硬枝堿蓬HPLC指紋圖譜建立及模式識別研究

馬 濤 趙 宇 韓占江

(塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

鹽漬土壤是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一，新疆有鹽漬土約為0.13億hm2，是我國鹽漬土分布最廣、面積最大的省區(qū)[1，2]。新疆的耕地近1/3鹽漬化，開發(fā)利用耐鹽植物是新疆植物研究的重點之一，是合理利用鹽漬土壤的重要方法。鹽生植物是一個寶貴的天然耐鹽基因庫，尤其是具有經(jīng)濟價值的材料，可以利用它們自身的耐鹽性直接引種馴化、開發(fā)應(yīng)用，也可以通過基因工程手段把耐鹽基因整合到非鹽生植物中，使其成為耐鹽的轉(zhuǎn)基因植物。

硬枝堿蓬(SuaedarigidaH. W. Kung et G. L. Chu)是孔憲武1978年發(fā)表的一個植物新種[3]，是藜科堿蓬屬中最高大的一種強木質(zhì)化草本[4]，是塔里木盆地的特有植物，真鹽生植物，其植株高大，枝葉繁茂，是一種營養(yǎng)豐富的野生蔬菜，又是當?shù)貎?yōu)良的牧草資源，具有重要的經(jīng)濟價值和生態(tài)價值[5，6]。前人對硬枝堿蓬的地理分布、群落特征、生境土壤狀況、葉片解剖特征及種子形態(tài)等進行了一系列研究，發(fā)現(xiàn)硬枝堿蓬是很好的耐鹽材料[7，8]。筆者前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，硬枝堿蓬主要分布在塔克拉瑪干沙漠北緣，大致沿庫爾勒-阿克蘇-巴楚-喀什一線分布。

中藥指紋圖譜(fingerprinting)是借用DNA指紋圖譜發(fā)展而來，應(yīng)用較早較多的是中藥化學(xué)成分色譜指紋圖譜，特別是高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜。建立中藥指紋圖譜的目的是全面反映所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進而評價樣品的質(zhì)量[9，10]。中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(中國藥典A版)(以下簡稱為中藥相似度軟件)可對色譜圖進行對照處理，快速檢測樣品物質(zhì)與含量的相似性。不同生境下，同一植物的生長特性變現(xiàn)可能存在差異，因此，本文采用高效液相色譜法建立硬枝堿蓬的指紋圖譜，采用中藥相似度軟件對該試驗的準確度、精密度進行檢測，并對不同產(chǎn)地的硬枝堿蓬進行主成分分析(Principal components analysis，PCA)，為后續(xù)研究所用材料的均一性提供保證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料

新鮮采摘的硬枝堿蓬(采自塔里木大學(xué)東北角虹橋路旁，阿拉爾5團，阿拉爾12團，阿拉爾16團，沙雅，庫車，和靜，巴楚，阿拉爾至沙雅公路旁9個地點)。

1.1.2 試驗試劑

甲醇、乙腈為分析純(天津博迪化工股份有限公司)，無水甲醇、乙腈為色譜純(Merck公司)。

1.1.3 試驗儀器

所用儀器主要有Prominence LC20A島津液相色譜儀，KQ-100VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器，Typc HP-01無油真空泵，F(xiàn)Z102粉碎機等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的前處理

將新鮮采摘的硬枝堿蓬去除泥土和雜草，選取完整的植株洗凈，通風無光條件下放置7-10 d，使其充分干燥。選取植株的莖葉部分，放入粉碎機中充分粉碎，過80目篩制得樣品粉末。

1.2.2 提取溶劑的選擇

稱取6份2. 000 g樣品粉末放入50 mL容量瓶中，分別加入25%乙腈、50%乙腈、100%乙腈、25%甲醇、50%甲醇、100%甲醇作為提取劑震蕩搖勻，過濾，超聲提取40 min，抽濾，濾液經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾，制得待測樣液，于4 ℃冰箱內(nèi)保存，備用。

1.2.3 提取溶劑用量的選擇

稱取5份2. 000 g樣品粉末放入50 mL容量瓶中，分別加入100%甲醇50 mL、30 mL、20 mL、15 mL、10 mL，震蕩搖勻，過濾，超聲提取40 min，抽濾，濾液經(jīng)0. 45 μm有機濾膜過濾，制得待測樣液，于-4℃冰箱內(nèi)保存，備用。

1.2.4 色譜條件的優(yōu)化

流動相：乙腈(A)-水(B)或甲醇(A)-水(B)，采用100%乙腈或100%甲醇等度洗脫；流速：1. 0 mL/min；進樣體積：10 μL；色譜柱：inertsil ODS-SP 4. 6 mm×250 mm×5 μm；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：由于儀器在進樣時是自動全波長(190 nm-800 nm)檢測，所以進樣后選擇200 nm、210 nm、220 nm、230 nm、240 nm、250 nm、260 nm、270 nm、280 nm、290 nm、300 nm處樣品色譜圖，選擇出峰多、峰形好的波段，進一步比較分析，選擇出最佳檢測波長。

1.2.5 精密度試驗

使用同一產(chǎn)地的硬枝堿蓬制備5個樣品溶液，每個樣品連續(xù)進樣5次，使用中藥相似度軟件進行對比，獲得圖譜之間的相似度，確定此次試驗使用方法的精密程度。

1.2.6 重現(xiàn)性試驗

使用同一產(chǎn)地的硬枝堿蓬，制備5個樣品溶液，對其進樣分析，使用中藥相似度軟件進行對比，獲得圖譜之間的相似度，確定此次試驗的重現(xiàn)性能。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗

制備一個樣品溶液，在第1 d、3 d、5 d、7 d、9 d進樣測定，使用中藥相似度軟件進行對比，獲得圖譜之間的相似度，確定樣品溶液的穩(wěn)定性。

1.2.8 生成對照圖譜

將不同產(chǎn)地的硬枝堿蓬制備成樣品溶液P1～P9，每一份樣品溶液做兩次平行試驗，選取最優(yōu)色譜圖，得出P1～P9樣品的指紋圖譜。使用中藥相似度軟件對P1～P9樣品的指紋圖譜進行比較分析，生成對照圖譜，作為硬枝堿蓬的標準指紋圖譜。

1.2.9 主成分分析

本次試驗使用主成分分析法(PCA)來進行模式識別研究，即將這些樣品中的所有峰的保留時間進行組合，進行散點作圖，達到“物以類聚”的效果，很直觀的反映出各個樣本之間的關(guān)系，實現(xiàn)模式識別的目的。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理及色譜條件的確定

如圖1所示，S1～S6分別為25%乙腈、50%乙腈、100%乙腈、25%甲醇、50%甲醇、100%甲醇做提取溶劑的HPLC指紋圖譜，經(jīng)對比確定使用100%甲醇作為樣品的提取溶劑處理效果較好，如圖1中S6。經(jīng)測定，使用15 mL100%甲醇做為提取溶劑時，樣品溶液濃度適合，出峰較多，峰形較好。流速為1.0 mL/min時，色譜圖中各峰分離效果明顯，檢測波長選擇254 nm處，色譜圖峰形較好，進樣時間選擇20 min，流動相為甲醇(A)-水(B)，采用100%甲醇等度洗脫。

表1 樣品1精密度試驗相似度

表2 樣品2精密度試驗相似度

表3 樣品3精密度試驗相似度

表4 樣品4精密度試驗相似度

表5 樣品5精密度試驗相似度

圖1 不同提取溶劑的HPLC指紋圖譜

2.2 精密度試驗結(jié)果

對五個樣品溶液連續(xù)重復(fù)進樣5次后，經(jīng)相似度分析，獲得各圖譜之間的相似度均在0. 99以上，表明該試驗方法精密度好。如表1～5。

2.3 重現(xiàn)性試驗結(jié)果

進樣同一個產(chǎn)地樣品制備的5個樣品溶液，經(jīng)相似度分析，獲得圖譜之間的相似度在0. 97以上，表明此次試驗重現(xiàn)性良好。如表6。

表6 重現(xiàn)性試驗相似度

2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

同一個樣品溶液，在第1 d、3 d、5 d、7 d、9 d后進樣測定，經(jīng)相似度分析，獲得圖譜之間的相似度均在0. 99以上，表明所制得的試劑在9 d時間內(nèi)是穩(wěn)定的。如表7。

表7 穩(wěn)定性試驗相似度

2.5 對照圖譜

重新配制9個不同產(chǎn)地的樣品溶液進樣測定，每個樣品做兩次平行測定，選取最優(yōu)色譜圖作為樣品模版，使用中藥相似度軟件對9個色譜圖進行處理，生成樣品的對照圖譜，這個對照圖譜便可作為硬枝堿蓬的指紋圖譜。如圖2，R為生成的對照圖譜。

圖2 硬枝堿蓬對照圖譜

運用中藥相似度軟件，對P1～P9進行相似度評價。如表8。9個樣品的相似度均大于0. 9，說明這9個樣品屬于同一種物質(zhì)。

表8 硬枝堿蓬相似度評價

2.6 主成分分析

使用simca-p 11.5軟件對P1～P9樣品的色譜圖數(shù)據(jù)進行擬合模型處理并識別特異點，獲得9個樣品主成分的散點圖。如圖3所示，P1、P6和P8相似，P4和P5較為相似，其余樣本均有不同，由此可以看出不同產(chǎn)地的硬枝堿蓬有一定的差異性。

圖3 PCA散點圖

3 結(jié)論

3.1 選取檢測方法

此次試驗選用HPLC法測定樣品指紋圖譜，與經(jīng)典液相色譜法相比，具有分離效率高、分析速度快、定量精密度高、檢測器種類多、靈敏度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好等特點。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗確定的最佳條件為用100%甲醇作為樣品的提取溶劑，用量為15 mL，流速為1. 0 mL/min，色譜進樣時間為20 min，流動相為甲醇(A)-水(B)，采用100%甲醇等度洗脫，檢測波長為254 nm。

3.3 模式識別

在PCA分析中，相同地區(qū)的樣品被歸為一類，有差異的樣品會明顯地與其他樣品區(qū)分開來，可以直觀的反映各個樣本之間的聚類關(guān)系。通過PCA分析，得到的樣品的歸類與實際情況相符，說明基于PCA的模式識別方法有效、可靠，為硬枝堿蓬的質(zhì)量控制和綜合評價奠定了基礎(chǔ)。

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