馬奶酒樣乳桿菌ZW 3在豇豆發(fā)酵中的應(yīng)用

鄭永娜，趙勇，王菁蕊，王艷萍，*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.天津市和平區(qū)南市街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，天津300457）

馬奶酒樣乳桿菌ZW 3在豇豆發(fā)酵中的應(yīng)用

鄭永娜1，趙勇2，王菁蕊1，王艷萍1，*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.天津市和平區(qū)南市街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，天津300457）

研究了馬奶酒樣乳桿菌ZW3以不同比例與植物乳桿菌299和乳酸菌723復(fù)配用于豇豆的發(fā)酵，在接種量一定的情況下，隨著馬奶酒樣乳桿菌ZW3所占比例的增大，酸豆角的pH降低，酸度增加；以感官評(píng)分作為指標(biāo)，確定3種菌以1∶1∶1比例復(fù)配發(fā)酵時(shí)，酸豆角口味最佳。通過(guò)有機(jī)酸與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析，結(jié)果顯示以1∶1∶1比例接種發(fā)酵的酸豆角與自然發(fā)酵的酸豆角中的有機(jī)酸與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在種類與含量上基本一致。將馬奶酒樣乳桿菌ZW 3用于發(fā)酵泡菜，泡菜pH值下降快、產(chǎn)酸率高、風(fēng)味純正。

馬奶酒樣乳桿菌ZW3；酸豆角；產(chǎn)酸；風(fēng)味物質(zhì)

豇豆含豐富VB、VC和植物蛋白質(zhì)，具有多種功效，如《本草綱目》就有記載，“豇豆理中益氣，補(bǔ)腎健胃，和五臟，調(diào)營(yíng)衛(wèi)，生精髓。止消渴，吐逆，泄痢，小便數(shù)，解鼠莽毒[1]。”在我國(guó)長(zhǎng)豇豆種植分布面積廣，全國(guó)各省市區(qū)均有種植[2]。豇豆的集中產(chǎn)出就會(huì)使其大量的積壓，最終導(dǎo)致變質(zhì)，不僅給農(nóng)民造成了極大的損失，而且還造成大量的浪費(fèi)。豇豆經(jīng)乳酸菌發(fā)酵制成酸豆角可解決豇豆的閑置問(wèn)題。酸豆角作為泡菜的一種，具有悠久的歷史，其制作可以追溯到兩千多年前[3]。酸豆角的酸味濃郁、口味醇厚、營(yíng)養(yǎng)易于吸收，同時(shí)還具有開(kāi)胃理氣，降低膽固醇，控制皮膚老化及改善皮膚效果，抗癌，增強(qiáng)免疫力等功能特性[4]。

我國(guó)現(xiàn)階段酸豆角的生產(chǎn)仍然以家庭式天然發(fā)酵為主[4]，乳酸發(fā)酵緩慢，發(fā)酵周期較長(zhǎng)，酸味較弱，并且受環(huán)境因子影響也很大，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，同時(shí)亞硝酸鹽含量在很大程度上得不到有效的控制。這些不利因素很大程度上制約著酸豆角的工業(yè)化生產(chǎn)。純?nèi)樗峋臃N已成為近些年發(fā)酵研究的重點(diǎn)，它在克服自然發(fā)酵不足的同時(shí)，也推動(dòng)著泡菜的工業(yè)化發(fā)展[3]。所以，針對(duì)酸豆角工業(yè)化生產(chǎn)現(xiàn)狀，篩選出產(chǎn)酸能力強(qiáng)，發(fā)酵特性優(yōu)良的菌種極為重要。

本實(shí)驗(yàn)將新分離出的菌種——馬奶酒樣乳桿菌ZW3[5]用于酸豆角發(fā)酵，研究了其與其它乳酸菌混合發(fā)酵過(guò)程中，不同比例接種馬奶酒樣乳桿菌ZW 3對(duì)產(chǎn)酸的影響，以及含馬奶酒樣乳桿菌ZW3的發(fā)酵與自然發(fā)酵相比，有機(jī)酸，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，感官上的差異，為酸豆角工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮豇豆、白砂糖、食鹽等均購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

菌種：植物乳桿菌299（Lactobacillus plantaruM299）、乳酸菌723（Lactic acid bacteria 723）、馬奶酒樣乳桿菌ZW3（Lactobacillus kefiranofaciens ZW3），保藏于天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要儀器與試劑

泡菜壇：天津市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；HFsafe900型超凈工作臺(tái)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；全自動(dòng)高壓滅菌鍋：日本Yamato公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海-恒科技有限公司；DY-2厭氧培養(yǎng)箱：浙江冷凍機(jī)總廠；DELTA-320 pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多公司；L710A型高效液相色譜儀：日本島津公司；GC-MS-4000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)VARIAN公司。

MRS液體培養(yǎng)基[6]；改良MRS液體培養(yǎng)基：酵母粉45.0 g，葡糖糖16.0 g，乳糖4.0 g，NaCl0.15 g，K2HPO40.5 g，半胱氨酸鹽酸鹽1.4 g，乙酸鈉15.0 g，Tween-80 1 g，MnSO40.2 g，蒸餾水定容至1 L，pH 6.2，115℃高壓滅菌20min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 泡菜的制作工藝

1.3.2 添加不同比例馬奶酒樣乳桿菌ZW3發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

分別選取馬奶酒樣乳桿菌ZW3、植物乳桿菌299、乳酸菌723的比例為2∶1∶1、1∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2、0∶1∶1，即馬奶酒樣乳桿菌ZW3占發(fā)酵劑的比例分別1/2、1/3、1/ 4、1/4、0，按上述工藝進(jìn)行發(fā)酵，同時(shí)以自然發(fā)酵作為對(duì)照。測(cè)定發(fā)酵酸豆角的pH、總酸，并對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)分。每組試驗(yàn)3組平行，試驗(yàn)結(jié)果為3組平行的平均值。

1.3.3 加入馬奶酒樣乳桿菌ZW 3的酸豆角與自然發(fā)酵酸豆角風(fēng)味物質(zhì)對(duì)比分析試驗(yàn)

根據(jù)1.3.2的試驗(yàn)結(jié)果，選取最佳菌種比實(shí)驗(yàn)組，對(duì)此實(shí)驗(yàn)組與達(dá)到相同酸度的自然發(fā)酵組的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.4.1 pH及總酸的測(cè)定

使用pH計(jì)測(cè)定酸豆角發(fā)酵液的pH值；總酸的測(cè)定根據(jù)GB/T12356-2008中的規(guī)定，采用滴定法，以乳酸計(jì)。

1.3.4.2 感官評(píng)分

感官評(píng)分主要從樣品的色澤、香氣、質(zhì)地與味道進(jìn)行評(píng)分，感官指標(biāo)要求及感官評(píng)分權(quán)重如表1所示。

表1 感官指標(biāo)要求及感官評(píng)分權(quán)重[7]Table1 Indicators requirementsand evaluation criteria of the sensory

1.3.4 有機(jī)酸分析[8]

有機(jī)酸采用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行測(cè)定與分析。

A．樣品的預(yù)處理

酸豆角汁加入0.1%（w/v）的磷酸中，4℃條件下9 000 rpm離心10min，取上清過(guò)0.45μm濾膜，備用。

B．色譜條件

液相色譜儀：島津L710A，色譜柱：VenusilMPC18（5μm，250×4.6mm），柱溫25℃，使用0.1%（w/v）的磷酸作為流動(dòng)相，流速為1.0mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10μL。

C．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品草酸、甲酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、丙酸，溶解于0.1%（w/v）的磷酸溶液中。分別以不同濃度進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定不同標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間及其不同濃度對(duì)應(yīng)的峰面積，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將預(yù)處理后的樣品分別進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中有機(jī)酸的含量。

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

使用固相微萃?。⊿PME）聯(lián)合氣相色譜/質(zhì)譜（GC-MS）測(cè)定酸豆角中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

A.固相微萃?。⊿PME）樣品制備

取酸豆角發(fā)酵液2mL，放入5mL的萃取瓶中，擰緊瓶蓋。將手動(dòng)固相微萃取器的萃取頭插入到樣品瓶蓋中，推出纖維頭，60℃吸附30min。隨后抽回纖維頭，拔出萃取頭，再將萃取頭插入氣相色譜儀推出纖維頭，在進(jìn)樣口解吸附15min，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。

B.分析條件

氣相色譜條件：色譜柱為VF-5MS30m×0.25mm× 0.25μm彈性毛細(xì)管柱；載氣He氣；載氣流量1mL/ min；進(jìn)樣口溫度250℃；分流比5：1；升溫程序?yàn)?0℃保持3min，5℃/min線性升溫至150℃，10℃/min線性升溫至250℃，然后于250℃保持5min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI源，離子阱溫度220℃，傳輸線溫度280℃；掃描范圍50 amu～1 000 amu；電離電壓為70 eV；溶劑延遲4min；譜庫(kù)NIST 05。

（5）亞硝酸鹽檢測(cè)

根據(jù)GB5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽測(cè)定》中鹽酸萘乙二胺法對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行測(cè)定[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同比例馬奶酒樣乳桿菌ZW 3發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

pH和總酸含量是泡菜成熟與否的標(biāo)志，發(fā)酵過(guò)程中酸度值的變化是反映發(fā)酵過(guò)程的數(shù)量指標(biāo)，因此，結(jié)合品嘗鑒定，測(cè)定酸度值可以了解發(fā)酵進(jìn)程并確定產(chǎn)品的形成。在實(shí)驗(yàn)條件為：接種量8%（體積分?jǐn)?shù)），鹽濃度4%（w/v），糖濃度2%（w/v），室溫發(fā)酵7 d后，檢測(cè)發(fā)酵蔬菜的酸度。由圖1可知，接種發(fā)酵組的pH均低于3.305，酸度均大于1.3%；在實(shí)驗(yàn)組中，添加馬奶酒樣乳桿菌ZW3的比例不一樣，pH和酸度也不一樣。隨著馬奶酒樣乳桿菌ZW 3所占比例的增多，樣品的pH隨著降低，酸度隨著增加。馬奶酒樣乳桿菌ZW3占發(fā)酵劑的比例為1/4的2組實(shí)驗(yàn)，pH和酸度差別不明顯，并未因?yàn)槿樗峋?23所占比例的增多而過(guò)多的改變；而另外2組隨著馬奶酒樣乳桿菌所占比例的增多，pH和酸度變化明顯，當(dāng)占發(fā)酵劑的比例為1/2時(shí)，pH可達(dá)到3.215，酸度達(dá)到1.498%。即馬奶酒樣乳桿菌ZW 3的添加利于酸豆角酸味的形成。

根據(jù)感官評(píng)分可以得出，馬奶酒樣乳桿菌ZW3所占發(fā)酵劑的比例為1/3時(shí)的感官評(píng)分是所有酸豆角中評(píng)分最高的；而自然發(fā)酵酸豆角的評(píng)分不高，可能是由于自然發(fā)酵還沒(méi)有完全成熟，酸度不夠。

圖1 不同菌種比例對(duì)pH及總酸的影響Fig.1 Effectsof strainsproportion on pH valuesand totalacids contentsof pickle

表2 感官評(píng)分Table2 Thescoreof sensory evaluation

由于馬奶酒樣乳桿菌ZW3占發(fā)酵劑的比例為1/ 3時(shí)的實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵完成后能達(dá)到一個(gè)良好的效果，產(chǎn)品色香味達(dá)到最佳，pH及酸度都可以達(dá)到一個(gè)非常好的程度，而且風(fēng)味口感均很好。所以選取馬奶酒樣乳桿菌ZW3占發(fā)酵劑的比例為1/3的實(shí)驗(yàn)組作為最佳接種發(fā)酵組，與自然發(fā)酵進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)的對(duì)比分析。

2.2 加入馬奶酒樣乳桿菌ZW3的酸豆角與自然發(fā)酵酸豆角風(fēng)味物質(zhì)對(duì)比分析試驗(yàn)

泡菜的品質(zhì)主要是由風(fēng)味物質(zhì)決定的，風(fēng)味物質(zhì)主要包括有機(jī)酸、揮發(fā)性的風(fēng)味物等。這些風(fēng)味物質(zhì)也是自然發(fā)酵泡菜優(yōu)于人工接種發(fā)酵泡菜的原因[4]。所以實(shí)驗(yàn)將人工接種泡菜的風(fēng)味與自然發(fā)酵泡菜的風(fēng)味進(jìn)行對(duì)比分析，以判斷人工接種泡菜的品質(zhì)，也為指導(dǎo)人工接種泡菜提供科學(xué)基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)在前期發(fā)酵基礎(chǔ)之上，將自然發(fā)酵的酸豆角繼續(xù)發(fā)酵，直至發(fā)酵成熟，酸度與pH與所選最佳接種發(fā)酵組的酸度一致時(shí)停止發(fā)酵，對(duì)2組樣品進(jìn)行有機(jī)酸及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析。

2.2.1 有機(jī)酸分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間與含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得接種發(fā)酵酸豆角和自然發(fā)酵酸豆角中各有機(jī)酸的含量見(jiàn)表3。

泡菜酸味的主要來(lái)源是發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸。有機(jī)酸的存在不僅會(huì)改善食品的風(fēng)味，使泡菜具有酸爽的口感，還能改變和加強(qiáng)其他風(fēng)味物質(zhì)所產(chǎn)生的味感。發(fā)酵后的泡菜主要含有的有機(jī)酸有：乳酸，甲酸，草酸，丙酸，琥珀酸，乙酸，蘋(píng)果酸，檸檬酸，富馬酸等。不同的有機(jī)酸所帶來(lái)的風(fēng)味也不同。乳酸的酸味柔和，有后酸味，可提供柔和的風(fēng)味；琥珀酸兼有海扇和豆醬類的風(fēng)味，有研究表明，琥珀酸鈉含量為0.114%時(shí)就足夠呈現(xiàn)出一定程度的鮮味；乙酸有較強(qiáng)的刺激味，有強(qiáng)化食欲的功能；蘋(píng)果酸具有令人愉快的酸味，其酸味的產(chǎn)生和消失都比檸檬酸緩慢；富馬酸具有水果酸味；檸檬酸有令人愉快、清涼的酸味，但味覺(jué)消失迅速[10]。

表3 有機(jī)酸分析結(jié)果Table3 Organic acidscontentsof sample

通過(guò)2種發(fā)酵方式有機(jī)酸種類對(duì)比發(fā)現(xiàn)，2樣品有機(jī)酸的種類并無(wú)差異，說(shuō)明人工接種發(fā)酵與自然發(fā)酵在有機(jī)酸的組成上是一致的。從有機(jī)酸的含量上看，草酸、甲酸、富馬酸含量差別不大，乳酸及琥珀酸的含量接種發(fā)酵高于自然發(fā)酵；蘋(píng)果酸、乙酸、檸檬酸及丙酸含量接種發(fā)酵低于自然發(fā)酵。分析原因可能是因?yàn)槿斯そ臃N發(fā)酵在發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌種固定，而自然發(fā)酵中發(fā)酵菌種復(fù)雜，這種微生物菌群及生物量上的差異性引起了成熟后的泡菜中有機(jī)酸含量的差異。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸是泡菜酸味的關(guān)鍵成分，加入馬奶酒樣乳桿菌ZW3的發(fā)酵酸豆角乳酸含量明顯高于自然發(fā)酵，這也有可能是馬奶酒樣乳桿菌ZW3促進(jìn)發(fā)酵產(chǎn)酸，加速泡菜成熟速度的原因。

2.2.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

每一種蔬菜腌制品都有其特征風(fēng)味物質(zhì)，且這些特征風(fēng)味物質(zhì)揮發(fā)性較強(qiáng)[11]。酸菜有其自身的特征香氣，酯類、雜環(huán)類及其他含氧化合物都對(duì)香氣有一定貢獻(xiàn)[12]。這些香氣也可以減少泡菜原料中帶有的不良?xì)馕丁?/p>

圖2（a）（b）分別為人工接種發(fā)酵與自然發(fā)酵酸豆角的總離子流色譜圖。從接種發(fā)酵和自然發(fā)酵泡菜的總離子流色譜圖可以看出：發(fā)酵完成后，達(dá)到相同的酸度的情況下，接種發(fā)酵泡菜與自然發(fā)酵泡菜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)峰形基本一致，含量上沒(méi)有太大的變化。

通過(guò)GC-MS自帶數(shù)據(jù)分析軟件及查詢化合物CAS號(hào)分析，接種發(fā)酵泡菜與自然發(fā)酵泡菜共有34種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢出。主要為酯類、醛類、酮類、醇類及烷烴類、酚類、烯烴類化合物。其中以醇類和酯類組分居多，分別鑒定出14個(gè)醇類組分，8個(gè)酯類組分。除此之外還有4個(gè)烯烴類組分，4個(gè)酮類組分以及2個(gè)醛類和2個(gè)酚類組分。

圖2 接種發(fā)酵（a）和自然發(fā)酵（b）酸豆角的總離子流色譜圖Fig.2 The total chroMatograMof inoculation ferMented（a）and natural ferMented（b）cowpe

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果表明，接種發(fā)酵酸豆角中含有幾乎全部自然發(fā)酵酸豆角中的特征風(fēng)味物質(zhì)，且含量相差不大。所以在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可以考慮使用實(shí)驗(yàn)組所選用的菌種作為人工接種的發(fā)酵劑。

2.2.3 亞硝酸鹽的測(cè)定

對(duì)兩組樣品進(jìn)行亞硝酸鹽含量的測(cè)定，接種發(fā)酵的樣品亞硝酸鹽的含量為0.150mg/kg，自然發(fā)酵樣品的亞硝酸鹽的含量為1.622mg/kg，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽測(cè)定》中規(guī)定的泡菜的亞硝酸鹽含量不應(yīng)該超過(guò)20mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)。并且人工接種樣品的亞硝酸鹽含量低于自然發(fā)酵的樣品。

3 結(jié)論

綜上所述，馬奶酒樣乳桿菌ZW3可與其他乳酸菌復(fù)配用于酸豆角的發(fā)酵。在相同接種量的情況下，隨著馬奶酒樣乳桿菌所占比例的增大，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸速度加快，發(fā)酵時(shí)間縮短；并且在發(fā)酵成熟后，所含有的風(fēng)味物質(zhì)在種類與含量上與自然發(fā)酵基本一致，可以可作為一種新型蔬菜發(fā)酵菌種使用。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為發(fā)酵蔬菜菌種的開(kāi)發(fā)，加速發(fā)酵蔬菜安全及工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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App lication of Lactobacillus Kefiranofaciens ZW 3 in Cowpea FerMentation

ZHENGYong-na1，ZHAOYong2，WANG Jing-rui1，WANGYan-ping1，*
（1.Key Laboratoryof Food Nutrition and Safety，Collegeof Food Engineering&Biotechnology，Tianjin University ofScience&Technology，Tianjin 300457，China；2.Community Health Service Centre，Nanshi Street，Heping District，Tianjin 300457，China）

Lactobacillus kefiranofaciens ZW3mixed with Lactobacillus plantaruM299 and Lactic acid bacteria 723 in different proportion for acid fermented cowpea was studied.Under the certain innoculums，fermented cowpea pH was decreased and acidity was increased with the increase of the proportion of Lactobacillus kefiranofaciens ZW3.According to the results of sensory score，fermented cowpea tasted bestwhen the three kindsofbacteriaweremixed with a ratio of1∶1∶1.Through the analysisof the organic acidsand volatile flavor compounds，the types and quantities of organic acids and volatile flavor compounds was consistent between inoculated fermentation of the bestproportion and natural fermentation.Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 was used in fermented vegetablesand the productshavegood acid productivity，rapid lowered pH，and good taste.

Lactobacilluskefiranofaciens ZW 3；sour cowpea；acid production；flavor compounds

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.097

2014-09-24

“十二五”科技部高技術(shù)發(fā)展研究計(jì)劃‘863計(jì)劃’：果蔬發(fā)酵食品，調(diào)味品及微生物油脂生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)（2011AA100904）

鄭永娜（1989—），女（漢），在讀碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者：王艷萍（1962—），女（漢），教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。