利用SRAP標記分析海南旱稻地方品種的遺傳多樣性及其分子身份證的構建

姚宇飛王英，2莊南生，2高和瓊

（ 1.海南大學農(nóng)學院，?？?570228；2.熱帶作物種質資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室 ，?？?570228）

利用SRAP標記分析海南旱稻地方品種的遺傳多樣性及其分子身份證的構建

姚宇飛1王英1，2莊南生1，2高和瓊1

（ 1.海南大學農(nóng)學院，?？?570228；2.熱帶作物種質資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室 ，?？?570228）

利用SRAP標記對來自海南省的28份旱稻種質進行了親緣關系分析。從255對引物組合中篩選出46對擴增條帶清晰、多態(tài)性高的引物組合，并選用其中的18對引物組合對28份材料進行SRAP擴增，共擴增出180個條帶，其中多態(tài)性條帶160條，多態(tài)性比率為87.75%，平均每對引物組合產(chǎn)生10個條帶和8.9個多態(tài)性條帶。并且，運用UPMGA方法進行的聚類分析結果表明，供試旱稻種質的遺傳相似系數(shù)范圍為0.687 0-0.921 2，在遺傳相似系數(shù)0.687 0處分為兩大類群，第I類群全部為海南山欄稻種質，第Ⅱ類群為海南地方旱稻坡壓和本研究組自育旱稻品種。對海南旱稻地方品種的劃分表明，山欄稻種質間親緣關系較近，海南地方旱稻坡壓可能與秈型水稻種質具有一定的遺傳相似性。此外，還構建了28份海南省旱稻種質的SRAP標記分子身份證，可為山欄稻種質的遺傳親緣關系，種質鑒定及新品種選育等方面提供依據(jù)。

旱稻 山欄稻 SRAP標記 遺傳多樣性 分子身份證

我國旱稻種質資源豐富，共有3 100多份，占地方品種的6.2%，主要分布于云南、貴州和海南等?。?］。據(jù)王官遠等［2］對海南稻種資源的考察結果表明，旱稻資源是海南稻種資源的主體并占總數(shù)的80%，而山欄稻又占海南旱稻資源的80%以上［3］。可見海南旱稻種質主要為山欄稻，因此，山欄稻在

海南稻種資源中占據(jù)特殊地位［4］。山欄稻是旱稻的一大類，具有極其重要的社會、生態(tài)和經(jīng)濟價值。山欄稻亦作“砍山”或“砍山欄”，是一種在山地上采用刀耕火種方式種植旱稻的原始農(nóng)業(yè)耕作方法，用這種方式種植的旱稻俗稱為山欄稻［1］。山欄稻作為海南省獨有的適應熱帶、亞熱帶山地（旱地）種植的珍貴地方旱稻種質，資源豐富，具有抗旱、耐瘠、高蛋白、高賴氨酸等優(yōu)良品質特性和獨特的香味及高營養(yǎng)價值等特點。目前，國內(nèi)外有關以海南山欄稻種質為研究對象的報道不多，并主要集中在農(nóng)藝性狀、抗旱生理特性、核心種質的構建、遺傳分析、類緣分析等方面［5-8］，而有關利用分子標記進行遺傳多樣性研究的報道甚少，僅見陳良斌等［9］利用SSR標記對海南普通野生稻和山欄稻的遺傳多樣性進行過比較分析；本課題組利用RAPD標記對包括海南山欄稻在內(nèi)的多份旱稻種質進行了遺傳多樣性分析［10，11］。相關序列擴增多態(tài)性（Sequencerelated amplified polymorphism，SRAP）分子標記，通過獨特的雙引物設計對基因的開放式閱讀框（Open reading frames，ORFs）特定區(qū)域進行擴增，因不同個體以及物種的內(nèi)含子、啟動子與間隔區(qū)長度不同而產(chǎn)生多態(tài)性，所以此方法具有簡便、產(chǎn)率高、可顯示大量的共顯性標記、易從序列中得到分離的條帶等優(yōu)點，在遺傳學和育種學領域具有廣泛的應用前景。自Li 等［12］于2001年在蕓薹屬植物中開發(fā)出新型分子標記技術SRAP標記建立以來，其已成功地應用于馬鈴薯［13］、西瓜［14］、番茄［15］等作物的分子標記輔助遺傳育種，豌豆［16］、油菜［17］、棉花［18］、西葫蘆和筍瓜［19］的遺傳多樣性分析，羽衣甘藍×花椰菜［20］、油菜籽［21］、蕓薹［22］、甘藍型油菜籽［23］的分子連鎖圖譜構建，芥子油糖苷合成基因［24］的定位以及擬南芥和甘藍［20］的同源性研究等方面。而利用SRAP標記分析以山欄稻為主體的海南地方旱稻遺傳多樣性及其分子身份證數(shù)據(jù)庫的構建尚未見報道。本研究首次利用18對SRAP標記引物組合對28份海南旱稻種質進行檢測，探討其遺傳相似性，并構建分子身份證數(shù)據(jù)庫，旨在通過對海南旱稻地方品種資源遺傳多樣性的研究，為海南旱稻地方品種鑒別、種質雜交及抗旱型稻作的選育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的海南旱稻品種共28份（表1），均由海南大學農(nóng)學院生物技術系遺傳育種課題組提供。其中24份為海南旱稻地方品種（23份為海南山欄稻，1份為海南地方旱稻坡壓），取自海南瓊中、保亭、白沙、樂東等地山坡地種植的原始品種材料，并經(jīng)本研究組提純；另外4份為本研究組自育的熱大系列旱稻，包括熱大1號：{珍汕97A×［（七盧粘×S12）F3×明恢63］F1}F8；熱大2號：{珍汕97A×［（S14×香珍矮）F2×明恢63］F1}F8；熱大7號：［珍汕97A×（S12×汕優(yōu)廣12）F2］F8；2000GI09：（S12×汕優(yōu)廣12）F11。

表1 28份海南旱稻種質編號及名稱

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與質量檢測 海南旱稻地方品種基因組總DNA的提取采用Johansen［25］提供的CTAB方法，加以改進簡化。

1.2.2 SRAP引物 根據(jù)Li等［12］設計SRAP引物的原則，即上游引物應為10個無特異組成的填充序列與CCGG序列和3個選擇性堿基組成，下游引物應為11個無特異組成的填充序列與AATT序列和3個選擇性堿基組成，借用徐鮮均［26］的引物設計，交由上海Invitrogen公司合成了上下游向引物各15條，見表2。

表2 SRAP標記所用的上下游引物

1.2.3 SRAP反應體系及擴增程序 主要參考Li等［12］SRAP技術體系，并綜合王呈丹等［27］、崔竣杰等［28］技術體系進行PCR擴增。SRAP-PCR反應總體積20 μL，包括：10×Buffer（Mg2+plus）2.0 μL，DNA模板（20 ng/μL）2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/μL）2.0 μL，正反引物（10 pmol/L）各0.6 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.3 μL，ddH2O 12.5 μL。擴增程序為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃1 min，共5個循環(huán)；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃1 min，共35 個循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。采用2%的瓊脂糖凝膠（加入GoldviewTM使終濃度為0.5 μg/mL）凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 對SRAP試驗結果進行記錄，采用人工讀帶的方法根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的電泳結果，在凝膠的某個相同遷移率位置上有DNA條帶的記為“1”，無DNA條帶記為“0”，獲得每個引物的Excel 0-1矩陣。擴增片段大小參照DNA ladder估測，擴增片段編號由引物編號加片段大小組成［29］。應用NTSYS-pc2.10軟件處理并采用非加權類平均法（UPGMA）進行聚類分析，得到遺傳相似系數(shù)，并根據(jù)遺傳相似系數(shù)建立聚類圖［30-32］。

1.2.5 28份海南旱稻種質指紋圖譜構建與置信概率分析 參考吳渝生等［33］研究進行海南旱稻地方品種指紋圖譜構建與置信概率分析。其中指紋圖譜出現(xiàn)的概率公式P=1/2n（2為等位基因的數(shù)目，n為多態(tài)位點數(shù)，2n則為檢n個位點涉及的所有可能的試驗材料個數(shù)），統(tǒng)計圖譜的置信概率。

1.2.6 28份海南旱稻種質SRAP標記分子身份證構建 綜合參考鄭海燕等［34］、王曉飛等［35］研究方法并加以改進，以此構建供試材料的分子身份證。

2 結果

2.1 SRAP多態(tài)性引物組合的篩選

以4份旱稻種質基因組DNA為模板（巴西陸稻、云陸8號為對照，S08、S10為供試種質代表），利用上下游引物各15條隨機搭配，共組成225對引物組合進行篩選，以能擴增出較多清晰條帶為標準（圖1），最終篩選出多態(tài)性豐富的引物組合46對（表3）。

圖1 Me3+Em1-Em8引物組合篩選電泳圖

表3 篩選出的46對SRAP多態(tài)性引物組

2.2 28 份海南旱稻種質SRAP擴增

從篩選出的46對引物組合中，挑選出多態(tài)性豐富、條帶清晰分明的18對優(yōu)質引物組合對28份供試材料進行擴增，并構建SRAP指紋圖譜（圖2），巴西陸稻僅作為群外對照。結果（表4）表明，18對引物組合共擴增出180條帶，平均每對引物組合擴增10條。多態(tài)性條帶共160條，平均每對引物組合多態(tài)性條帶8.9條。引物組合產(chǎn)生的多態(tài)性條帶比例為50.00%-100%，平均為87.75%。

圖2 Me3+Em7引物組合構建的28份海南旱稻種質SRAP指紋圖譜

2.3 海南旱稻種質聚類分析

為了便于分析海南旱稻地方品種之間的親緣關系，利用所得到的180個條帶對24份海南旱稻地方品種（23份為海南山欄稻，1份為海南地方旱稻坡壓），4份本研究組自育的熱大系列旱稻共28份海南旱稻種質材料，以及1份巴西陸稻作為群外對照，進行聚類分析并構建親緣關系樹狀圖（圖3）。結果表明，遺傳相似系數(shù)范圍為0.687 0-0.921 2，平均0.837 1，變幅0.234 2。且在遺傳相似系數(shù)為0.687 0處明顯分為Ⅰ、Ⅱ兩大類群，其中第Ⅰ類群包括：S01、S02、S03、S04、S05、S06、S07、S08、S08長、S08短、S09、S10、S11、S12、S13、S14、S16、S23、S24、S25、S26、S27、S28等共23份種質且全部為山欄稻種質，第Ⅱ類群包括：坡壓、熱大1號、熱大2號、熱大7號、2000GI09及巴西陸稻共6份種質。

2.4 28 份海南旱稻種質指紋圖譜構建與置信概率分析

對篩選出的18對引物多次重復進行PCR擴增，通過電泳圖譜選取多態(tài)性最好且穩(wěn)定的5對核心引物，其編號分別為：Me3-Em7（圖2）、Me4-Em6

（圖4）、Me4-Em14、Me5-Em7、Me14-Em15。根據(jù)最小差異原則兼顧鑒別品種指紋圖譜的置信概率，選用此5對核心引物組合，可將供試的24份海南旱稻地方品種（23份為海南山欄稻，1份為海南地方旱稻坡壓），4份本研究組自育的熱大系列旱稻全部區(qū)分開來，將代表等位基因位點有無的1和0按順序組成數(shù)字指紋（表5）。這5對核心引物組合的多態(tài)性位點數(shù)為57，根據(jù)概率公式1/2n可知，在224≈1.441×1017份海南地方旱稻品種中才有可能存在2個品種的電泳圖譜完全相同，置信概率達到99.99%，該指紋圖譜可準確檢測其中任何一個品種。

表4 28份海南旱稻種質的SRAP引物組合擴增結果

圖3 基于SRAP分析的海南旱稻種質的聚類圖

2.5 28 份海南旱稻種質SRAP標記分子身份證構建

本研究共從255對引物中反復篩選出以上5對核心引物，其穩(wěn)定性良好，多態(tài)性豐富，具有一定的說服力。以這5對SRAP核心引物的指紋組合，用相同遷移位置上條帶的有無來構建28份海南旱稻種質的黑白格指紋圖譜（圖5），就可以鑒別供試的地方旱稻品種。有的材料只要利用1對SRAP引物就可以鑒別出來，而有的品種則需要利用這5對核心引物的相互組合才能區(qū)分。

將28份供試材料的數(shù)字指紋圖譜二進制數(shù)據(jù)，分別從上至下輸入并計算轉化成十進制的數(shù)據(jù)，例如1號品種S01的二進制的數(shù)值為：00000100100 00000110111001010000100100001000101010011001 10轉換為十進制數(shù)值為：2535169982605926xx，共計18 位（不足18位用x補位）。這些十進制的數(shù)字串連起來就構成了28份材料的分子身份證（表6）。比較兩種數(shù)字形式可以看出，數(shù)據(jù)轉化后，數(shù)據(jù)位數(shù)由57 變?yōu)?8，約減少了2/3，兩種數(shù)字所表達的信息是相同的，因此用十進制數(shù)字表示更為直觀，并且18位字符也與中國公民身份證位數(shù)吻合，更有利于種質資源數(shù)據(jù)庫的建立。

3 討論

3.1 28 份海南旱稻種質的SRAP標記遺傳多樣性分析

圖4 Me4+Em6引物組合構建的海南旱稻種質SRAP指紋圖譜

表5 28份海南旱稻種質的DNA數(shù)字指紋圖譜

關于海南旱稻地方品種的遺傳多樣性研究，陳良斌等［9］曾利用20對SSR標記引物，對參試的5份稻種進行擴增共檢測到180個等位基因座位，最大遺傳距離為0.356，最小遺傳距離為0.133，平均遺傳距離為0.246，其中供試的山欄稻種質總體平均遺傳距離為0.246；曾莉娟等［10］利用10個RAPD標記引物對32份稻種進行擴增，共獲得99條清晰可辨的條帶，其中93條為多態(tài)性條帶，占總擴增片段的93.9%，遺傳距離在 0.11-0.75之間，平均為0.35；王英等［11］用22條RAPD標記引物對參試的49份旱稻種質（其中包含本研究所用的全部種質）擴增，共獲得375個條帶，多態(tài)性條帶為306條，多態(tài)性為81.60%，其遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.546-0.952，平均為0.828。本研究表明供試的28份海南省地方旱稻種質材料經(jīng)18對SRAP引物組合

擴增共獲得180條帶，平均每對引物組合10條。多態(tài)性條帶共160條，平均每對引物組合8.9條，多態(tài)性條帶比例為50.00%-100%，平均87.75%。該數(shù)據(jù)與陳良斌等的結果有較大差異，主要原因可能為供試材料、試驗環(huán)境及分子標記方法有所不同；由于供試材料完全相同且試驗環(huán)境相近，而我們的數(shù)據(jù)與王英等所得結果較為接近，微小差異是因為所采用分子標記方法不同造成的。SRAP標記針對ORFs進行擴增，因而對于基因相對少的著絲粒以及端粒附近的位點較少，如果結合這些區(qū)域的SSR標記，將可獲得覆蓋整個基因組的連鎖圖［36］。

表6 28份海南旱稻種質的SRAP分子標記身份證

3.2 28 份海南旱稻種質的聚類分析

參照王英等［11］的報道可知，其遺傳相似系數(shù)范圍為0.607 9-0.952 3，平均為0.828，變幅為0.344 4，在相似系數(shù)0.607 9處，可將49份旱稻種質分為兩大類，其中S10與巴西陸稻聚為一類；在相似系數(shù)0.830 3處，所有的山欄稻種質（除S10外）聚為一類；在相似系數(shù)0.797 3處，熱大系列旱稻與坡壓旱稻等7個種質聚為一類。本研究結果表明，供試種質間的遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.687 0-0.921 2，平均0.837 1，變幅0. 234 2。在遺傳相似系數(shù)為0.687 0處分為Ⅰ、Ⅱ兩大類群，其中第Ⅰ類群全部為山欄稻種質，其中第Ⅱ類包括4份本研究組自育的熱大系列旱稻，海南地方旱稻坡壓和巴西陸稻，與王英的研究結果吻合。鄭成木等［37，38］對山欄稻田間形態(tài)和生理特性的調查，戚經(jīng)文根據(jù)對稻作種質生物學性狀的觀察結果，初步將山欄稻主要劃歸為偏粳型、粳型旱稻，坡壓劃歸為秈稻類型，巴西陸稻為秈型常規(guī)旱稻［3］，并經(jīng)查證本校自育品種由S09、S12、S14等地方旱稻種質品種與秈型水稻雜交而成［5］。本研究通過SRAP標記分析所得的聚類結果與前人所進行的稻種類型分類結果相符，進一步從分子水平證明了以上觀點。由此可推斷出海南山欄稻種質在遺傳相似性上相近，極有可能表現(xiàn)出相同的生理生態(tài)特征；S27和S28在遺傳相似系數(shù)最大值0.9212處仍未分離，為近緣品系，田間形態(tài)可能相似；海南地方旱稻坡壓為秈型旱稻，與秈型水稻種質具有一定的遺傳相似性，可能表現(xiàn)出相同的生理生態(tài)特性，有待于進一步探究。

3.3 海南旱稻地方品種的分子身份證構建

本研究從篩選出的18對SRAP引物中遴選多態(tài)性好的5對核心引物，建立了28份海南省旱稻地方品種資源特異的分子身份證，以在相同遷移位置上條帶的有無構建了28份海南旱稻種質材料的DNA指紋圖譜，并將條帶的有或無轉化成1或0，構成了一組57位的二進制數(shù)據(jù)，將每份材料的二進制數(shù)據(jù)轉換為十進制數(shù)據(jù)，構成了每份材料的分子身份證。在轉換后的數(shù)據(jù)中沒有重復數(shù)據(jù)出現(xiàn)，也說明了利用該方法建立海南旱稻地方品種分子身份證的有效性。初步建立了海南旱稻地方品種SRAP標記分子身份證體系，為海南旱稻地方品種資源的分子身份證數(shù)據(jù)庫的構建打下了基礎。在棉花［39］、亞

麻［40］研究中已經(jīng)構建了數(shù)字形式的指紋圖譜，而在海南旱稻地方品種方面尚屬首次。然而，在海南旱稻地方品種分子身份證構建方面，尚有待選用更多數(shù)量的引物和品種進行分析，并利用RAPD、SSR及ISSR 等分子標記手段來完善種質資源的分子身份證體系，同時，可以把不同引物組合后進行PCR擴增和檢測，提高鑒定的效率。電泳條帶密集不容易分辨的引物組合可以采用分辨率高的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測［34］，最終構建出簡明有效的海南旱稻地方品種分子身份證體系，從而快速、準確地鑒定和區(qū)分供試材料是否為海南旱稻地方品種，為稻作選育種研究提供一定的科學保證。

圖5 SRAP標記構建28份海南旱稻種質的指紋圖譜

4 結論

本研究采用SRAP分子標記技術對28份旱稻種質的遺傳基礎進行了分析。以巴西陸稻、S08、S10、云陸8號4份種質基因組DNA為模板，從255對SRAP引物組合中篩選出了46對多態(tài)性較強的引物，構建了28份旱稻種質的SRAP指紋圖譜，共擴增出180個條帶，多態(tài)性條帶為160條，其多態(tài)性為87.75%，并依據(jù)指紋圖譜構建了28份海南省旱稻種質的SRAP標記分子身份證。參試旱稻種質的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.687 0-0.921 2，平均為0.837 1。利用UPGMA方法進行聚類分析結果表明，供試旱稻種質分為兩大類，第I類群全部為海南山欄稻種質，第Ⅱ類群為海南地方旱稻坡壓，本研究組自育旱稻品種和巴西陸稻，推斷出山欄稻種質間親緣關系相近，S27和S28為近緣品系，海南地方旱稻坡壓與秈型水稻種質具有一定的遺傳相似性。

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（責任編輯 李楠）

Analysis on Genetic Diversity of Hainan Upland Rice Local Varietiesand Establishment of Molecular ID with SRAP Markers

Yao Yufei1Wang Ying1，2Zhuang Nansheng1，2Gao Heqiong1
（1. Agriculture College of Hainan University，Haikou 570228；2. Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Grop Germplasm Resources（Hainan University），Ministry of Education，Haikou 570228）

SRAP markers were used to analyze the genetic relationships of 28 upland rice local varieties from Hainan province. Fortysix primer combinations with abundant polymorphism were selected from 255 primer combinations, and 18 primer combinations were picked to amplify the 28 material. A total of 180 bands were scored, and 160（87.75%）out of them were polymorphic, with an average of 10 bands and 8.9 polymorphic bands for each primer combination. Cluster analysis using UPMGA method showed that the genetic similarity coefficient ranged from 0.687 0 to 0.921 2 among the test upland rice varieties. The tested materials were classified into two clusters at the similarity coefficient of 0.687 0, and cluster I included Hainan shanlan upland rice；the cluster Ⅱ involved upland rice poya and varieties developed by our team. The clustering result of Hainan upland rice varieties showed close genetic relationship among Shanlan upland rice varieties. The Hainan upland rice poya might has some genetic similarities with nonglutinous rice germplasms. In addition, we established the molecular identity card of 28 Hainan upland rice varieties with SRAP markers. All these results provided the basis for the Shanlan upland rice heredity relationship and the Shanlan upland rice germplasm resources’ appraisal and the new variety’s breeding.

Upland rice Shanlan upland rice SRAP markers Genetic diversity Molecular identity card

2014-03-27

海南省自然科學基金項目（808114），海南大學2009科研項目（hd09xm54）

姚宇飛，男，研究方向：作物遺傳育種；E-mail：yao_254897312@qq.com

王英，女，博士，副教授,碩士研究生導師，研究方向：作物遺傳育種；E-mail：biotechwangying@163.com