哺乳動(dòng)物中RNA干擾沉默基因表達(dá)的研究進(jìn)展

曹騰威谷凌云黃和，3高振酈明芳

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 211816；2.東南大學(xué)附屬江陰醫(yī)院，江陰 214400；3.材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；4.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京 210029）

哺乳動(dòng)物中RNA干擾沉默基因表達(dá)的研究進(jìn)展

曹騰威1谷凌云2黃和1，3高振1酈明芳4

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 211816；2.東南大學(xué)附屬江陰醫(yī)院，江陰 214400；3.材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；4.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京 210029）

RNA干擾及相關(guān)基因沉默導(dǎo)致的代謝通路變化已經(jīng)徹底改變了人們對(duì)基因調(diào)控的理解?；虺聊夹g(shù)已經(jīng)被用來(lái)作為一種研究工具來(lái)控制某些細(xì)胞基因的表達(dá)，特異的siRNA導(dǎo)入不同的細(xì)胞需要不同的轉(zhuǎn)染載體才能達(dá)到最大的轉(zhuǎn)染效率，并且不會(huì)產(chǎn)生較大的細(xì)胞毒性。近年來(lái)尤其是碳納米管等新型納米材料載體的應(yīng)用拓展了人們對(duì)傳統(tǒng)脂質(zhì)體和病毒載體的認(rèn)識(shí)。首先介紹RNA干擾技術(shù)及其發(fā)展歷程，隨后對(duì)利用幾種不同的載體來(lái)設(shè)計(jì)和進(jìn)行RNA干擾試驗(yàn)進(jìn)行了比較，最后對(duì)最初的脂質(zhì)體到生物病毒再到高分子納米材料介導(dǎo)的RNA干擾在疾病的治療和臨床診斷進(jìn)行了展望。

RNA干擾 小干擾RNA 基因沉默 轉(zhuǎn)染 碳納米管

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，越來(lái)越多生物的全基因組被測(cè)序，人們對(duì)功能基因組學(xué)的研究越來(lái)越深入。研究思路通常從兩個(gè)方面展開，一是增強(qiáng)某種基因表達(dá)，研究過(guò)表達(dá)后引起的一系列機(jī)理；二是減弱或者終止其表達(dá)，進(jìn)而推測(cè)該基因相應(yīng)的生理功能?；诤笳哚槍?duì)性很強(qiáng)的特點(diǎn)，逐漸發(fā)展成一種新技術(shù)——基因沉默（Gene silencing）。

從低等原核生物到高等真核生物，基因沉默技術(shù)的廣泛應(yīng)用推動(dòng)了基因組學(xué)研究的革命化進(jìn)程。在微生物代謝工程中，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量、純度以及誘導(dǎo)出新的有價(jià)值產(chǎn)物都是人們亟待解決的問(wèn)題，特定基因的敲除技術(shù)的應(yīng)用給人們帶來(lái)了解決問(wèn)題的希望。人們通過(guò)不斷改造工程菌株，改變其代謝途徑，阻斷其代謝旁路，使其利于向目標(biāo)產(chǎn)物

積累的方向進(jìn)行，以獲得的大量的代謝產(chǎn)物。因此可以利用轉(zhuǎn)座子突變系統(tǒng)、同源重組系統(tǒng)或者自殺載體［1］進(jìn)行基因位點(diǎn)的定向敲除。在真核生物中，RNA干擾（RNA interference）作為基因沉默的另一種途徑操縱著許多細(xì)胞功能。尤其在哺乳動(dòng)物中它能夠調(diào)控基因的表達(dá)，分析信號(hào)傳導(dǎo)基因間相互作用，阻斷病變基因信號(hào)通路。本研究就通過(guò)多種方法進(jìn)行RNA干擾細(xì)胞引起基因沉默展開綜述，并且重點(diǎn)闡述了新型高分子材料可以作為一種高效載體攜帶小核酸分子進(jìn)入細(xì)胞，為RNA干擾的研究提供了新的研究思路。

1 RNA干擾

1995年，Guo和Kemphues［2］在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans中發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象。直到1998年，F(xiàn)ire和Mello等［3］通過(guò)注射與秀麗隱桿線蟲機(jī)體同源基因（靶基因）的雙鏈RNA，阻斷了靶基因的表達(dá)，并將其命名為RNA干擾。隨后關(guān)于RNA干擾現(xiàn)象的研究表明，在植物、果蠅、錐蟲、渦蟲等許多生物中都存在此種現(xiàn)象。1999年，Tuschl等［4］報(bào)道了在哺乳動(dòng)物中也存在RNA干擾現(xiàn)象。2001年，Ketting等［5］研究人員提出，只有22個(gè)核苷酸的siRNA才能特異性的阻斷dsRNA（double-strand RNA）并在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)將dsRNA分解為siRNA的酶（DICER）。

RNA干擾技術(shù)已經(jīng)成功的從植物研究發(fā)展到哺乳動(dòng)物的相關(guān)研究，并且逐步被應(yīng)用到醫(yī)學(xué)上一些頑疾的治療研究。Lee等［6］用siRNA抑制艾滋病病毒HIV的一些基因，如p24、vif、nef抑制和HIV特異結(jié)合的細(xì)胞表面受體CD4和CD8a或輔助受體CXCR4/CCR5或病毒結(jié)構(gòu)Gag蛋白的表達(dá)，阻礙HIV感染細(xì)胞。Weber等［7］利用聚乙亞胺和聚乙二醇融合后可提高siRNA的穩(wěn)定性和減少其毒性，證明其可作為藥物作用淋巴細(xì)胞，并最終測(cè)定該共聚物的生物學(xué)效果：靶向干擾了HIV的nef。

對(duì)于RNA干擾的作用機(jī)制目前認(rèn)為有兩種：一種是存在于線蟲、真菌和植物中依賴RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRP）的干擾途徑；另一種是存在于果蠅和哺乳動(dòng)物中不依賴RdRP的干擾途徑［8］。RNA干擾具有4個(gè)分子生物學(xué)特征：典型的轉(zhuǎn)錄后基因沉默；高效沉默目的基因表達(dá)；高度序列特異性；dsRNA具有擴(kuò)散性。只要在生物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生dsRNA，就可以對(duì)特定的基因?qū)嵤┺D(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的沉默。生化和遺傳研究表明，RNA干擾包括起始階段、效應(yīng)階段和擴(kuò)增階段。在起始階段，小分子RNA被Dicer酶切割成21-23 bp長(zhǎng)的siRNA。研究表明，該Dicer酶是RNase III家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員，它能以一種依賴ATP的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，將RNA降解為19-21 bp的雙鏈RNA。在效應(yīng)階段，siRNA和一個(gè)核蛋白粒子（RNPs）結(jié)合，分別形成siRNA核蛋白復(fù)合物和miRNA核蛋白復(fù)合物，然后重排為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。激活RISC是一個(gè)依賴ATP siRNA解鏈的過(guò)程。RISC中的siRNA引導(dǎo)沉默復(fù)合物識(shí)別同源靶mRNA，然后RNA解旋酶使靶向mRNA與siRNA正義鏈換位，在ATP的參與下，RNase在距離siRNA 3'端12個(gè)堿基的位置切割mRNA，并使其降解，從而達(dá)到轉(zhuǎn)錄后基因沉默的結(jié)果。在擴(kuò)增階段，由于線蟲、真菌和植物以及果蠅和哺乳動(dòng)物各自的RdRP的干擾途徑不同，在大部分真菌、線蟲和植物中主要以siRNA為引物，目的mRNA為模板合成大量的dsRNA，后者又可作為RISC的底物而被降解形成新的siRNA，新siRNA又可以進(jìn)入上述循環(huán)，使信號(hào)放大（圖1）［9］。

2 siRNA的設(shè)計(jì)與制備

siRNA的結(jié)構(gòu)和功能之間存在相關(guān)性。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，RNA干擾是以21-23 nt的siRNA為媒介的，這種siRNA具有5'末端的磷酸基，3'末端的羥基和2個(gè)突出的單鏈核苷酸［10，11］。這種特殊的3'端有突出的非配對(duì)堿基結(jié)構(gòu)有利于提高siRNA的穩(wěn)定性，使其在細(xì)胞內(nèi)可穩(wěn)定存在3-4 d［12］。有許多方法可以提高制備高效siRNA的可能性，其中關(guān)鍵的方法就是靶基因的位點(diǎn)的選取。在基因庫(kù)中尋找靶向基因的mRNA序列，并從開放閱讀框ORF起始密碼AUG后的第100-200 nt開始尋找AA（N19）UU序列，其中N19為任意19 nt的mRNA核苷酸序列，然后設(shè)置選定序列中的G+C比例為30%-60%，

對(duì)確定的序列用NCBI的Blast（www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST）搜索。搜索結(jié)果中和其他基因有16個(gè)以上堿基同源序列的要被篩除，以確定所作用靶基因是唯一的［13］。這樣得到的siRNA特異性很高，能特異結(jié)合目的mRNA，誘使轉(zhuǎn)錄后基因沉默。

圖1 RNA干擾機(jī)理模式圖［9］

以往傳統(tǒng)的siRNA設(shè)計(jì)原則包括：序列中G+C所占比例；siRNA雙螺旋與靶基因的熱力學(xué)參數(shù)等。隨著研究的深入，siRNA設(shè)計(jì)原則逐漸規(guī)范化。Ui-Tei等［14］提出4個(gè)設(shè)計(jì)高效siRNA指標(biāo)：反義鏈的5'末端是A/U；正義鏈的5'末端是G/C；反義鏈5'末端的1/3富含AU；不含GC序列長(zhǎng)度超過(guò)9個(gè)bp。最近El-Lakkani等［15］研究如何從哺乳動(dòng)物基因篩選出高效的siRNA位點(diǎn)。他們把3 734個(gè)siRNA按照高、中、低效率分成3組，運(yùn)用在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析設(shè)計(jì)出更高效率的siRNA方法。堿基的位置和熱力學(xué)穩(wěn)定性關(guān)系到高效率siRNA的設(shè)計(jì)過(guò)程，El-Lakkani通過(guò)13種設(shè)計(jì)原則（A/U和C/G位置、ΔG）發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)出高效率siRNA最關(guān)鍵是反義鏈5'和3'末端結(jié)合能的大小。由于siRNA設(shè)計(jì)方法的逐步完善，生物學(xué)家們已經(jīng)開發(fā)出許多針對(duì)性的算法和在線軟件。其中siDirect（http：//design. RNAi.jp/）就是一款設(shè)計(jì)最大靶向特異性siRNA的在線軟件，它利用BLAST篩除掉交叉雜合子來(lái)避免產(chǎn)生有脫靶效應(yīng)的siRNA。然而與其他在線設(shè)計(jì)軟件一樣（siRNA target finder， siDEDIGN center）siDirect也不能避免BLAST搜索的局限性，所以更精確軟件有待開發(fā)來(lái)確保靶向干擾的高效特異性［16］。2013年，Boudreau等［17］介紹了一個(gè)新的siRNA設(shè)計(jì)工具siSPOTR。利用公認(rèn)的siRNA數(shù)據(jù)完成超過(guò)50個(gè)微陣列芯片試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上建立了預(yù)測(cè)潛在脫靶效應(yīng)的生物信息學(xué)方法，并基于此種方法開發(fā)出具有特異的siRNA設(shè)計(jì)算法和在線軟件。脫靶效應(yīng)（假陽(yáng)性率和毒性反應(yīng)）是基因沉默技術(shù)的一大難題，尤其在RNA干擾基因治療中。與其他的設(shè)計(jì)軟件不同，siSPOTR可以生成很多的低脫靶概率的序列，提供了更寬的平臺(tái)來(lái)讓用戶篩選。與其他的軟件相比，Boudreau等證明了這種方法設(shè)計(jì)的序列能降低脫靶概率5%-10%。

3 siRNA的傳遞載體

siRNA是RNA干擾作用細(xì)胞的最終形式與載體，所以各種方法的最終目的就是獲得高效特異的siRNA，并且成功使其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，使靶基因沉默。目前可通過(guò)5種方法獲得siRNA：化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、RNA酶類物質(zhì)（RNaseⅢ和Dicer）降解dsRNA、siRNA表達(dá)載體或者病毒載體、siRNA表達(dá)框架。前3種是通過(guò)體外制備然后再導(dǎo)入到靶細(xì)胞中，后2種是基于具有合適啟動(dòng)子的載體或轉(zhuǎn)錄元件在哺乳動(dòng)物或細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄生成siRNA。獲得特異性的目標(biāo)siRNA后，無(wú)論通過(guò)哪種傳遞載體，最終的目的是使siRNA作用于靶基因。由于轉(zhuǎn)染效率與轉(zhuǎn)染試劑、細(xì)胞種類、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、轉(zhuǎn)染方法及siRNA濃度等條件密切相關(guān)［18］。所以把siRNA高效地導(dǎo)入受體細(xì)胞是RNA干擾作用的瓶頸步驟。另外RNA作為生物大分子一般不容易透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，尤其是一些非分化細(xì)胞、原代細(xì)胞和干細(xì)胞，所以尋找一種合適的轉(zhuǎn)染方式極為關(guān)鍵。

谷凌云等［19］的研究是從細(xì)胞水平上特異沉默靶基因后探究心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)與房顫的關(guān)系。以新生原代大鼠心房肌細(xì)胞為模型，對(duì)于原代這類難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有文獻(xiàn)報(bào)道用化學(xué)合成的方法獲得siRNA，并和轉(zhuǎn)染試劑TransIT-TKO以及Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基共孵育轉(zhuǎn)染原代心房肌細(xì)胞，siRNA轉(zhuǎn)染濃度隨著細(xì)胞密度大小從50 nmol/L升高到250 nmol/L不等。我們采用100 nmol/L的siRNA并按照?qǐng)D2的流

在給排水工程施工過(guò)程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)各種不同類型的問(wèn)題，這會(huì)對(duì)給排水工程的質(zhì)量造成不良影響，進(jìn)而都會(huì)其應(yīng)用性能產(chǎn)生影響，可見(jiàn)，在給排水工程施工中，做好像施工管理意義重大。

程成功達(dá)到了較高的轉(zhuǎn)染效率［20］。

圖2 用化學(xué)合成siRNA進(jìn)行的典型RNAi試驗(yàn)示意圖［20］

3.1 脂質(zhì)體和病毒

由于siRNA相對(duì)分子質(zhì)量較大（14 000以上）和帶有較高的負(fù)電荷，不能自發(fā)穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)［21］。脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。例如，一個(gè)約5 kb的質(zhì)粒可以結(jié)合2-4個(gè)脂質(zhì)體，被俘獲的DNA就會(huì)隨著質(zhì)粒載體導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞。

文獻(xiàn)報(bào)道陽(yáng)離子脂質(zhì)體有Invitrogen公司的Lipfectamine 2000，Oligofectamine和 Lipofectamine RNAiMAX［22］。比較了這3種陽(yáng)離子脂質(zhì)體在間充質(zhì)干細(xì)胞和新生干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Oct4的siRNA時(shí)的效率。結(jié)果顯示，Lipofectamine RNAiMAX是一種將siRNA傳遞到人胚胎干細(xì)胞中完美的轉(zhuǎn)染試劑，并且它較低的細(xì)胞毒性不會(huì)影響到干細(xì)胞的全能性。李杰等［23］應(yīng)用脂質(zhì)體siPORT NeoFX介導(dǎo)從5-30 nmol/L，4個(gè)梯度濃度的CY-Negative siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞凋亡率，測(cè)得siRNA在30 nmol/L時(shí)平均轉(zhuǎn)染率達(dá)76.67%，故siPORT NeoFX轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞在siRNA濃度30 nmol/L時(shí)達(dá)到最佳效果。同樣，王玉潔等［24］也應(yīng)用Lipofectamine RNAiMAX，Lipofectamine 2000和DharmaFECT1轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染原代肝癌細(xì)胞篩選最佳的轉(zhuǎn)染試劑，DharmaFECT1為Thermo Scientific公司的一種全新的轉(zhuǎn)染試劑。通過(guò)Realtime PCR檢測(cè)出RNAiMAX轉(zhuǎn)染效率最高，并用細(xì)胞增殖（MTT法）檢測(cè)結(jié)果表明RNAiMAX對(duì)原代肝癌細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性（表1）。

表1 不同的靶細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑間比較

雖然對(duì)于大部分真核細(xì)胞，脂質(zhì)體介導(dǎo)的siRNA的轉(zhuǎn)染優(yōu)點(diǎn)很多，但轉(zhuǎn)染多以瞬間表達(dá)為主，最長(zhǎng)也不過(guò)幾天。并且在某些種類的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率很低，即使在同種細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染率也大不相同。然而病毒可以攜帶一些大的片段DNA。如腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)［27］AdEasy system載體可以容納7.5 kb外源DNA。所以病毒被廣泛用于轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞，干細(xì)胞和非分化細(xì)胞。

腺病毒（Adenovirus）是一種沒(méi)有包膜的線狀雙鏈DNA，它在核內(nèi)以神經(jīng)元細(xì)胞的形式復(fù)制，存在多種AV血清型。目前構(gòu)建的絕大多數(shù)是基于血清型2和5，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法取代E1或E3基因，降低病毒的復(fù)制能力。腺病毒載體能夠在增殖和非增殖細(xì)胞中高效傳遞和表達(dá)基因［28］。神經(jīng)膠質(zhì)瘤在成年人神經(jīng)系統(tǒng)中是一種最常見(jiàn)的腫瘤，多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤屬于甲等4級(jí)，一種公認(rèn)的致病原因是體內(nèi)過(guò)表達(dá)堿性成纖維生長(zhǎng)因子（Fibroblast growth factor，bFGF）。Liu等［29］用腺病毒載體攜帶bFGF siRNA（Ad-bFGF-siRNA）作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞阻斷bFGF的表達(dá)，從而抑制腫瘤增殖。慢病毒

基因異常表達(dá)是導(dǎo)致許多疾病的主要原因。RNA干擾技術(shù)的終極目標(biāo)之一就是開發(fā)新一代的藥物，使之靶向作用相關(guān)疾病的異常mRNA。目前，許多利用RNA干擾的基因治療正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。例如，抗病毒、抗腫瘤和遺傳性疾病。近來(lái)，Sakurai等［30］運(yùn)用一種對(duì)PH敏感由陽(yáng)離子脂質(zhì)YSK05構(gòu)成的脂質(zhì)體MEND（Multifunctional envelope-type nanodevice）傳遞siRNA進(jìn)入腫瘤組織中。腫瘤組織中聚乙二醇化的YSK-MEND可以將siRNA濃度從0.007 9%提高到1.9% ID/g，從而使目標(biāo)基因表達(dá)降低了50%。他們?cè)诤至鲂∈篌w內(nèi)通過(guò)瘤內(nèi)注射試驗(yàn)證實(shí)了包含YSK05的MEND比普通的商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑（Lipo2000）具有更好的基因沉默能力。此外，由于具有合適的PKa，YSK05在血液呈中性狀態(tài)，所以MEND-YSK05僅需要少量的聚乙二醇修飾就可以充分發(fā)揮效應(yīng)，并且非常適合在腫瘤組織中傳遞siRNA。

3.2 碳納米管

在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，陽(yáng)離子脂質(zhì)體、病毒一直是人們使用的最普遍的siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)載體。但是在基因治療和RNA干擾靶向藥物的應(yīng)用中仍然存在缺陷。對(duì)于原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率還是不夠高［31］。雖然病毒載體具有轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)點(diǎn)，但是過(guò)程復(fù)雜，周期比較長(zhǎng)，還可能引發(fā)細(xì)胞發(fā)生突變及免疫反應(yīng)。另外，由于siRNA在體內(nèi)穩(wěn)定性差容易被核酸酶降解、難以穿過(guò)由磷脂雙分子層構(gòu)成的細(xì)胞膜等問(wèn)題［32］。因此，一個(gè)更合理的運(yùn)載系統(tǒng)便成為人們研究的熱點(diǎn)（表2）。

表2 非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染途徑比較

在過(guò)去的二十幾年里見(jiàn)證了納米科技在基因治療領(lǐng)域的飛速發(fā)展，與此同時(shí)更多的載體被用來(lái)提高基因轉(zhuǎn)運(yùn)的效率。包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、高分子聚合物、樹突狀高分子、多肽類和碳納米管被開發(fā)作為基因治療的載體［33］。Wang等［34］闡述了石墨烯和氧化石墨烯的生物學(xué)功能以及在生物工程上的應(yīng)用。碳納米管（Carbon nanotubes，CNT）屬于碳同素異形體的富勒烯家族，是由一系列碳原子經(jīng)sp2雜化形成的同軸中空管狀結(jié)構(gòu)，碳納米管按石墨烯片的層數(shù)可分為：?jiǎn)伪谔技{米管（SWNTs）和多壁碳納米管（MWNTs）。由于其鈉針狀結(jié)構(gòu)使之更容易直接穿過(guò)質(zhì)膜就像獨(dú)立的內(nèi)吞作用一樣，并且穿膜后不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，此外，碳納米管結(jié)構(gòu)具有非常大的比表面積，使之很容易與配體結(jié)合修飾功能化?？梢栽诩t外光區(qū)監(jiān)測(cè)到碳納米管的拉曼光譜和熒光信號(hào)，因此可以利用這種特性追蹤碳納米管攜帶的藥物在體內(nèi)代謝情況。近年來(lái)，碳納米管在分子生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的研究日益增多，已經(jīng)廣泛被用于體內(nèi)外的藥物、抗原和核酸的傳遞。

Bianco等［35］首先運(yùn)用碳納米管這一新的基因傳遞載體系統(tǒng)，并用Prato反應(yīng)共價(jià)修飾碳納米管。他們還發(fā)現(xiàn)DNA-CNT復(fù)合物不會(huì)對(duì)那些被激活或未被激活的淋巴細(xì)胞表現(xiàn)出促有絲分裂和毒性，而這與其他非病毒基因載體相比有較大的不同。Kam等［36］把聚乙二醇化的磷脂分子與二硫鍵相連，磷脂分子的尾部非特異性吸附結(jié)合于碳納米管表面。當(dāng)用這種方法構(gòu)建的復(fù)合物進(jìn)入溶酶體后促使酶解從而釋放siRNA，進(jìn)而有效地干擾目的基因的表達(dá)，而且沉默效率比陽(yáng)離子脂質(zhì)體引起的沉默效率還高。Yang等［37］利用陽(yáng)離子輔助聚合納米粒子包裝siRNA，使其能進(jìn)行高效傳遞，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞中PLK1的表達(dá)，并且還能顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。Podesta等［38］通過(guò)氨基加成的方法功能化多壁碳納米管（MWNT-NH3+），使之復(fù)合siTOX siRNA

干擾癌基因的表達(dá)。他們用陽(yáng)離子脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)（DOTAP）和功能化的多壁碳納米管（f-MWNTs）建立人的肺癌移植瘤小鼠模型。試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)得到有效抑制，且小鼠存活期得到明顯延長(zhǎng)。他們也是首次在體內(nèi)試驗(yàn)中把碳納米管與陽(yáng)離子脂質(zhì)體兩種轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA載體的轉(zhuǎn)運(yùn)效率進(jìn)行對(duì)比，相比于脂質(zhì)體碳納米管攜帶siRNA更能溫和地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。Al-Jamal等［39］把攜帶caspase-3 siRNA化學(xué)功能化的碳納米管通過(guò)三維定位注射方法導(dǎo)入到大腦基因區(qū)，然后在ET-1誘導(dǎo)的中風(fēng)嚙齒動(dòng)物大腦皮質(zhì)區(qū)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)退變的緩解和功能性恢復(fù)。這是第一次利用碳納米管把siRNA導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。所以碳納米管作為siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)載體在基因治療領(lǐng)域的研究逐步被人們所認(rèn)識(shí)。

碳納米管介導(dǎo)的基因傳遞在體內(nèi)治療仍處于初始階段，目前所有的體內(nèi)試驗(yàn)報(bào)道都是關(guān)于局部瘤內(nèi)注射。此外，對(duì)環(huán)境和健康潛在的毒性已經(jīng)成為一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。系統(tǒng)地研究DNA/siRNA-CNT復(fù)合物的穩(wěn)定性、血循環(huán)和藥代動(dòng)力學(xué)，對(duì)碳納米管藥物在體內(nèi)吸收、沉積、代謝和排泄一系列路徑作一個(gè)長(zhǎng)遠(yuǎn)研究，只有解決這些問(wèn)題，才可能建立一個(gè)關(guān)于碳納米管藥物的GMP規(guī)范，使之更廣泛的運(yùn)用于臨床治療研究［40］。

4 結(jié)語(yǔ)

在過(guò)去的多年中，細(xì)胞通過(guò)沉默同源基因來(lái)應(yīng)答dsRNA這種方式揭示了一種新的生物學(xué)管理范式。隨著RNA干擾途徑的闡明，人們把RNA干擾作為生物新技術(shù)應(yīng)用到基礎(chǔ)和臨床研究。siRNA、質(zhì)粒、病毒編碼的shRNA作為一種常規(guī)化的試劑已經(jīng)被納入生物學(xué)家的“工具箱”中，用以下調(diào)目的基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。早前成功的報(bào)道在小鼠模型中體內(nèi)RNA干擾人的致病基因［43］。未來(lái)RNA干擾技術(shù)應(yīng)用將會(huì)使高通量篩選多重siRNAs成為可能。

從最初的脂質(zhì)體到生物病毒再到高分子納米材料，我們闡述了不同的RNA干擾載體的特性。尤其是碳納米管、硅納米管，不僅可以作為核酸的轉(zhuǎn)運(yùn)載體甚至可以攜帶藥物用于疾病治療，然而這些納米材料的生物相容性是亟待解決的問(wèn)題。人們通過(guò)偶聯(lián)不同的生物活性分子或功能化修飾使碳納米管微觀結(jié)構(gòu)、溶解性、穿透力及生物相容性得到很大的改善。

RNA干擾不僅推動(dòng)了后基因組時(shí)代的發(fā)展，在發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因、疾病治療和藥物篩選研發(fā)方面也起到了積極的作用。用RNA干擾制備藥物，其思路是根據(jù)病原體如病毒、細(xì)菌等的致病基因序列，以及生物體內(nèi)與疾病發(fā)生相關(guān)的基因序列，設(shè)計(jì)和制備與這些基因序列同源的雙鏈RNA。再將這些RNA轉(zhuǎn)入動(dòng)植物內(nèi)使有關(guān)的疾病基因靶向“沉默”，從而達(dá)到治療疾病的效果。目前的主要問(wèn)題是找到一種高效低毒用于人體的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，它既能攜帶靶基因siRNA，又不引起人體免疫反應(yīng)。盡管如此，人們依然可以預(yù)測(cè)與其他基因技術(shù)一樣，siRNA與RNA干擾技術(shù)將在不久的將來(lái)會(huì)在基因治療和基因應(yīng)用中發(fā)揮極大的作用，并將給整個(gè)生物理論帶來(lái)巨大而深遠(yuǎn)的影響。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress of Gene Silencing by RNA Interfering Technology in Mammal

Cao Tengwei1Gu Lingyun2Huang He1，3Gao Zhen1Li Mingfang4
（1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 211816；2. Jiangyin Hospital Affiliated to Southeast University，Jiangyin 214400；3. State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，Nanjing 210009；4. The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University，Nanjing 210029）

Variation of metabolic pathways result from RNA interference and related RNA silencing pathways have revolutionized our understanding of gene regulation. Gene silencing has been used as a research tool to control the expression of specific genes in numerous experimental organisms. Importing the different cells with specific siRNA need different transfection reagent to achieve maximum transfection efficiency, and will not produce larger cell toxicity. In recent years, new nano-material such as carbon nanotubes exert interference effect expanding us the traditional liposomes and virus’ understanding. The rapid progress in the field of RNA interference was summarized, and then compare different RNA interference experiments used several different carriers. Further, the perspectives of future research on RNA interference mediated from traditional liposomes to virus and polymer nano-material in disease treatment and clinic diagnose were proposed.

RNA interference Small interfering RNA Gene silencing Transfection Carbon nanotubes

2014-01-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81000083）

曹騰威，男，碩士研究生，研究方向：分子細(xì)胞學(xué)；E-mail：caotw6154@163.com

高振，男，博士，副研究員，研究方向：生物化學(xué)；E-mail：gaozhen@njtech.edu.cn酈明芳，女，博士，講師，研究方向：心臟電生理學(xué)；E-mail：mingflee@hotmail.com