于通過改變體內(nèi)各種蛋白的氧化還原狀態(tài)而參與信號轉(zhuǎn)導。例如，擬南芥的GPX3 可以通過與 ABA信號通路中 ABI1 和ABI2相互作用并改變它們的氧化還原狀態(tài)，從而影響 ABI1和 ABI2 的活性，從而間接參與ABA信號通路［19］。因此，在本研究中使用TAP載體來構建OsPHGPx基因過量表達載體，不但能夠觀察其在過量表達情況下的抗氧化相關表型，從而研究其基因的功能，并且還有助于人們?nèi)ヌ剿髌湓谥参矬w內(nèi)發(fā)揮功能時的作用方式或者可能參與的途徑，但這還有待進一步的研究。

4 結論

利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法構建了過表達OsPHGPx的轉(zhuǎn)基因水稻。實時定量PCR以及Western blot方法分別在mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上表明了OsPHGPx在水稻中的成功表達。說明所選取的遺傳轉(zhuǎn)化方法非常適用于粳稻 Kitaake，并且具有較高的陽性率。用百草枯處理水稻，造成植物膜脂過氧化損傷情況下，相對于野生型水稻，高量表達OsPHGPx的轉(zhuǎn)基因水稻顯示了較強的抗氧化能力，預示著該基因在保護植物細胞膜免受氧化損傷過程中的功能。

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（責任編輯 李楠）

Enhanced Oxidative Stress Tolerance of Transgenic Rice Plants Overexpressing OsPHGPx Gene

Song Jianhui1Li Tian2Wu Xiuyun1Wu Fuqing2Liu Jinyuan1
（1. Laboratory of Plant Molecular Biology，Center for Plant Biology，School of Life Sciences，Tsinghua University，Beijing 100084；2 . Institute of Crop Sciences of CAAS，Beijing 100081）

Plants can express phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase（PHGPx）to resist oxidative stress caused by biotic or abiotic stress. But the physiological role of PHGPx in conferring stress defence is still unclear. In this study, agrobacterium genetic transformation technology was successfully used to obtain transgenic rice overexpressing OsPHGPx. PCR, Real-time PCR and Western blot analysis was carried out on the transgenic rice, and all the results showed that OsPHGPx gene was transformed into the rice successfully. In addition, compared with the non-transgenic rice, seedlings of transgenic lines demonstrated enhanced tolerance to oxidative stress caused by paraquat.

OsPHGPx ROS Genetic transformation Transgenic rice

2014-04-14

國家動植物轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ棧?009ZX08009-069B）

宋建輝，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學；E-mail：songjh11@mail.tsinghua.edu.cn

劉進元，教授，博士生導師，研究方向：植物分子生物學；E-mail：liujy@mail.tsinghua.edu.cn