• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    新疆民族特色酸奶及酸奶疙瘩中乳酸菌的分離鑒定及其生物膜形成能力檢測

    2014-03-21 06:22:16
    關(guān)鍵詞:胞外生物膜乳制品

    (1新疆南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆 阿拉爾 843300)(2新疆塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 新疆 阿拉爾 843300)(3 遼寧大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院, 遼寧 大連 116000)

    乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一類能夠發(fā)酵碳水化合物主要產(chǎn)物為乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱。它在自然界中廣泛存在,它不僅可以提高食品附加值和保藏性,還能幫助調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡,具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)有效吸收的保健功能[1]。近年來,乳酸菌已經(jīng)作為益生菌廣泛應(yīng)用于食品及藥品領(lǐng)域中,含有大量乳酸菌的乳制品是營養(yǎng)與保健功能兼?zhèn)涞默F(xiàn)代人的理想食品之一。新疆民族特色酸奶及酸奶疙瘩因其獨(dú)特的風(fēng)味及豐富的營養(yǎng)逐漸成為一種流行的優(yōu)質(zhì)食品。酸奶疙瘩是酸奶子的結(jié)晶體,是哈薩克族、柯爾克孜族及蒙古族等少數(shù)民族牧民家制的自然發(fā)酵奶制品之一,它是采用牛(羊)奶自然發(fā)酵后去水自然干燥成的固體或半固體食品[2]。千百年來新疆牧民沿襲古老而傳統(tǒng)的方法制作的酸奶疙瘩具有風(fēng)味獨(dú)特的特點(diǎn),這表明酸奶疙瘩中蘊(yùn)含有傳代性好、抗逆性強(qiáng)、風(fēng)味獨(dú)特的乳酸菌菌群,進(jìn)而可以分離篩選出發(fā)酵性能良好的乳酸菌,應(yīng)用于發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)中。國內(nèi)學(xué)者對(duì)新疆酸奶及酸奶疙瘩中乳酸菌也有報(bào)道,趙蕊[3]等對(duì)15份采自新疆伊犁牧民家庭傳統(tǒng)方法制作的酸奶子中分離出71株乳酸菌,并發(fā)現(xiàn)乳桿菌為優(yōu)勢菌,其中瑞士乳桿菌(L.helveticu)為最優(yōu)勢種;彭斌[2]等對(duì)對(duì)采自新疆伊犁、塔城、烏魯木齊白楊溝的傳統(tǒng)奶疙瘩中的乳酸菌進(jìn)行了分離,經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化試驗(yàn),得到初步定為乳酸菌的菌株18株;而對(duì)于新疆其他地區(qū)牧民家庭自制的酸奶及酸奶疙瘩的研究并未見報(bào)道。乳酸菌能夠產(chǎn)生多種有益的代謝產(chǎn)物,例如乳酸、細(xì)菌素、胞外多糖等。胞外多糖是由發(fā)酵產(chǎn)生的、分泌于細(xì)胞外的一種糖類化合物,它對(duì)改善發(fā)酵乳制品的組織狀態(tài)起著重要作用。同時(shí),它也是細(xì)菌形成生物膜結(jié)構(gòu)的必需物質(zhì)。生物膜是一種黏附于生物或者非生物材料表面由細(xì)菌群體和包裹群體的基質(zhì)組成的聚合體[3]。這種包裹菌體的基質(zhì)是生物膜形成的必要條件,其主要成分即為胞外多糖,占總量的50%~90%[4]。目前有關(guān)將微生物生物膜的特性應(yīng)用于生防試劑、生物反應(yīng)器及生物修復(fù)等方面已有較多報(bào)道,乳酸菌是一類公認(rèn)安全的益生菌,其生物膜的應(yīng)用前景更為廣闊。

    本研究以新疆民族特色乳制品為研究對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行乳酸菌的分離,然后采用生理生化檢測與分子生物學(xué)手段相結(jié)合的方法對(duì)乳酸菌進(jìn)行鑒定,然后探索其生物膜的形成情況,為更進(jìn)一步開發(fā)利用乳酸菌資源及乳酸菌生物膜奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

    PCR儀(Bio-Rad),96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Labphil),恒溫培養(yǎng)箱(上海),移液器( Eppendorf),吸收光酶標(biāo)儀(Biolog ELx808TM)等。

    1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

    MRS肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公司),PCR相關(guān)試劑均購自Takara公司,碳源利用試驗(yàn)中的各種糖醇類試劑均為進(jìn)口分裝,其他實(shí)驗(yàn)相關(guān)藥品均為國產(chǎn)分析純。

    1.3 樣品采集

    樣品為分別采自從新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州阿合奇縣、伊犁哈薩克自治州那拉提草原及新源縣城、哈密地區(qū)巴里坤草原等地區(qū)的酸奶及奶疙瘩等民族特色乳制品。

    1.4 乳酸菌的分離純化及鑒定

    1.4.1 乳酸菌的分離及純化

    液體樣品直接劃線接種于固體MRS平板;固體樣品表面用無菌生理鹽水清洗,研碎后以1:9的比例置于MRS液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)[1],37 ℃靜置培養(yǎng)24~48 h,梯度稀釋后劃線接種于固體MRS平板;MRS瓊脂培養(yǎng)基均添加有1/10 000濃度放線菌酮,接種后置于37 ℃條件下培養(yǎng)24~72 h。將分離純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色及過氧化氫酶測定,將革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌株暫定為乳酸菌[5]。將其用甘油管保存于-80 ℃冰箱中備用。

    1.4.2 乳酸菌的理化鑒定

    參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-7],對(duì)分離純化的乳酸菌進(jìn)行生理生化鑒定,包括葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)、溫度生長試驗(yàn)、pH耐受試驗(yàn)、碳源利用試驗(yàn)(包括阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、鼠李糖、核糖、山梨醇、蔗糖、木糖、棉籽糖)、明膠液化試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)等。

    1.4.3 乳酸菌16S rDNA測序分析[9]

    采用SDS法提取細(xì)菌基因組DNA,對(duì)其進(jìn)行16S rDNA測序分析。革蘭氏陽性細(xì)菌的通用引物作為擴(kuò)增引物,上游引物(27F):5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’;下游引物(1492R):5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’;擴(kuò)增條件為:94 ℃,5 min;(94 ℃,30 s;55 ℃,1 min;72 ℃,1. 5 min;30個(gè)循環(huán));72 ℃,10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后,120 V電泳30 min,EB染色,凝膠成像系統(tǒng)成像,將PCR產(chǎn)物送至上海生工測序。測序結(jié)果與Genbank中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),將比對(duì)結(jié)果作為菌株最終的鑒定結(jié)果。

    1.5 乳酸菌生物膜形成情況檢測

    根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]并略作改動(dòng),采用微量板半定量法對(duì)所分離得到的乳酸菌進(jìn)行生物膜形成能力檢測。按1:200的比例接種過夜培養(yǎng)的菌液至MRS液體培養(yǎng)基中,吸取200 μL上樣至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h,拍出培養(yǎng)液,無菌水洗板4次,56 ℃烘干固定1 h,50 μL 0. 5%結(jié)晶紫染色5 min,自來水沖洗除去多余染液,37 ℃晾干,用酶標(biāo)儀測定波長490 nm處的OD值。每一培養(yǎng)板中同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照(ATCC 35984)、陰性對(duì)照(ATCC 12228)與空白對(duì)照(等體積的空白MRS培養(yǎng)基),所有生物膜形成檢測試驗(yàn)均在不同時(shí)間重復(fù)3次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 新疆民族特色酸奶及酸奶疙瘩中乳酸菌多樣性分析

    經(jīng)分離純化后共獲得110株乳酸菌,分別通過生理生化及分子生物學(xué)鑒定后,乳酸菌分布情況見表1。從表中可以看出,在本研究中,新疆民族特色酸奶及酸奶疙瘩中所分離得到的戊糖乳桿菌(L.pentosus),占菌株總數(shù)的48. 18%,在本研究結(jié)果中為優(yōu)勢種;其次為副干酪乳桿菌(L.paracasei),占菌株總數(shù)的25. 45%;同時(shí)發(fā)現(xiàn)乳桿菌占所分離菌株總數(shù)的92. 72%,在所采集的樣本中為絕對(duì)優(yōu)勢菌屬,主要可能有兩個(gè)方面的原因,一是與所采集的酸奶及酸奶疙瘩樣品酸度較高有關(guān)系,一般來說,酸度高有利于乳酸桿菌的生長,而會(huì)抑制乳酸球菌的生長。據(jù)報(bào)道,新疆塔城地區(qū)酸奶疙瘩的酸度平均為2. 8(酸度以乳酸計(jì))[2]。酸度高也有利于抑制霉菌的生長;二是可能與所采用的分離培養(yǎng)基有關(guān),MRS培養(yǎng)基所含有的營養(yǎng)物質(zhì)更適合于乳酸桿菌的生長繁殖[12],導(dǎo)致在所分離的菌株中乳桿菌為絕對(duì)優(yōu)勢菌屬。另外,還發(fā)現(xiàn)了一株潛在新種,編號(hào)為48,屬于腸球菌屬,其最相近種為屎腸球菌(EnterococcusfaeciumATCC 19434),經(jīng)測序比對(duì)之后其16S rRNA相似度為93. 9%,該菌株的進(jìn)一步鑒定工作正在進(jìn)行中。所分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析見圖1。從圖1中可以看出,所分離得到的乳酸菌分布在2個(gè)屬,共10個(gè)種,其中潛在新種屬于腸球菌屬,命名為Enterococcusxinjiangensis-48。

    表1 所分離乳酸菌分布情況

    續(xù)表1 所分離乳酸菌分布情況

    圖1 所分離乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

    2.2 乳酸菌生物膜形成能力檢測

    對(duì)所分離得到的110株乳酸菌進(jìn)行生物膜形成能力檢測,結(jié)果如圖2所示。在檢測的乳酸菌中,生物膜為陽性的共70株,占菌株總數(shù)的63. 64%。在本研究中檢測的生物膜陽性乳酸菌全為乳酸桿菌,并且生物膜陽性乳桿菌的比例占總數(shù)的68. 32%,從中可以看出乳桿菌生物膜形成能力較強(qiáng),這可能與大多數(shù)乳桿菌都能夠分泌合成大量胞外多糖所致。在生物膜陽性的乳桿菌中,戊糖乳桿菌(L.pentosus)共43株,占生物膜陽性菌株總數(shù)的62. 32%,同時(shí)占戊糖乳桿菌總分離菌株數(shù)的81. 13%;副干酪乳桿菌(L.paracasei),占生物膜陽性菌株數(shù)的26. 09%,占總分離菌株數(shù)的64. 29%。另外值得指出的是,所分離的9株腸球菌屬的乳酸菌,其生物膜表型檢測均為陰性,這可能是因?yàn)楸狙芯恐兴蛛x得到的均為屎腸球菌(E.faecium),而國內(nèi)外所報(bào)道的能夠形成生物膜的腸球菌多為糞腸球菌(E.faecalis),而無屎腸球菌,可能是因?yàn)樵摲N腸球菌形成胞外多糖的能力有限所致。

    圖2 所分離乳酸菌部分菌株生物膜形成情況

    有文獻(xiàn)[13]指出,生物膜的光密度值(即OD值)能夠反映生物膜與接觸表面黏附的牢固程度,依據(jù)臨界OD490值(指空白孔的平均OD490值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)差而得到)可將生物膜進(jìn)行分類,分別分為陰性(-)、弱陽性(+)、中等陽性(++)及強(qiáng)陽性(+++),在本研究中經(jīng)試驗(yàn)得出臨界OD490值為0. 14,所分離乳酸菌中生物膜形成情況見表2。從表2中可以看出,乳桿菌所形成的生物膜將近一半均為強(qiáng)陽性生物膜(OD490>0. 56),該結(jié)果也更進(jìn)一步說明乳酸菌,尤其是乳桿菌具有較強(qiáng)的生物膜形成能力,這為更進(jìn)一步開發(fā)利用乳酸菌生物膜的特性奠定基礎(chǔ)。

    表2 不同乳酸菌生物膜形成情況及其分布

    3 討論

    新疆是一個(gè)多民族聚居的地區(qū),在這里少數(shù)民族一直都有食用自制發(fā)酵乳制品的習(xí)慣。這些民族特色發(fā)酵乳制品風(fēng)味獨(dú)特,營養(yǎng)價(jià)值極高,同時(shí)富含本地區(qū)自然環(huán)境中豐富的微生物資源,乳酸菌即是其重要的組成部分。乳酸菌具有維持腸道菌群微生態(tài)平衡,降低血清膽固醇、抗氧化、防癌抗癌等功效[14]。在本研究中,所得到的乳桿菌占分離乳酸菌總數(shù)的92. 72%,為絕對(duì)優(yōu)勢種群,分析其原因可能是與采集樣品酸度高及分離培養(yǎng)基有關(guān)。由于酸度高,因此耐酸性差的乳球菌到發(fā)酵后期難以存活,所以很難從中分離出乳球菌。該結(jié)果也與孫天松[6]等得到的結(jié)果相一致。有學(xué)者[15][16]對(duì)內(nèi)蒙古及青海等地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌進(jìn)行分離得出,乳桿菌也均為其優(yōu)勢種群。這體現(xiàn)了乳桿菌作為發(fā)酵乳制品的優(yōu)勢菌種的重要地位。從表2中可以看出,不同乳桿菌生物膜的形成能力存在很大差異,同一種的乳酸菌其生物膜形成能力也極為不同。例如所分離得到的53株戊糖乳桿菌(L.pentosus),在四種類型的生物膜形成能力中均有分布,并且比例大致為1:1:1:2,分布較為平均。這可能是由于在同一種乳酸菌中還存在眾多亞種,各個(gè)亞種之間存在差異,編碼各自生物膜形成的基因不同,導(dǎo)致生物膜表型不一致。對(duì)于同一種內(nèi)的亞種,還有待采用進(jìn)一步的分析檢測手段進(jìn)行區(qū)分。

    乳酸菌代謝產(chǎn)物如乳酸、細(xì)菌素及胞外多糖等廣泛應(yīng)用于食品藥品領(lǐng)域。胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的、分泌于細(xì)胞外的、常滲入培養(yǎng)基中的一種糖類化合物[17],它是近十年來乳品科學(xué)的研究熱點(diǎn)。在乳酸菌中,有關(guān)乳桿菌胞外多糖的研究報(bào)道越來越多。大多數(shù)產(chǎn)EPS 乳桿菌菌株是從發(fā)酵乳及乳制品、發(fā)酵肉制品以及發(fā)酵蔬菜中分離獲得的。胞外多糖的重要作用之一在于它是一種天然的增稠劑,可以改善發(fā)酵乳制品的流變學(xué)特性。同時(shí)EPS也是一種物理穩(wěn)定劑,能夠結(jié)合水并限制物料脫水收縮,賦予產(chǎn)品吸引人的外觀和令人滿意的口感[18]。另外,EPS還與乳酸菌生物膜的形成有直接關(guān)系,是生物膜形成的必需條件,從本研究中這一點(diǎn)也得到了證實(shí)。所分離菌株的生物膜陽性率高達(dá)63. 63%,并且全部為乳桿菌,這與乳桿菌具有較強(qiáng)的發(fā)酵產(chǎn)生EPS的能力密切相關(guān)。乳酸菌生物膜的形成可能也與奶源關(guān)系密切,少數(shù)民族牧民制作乳制品通常采用馬奶、羊奶等作為原料,這些奶源中乳糖含量豐富,因此為乳酸菌發(fā)酵提供了充足的碳源,產(chǎn)生了大量的胞外多糖,進(jìn)而能夠形成生物膜結(jié)構(gòu)。

    4 結(jié)論

    4.1 本研究從采集自新疆四個(gè)地區(qū)的傳統(tǒng)民族乳制品酸奶子及酸奶疙瘩中分離獲得乳酸菌共110株,經(jīng)生理生化檢測及分子生物學(xué)鑒定得出,L.pentosus53株,L.kefir10株,L.paracasei28株,L.plantarum4株,L.diolivorans3株,E.faecium8株,L.paraplantarum、L.gallinarum、L.sunkii各1株;還有1株經(jīng)16S測序比對(duì)后與已知菌株基因序列相似性低于97%(93. 9%),為疑似新種,尚在進(jìn)一步研究中;乳桿菌為本研究所分離菌株的絕對(duì)優(yōu)勢菌屬,可能與所采集樣品酸度較高及所使用的分離培養(yǎng)基有關(guān);

    4.2 對(duì)所分離獲得的110株乳酸菌進(jìn)行生物膜形成能力檢測,結(jié)果顯示生物膜陽性率高達(dá)63. 64%,這其中強(qiáng)陽性菌株(OD490>0. 56)32株,中等陽性菌株(0. 28

    4.3 本研究中生物膜陽性菌株均為乳桿菌,腸球菌生物膜表型均為陰性,其中80%以上的L.pentosus生物膜表型為陽性。乳桿菌胞外多糖不僅在發(fā)酵乳的流變學(xué)特性、產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和質(zhì)地以及口感等方面起到重要作用,還具有抗癌、抗?jié)?、免疫調(diào)節(jié)或降膽固醇等活性,逐漸成為近年來研究熱點(diǎn),而對(duì)乳桿菌生物膜特性的應(yīng)用及研究尚處于初級(jí)階段,亟待進(jìn)一步的開發(fā)利用。

    [1] 趙勝娟, 趙暄, 羅紅霞,等. 新疆傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌的分離鑒定[J]. 中國乳品工業(yè), 2007, 35(11): 8-11.

    [2] 彭斌, 王志琴, 張曉紅,等. 新疆傳統(tǒng)奶疙瘩中乳酸菌的分離及篩選[J]. 草食家畜,2010,6(2): 21-23.

    [3] 趙蕊, 霍貴成. 新疆酸奶子中乳酸菌多樣性分析[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版), 2008, 43(7): 1-6.

    [4] Costerton J W, Stewart P S, Greenberg E P. Bacterial biofilm: a common cause of persistent infections[J]. Science, 1999, 284(5418): 1318-1322.

    [5] Barbara V, Miao C, Russell J C, et al. Bacterial extracellular polysaccharides involved in biofilm formation[J]. Molecules, 2009, 14: 2535-2554.

    [6] 孫天松, 王俊國, 張列兵,等. 中國新疆地區(qū)酸馬奶中乳酸菌生物多樣性研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2007, 34(3): 451-454.

    [7] 凌代文, 東秀珠. 乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1999.

    [8] 楊潔彬. 乳酸菌——生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1999.

    [9] 任曉鏷. 新疆南疆地區(qū)奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌生物被膜形成及其影響因素的研究[D]. 新疆: 塔里木大學(xué), 2012.

    [10] 任曉鏷, 陳偉, 張利莉. 新疆南疆地區(qū)奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌生物被膜形成及其相關(guān)基因的檢測[J]. 塔里木大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 23(3): 14-18.

    [11] Christensen G D, Simpson W A, Younger J J, et al. Adherence of coagulase-negativestaphylococcito plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence ofstaphylococcito medical devices[J]. J Clin Microbiol, 1985, 22(6): 996-1006.

    [12] Man D E, Rogosa J D, Sharpe M E. A Medium for the Cultivation of Lactobacilli [J]. J Appl Bact, 1960, 23:130-135.

    [13] 段韻涵, 韓北忠, 楊葆華,等. 培養(yǎng)條件對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長的影響[J]. 中國釀造, 2008, 3: 17-20.

    [14] 董曉婉, 李寶坤, 李開雄,等. 新疆蒙古族和哈薩克族傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌多樣性的比較[J]. 食品工業(yè)科技, 2013,34(21): 162-166.

    [15] 周雨霞, 孟和畢力格, 雷霞,等. 內(nèi)蒙古不同地區(qū)、不同畜種乳及乳制品中乳桿菌屬細(xì)菌的分布[J]. 2004,32(11): 3-5.

    [16] 張文羿, 徐杰, 云月英,等. 青海省海西地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵山羊乳中乳酸菌的分離及鑒定[J]. 2006,34(11): 4-8.

    [17] 顧瑞霞. 乳酸菌胞外多糖生物合成及生理功能特性的研究[D]. 哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2000.

    [18] 張?zhí)扃? 楊貞耐, 孔保華. 乳桿菌胞外多糖及其在酸乳中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2008,29(9): 637-642.

    猜你喜歡
    胞外生物膜乳制品
    硝化顆粒污泥胞外聚合物及信號(hào)分子功能分析
    幽門螺桿菌生物膜的研究進(jìn)展
    生物膜胞外聚合物研究進(jìn)展
    2018年1~2月乳制品產(chǎn)量同比增長8%
    水華期間藻類分層胞外聚合物與重金屬的相互作用機(jī)制研究
    通過乳制品源頭控制提高原料奶品質(zhì)的措施
    杜馬斯燃燒法快速測定乳制品的含氮量
    圖形在乳制品包裝設(shè)計(jì)中的應(yīng)用分析
    光動(dòng)力對(duì)細(xì)菌生物膜的作用研究進(jìn)展
    NY3菌固定化及生物膜處理含油廢水的研究
    久久久久网色| 久久国产精品影院| 两个人看的免费小视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久九九热精品免费| 黄片小视频在线播放| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲黑人精品在线| 视频区欧美日本亚洲| 国产伦理片在线播放av一区| 另类亚洲欧美激情| 精品一区二区三卡| 黄色视频在线播放观看不卡| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲精品在线美女| 麻豆av在线久日| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产男人的电影天堂91| 国产男人的电影天堂91| 男女国产视频网站| 在线观看国产h片| 夫妻午夜视频| 久久午夜综合久久蜜桃| xxxhd国产人妻xxx| 久久精品国产综合久久久| av不卡在线播放| 最近手机中文字幕大全| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 婷婷成人精品国产| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 久久久精品94久久精品| 国产精品一区二区在线不卡| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲精品国产av成人精品| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 啦啦啦啦在线视频资源| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产成人系列免费观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 宅男免费午夜| 国产三级黄色录像| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 母亲3免费完整高清在线观看| 一区二区三区精品91| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲精品乱久久久久久| 国产成人啪精品午夜网站| 9色porny在线观看| 中文字幕高清在线视频| 丝袜美足系列| 免费在线观看完整版高清| 99久久人妻综合| 久热爱精品视频在线9| 国产1区2区3区精品| av欧美777| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产淫语在线视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产在视频线精品| 午夜91福利影院| 亚洲国产欧美网| 中文字幕高清在线视频| 高清欧美精品videossex| 国产在视频线精品| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| h视频一区二区三区| 国产成人系列免费观看| 成人国产一区最新在线观看 | 99精国产麻豆久久婷婷| 国产91精品成人一区二区三区 | 老司机亚洲免费影院| 黄色视频不卡| 日本欧美视频一区| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲精品国产区一区二| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 人人妻人人澡人人看| 欧美精品一区二区大全| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 老熟女久久久| 一个人免费看片子| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产一区二区激情短视频 | 悠悠久久av| 9热在线视频观看99| 亚洲中文字幕日韩| 三上悠亚av全集在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 乱人伦中国视频| 免费在线观看影片大全网站 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产97色在线日韩免费| 久久久久精品国产欧美久久久 | 色综合欧美亚洲国产小说| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 午夜91福利影院| 午夜两性在线视频| 国产在线一区二区三区精| 少妇被粗大的猛进出69影院| 视频区欧美日本亚洲| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 国产高清视频在线播放一区 | 国产xxxxx性猛交| 久久天堂一区二区三区四区| 久久久欧美国产精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久精品94久久精品| 老司机在亚洲福利影院| 精品亚洲成国产av| 国产伦理片在线播放av一区| 叶爱在线成人免费视频播放| av福利片在线| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 后天国语完整版免费观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| netflix在线观看网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 男女床上黄色一级片免费看| 在线观看免费视频网站a站| 午夜福利在线免费观看网站| 在线观看免费午夜福利视频| 国产亚洲欧美精品永久| 国产99久久九九免费精品| 高清欧美精品videossex| 久久久精品区二区三区| 亚洲 国产 在线| 两个人免费观看高清视频| 亚洲九九香蕉| 午夜av观看不卡| 高清av免费在线| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲久久久国产精品| 国产在线免费精品| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 午夜福利一区二区在线看| 美国免费a级毛片| 国产精品久久久久成人av| 曰老女人黄片| 免费在线观看影片大全网站 | 99国产精品免费福利视频| 日韩一本色道免费dvd| 七月丁香在线播放| 丝袜美足系列| 少妇粗大呻吟视频| 久久久欧美国产精品| 欧美xxⅹ黑人| 成人黄色视频免费在线看| 婷婷色综合大香蕉| 中文字幕色久视频| 国产成人av教育| 中文欧美无线码| 亚洲av国产av综合av卡| 男女边摸边吃奶| a级毛片在线看网站| 国产熟女欧美一区二区| 国产欧美亚洲国产| 亚洲,欧美,日韩| 黄片小视频在线播放| 日本黄色日本黄色录像| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日本av手机在线免费观看| 人妻人人澡人人爽人人| 欧美日韩精品网址| 亚洲中文字幕日韩| 美女中出高潮动态图| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品免费大片| 亚洲综合色网址| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产精品国产三级国产专区5o| 老汉色∧v一级毛片| 久久精品国产a三级三级三级| 黄色一级大片看看| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美另类一区| a 毛片基地| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 大话2 男鬼变身卡| 国产一区二区在线观看av| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲专区国产一区二区| 精品视频人人做人人爽| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲伊人久久精品综合| av在线播放精品| 丝袜在线中文字幕| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲 国产 在线| av欧美777| 天天操日日干夜夜撸| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 午夜福利影视在线免费观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 黄色视频不卡| 国产黄色免费在线视频| 一级毛片 在线播放| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产视频一区二区在线看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 看免费成人av毛片| 久久国产精品大桥未久av| 飞空精品影院首页| 一个人免费看片子| 国产亚洲av高清不卡| 99久久综合免费| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 黄片播放在线免费| 精品国产国语对白av| 在线观看www视频免费| 国产深夜福利视频在线观看| 免费看不卡的av| 亚洲欧美精品自产自拍| 女警被强在线播放| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 韩国精品一区二区三区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品欧美亚洲77777| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 五月天丁香电影| 成人国产一区最新在线观看 | 日日摸夜夜添夜夜爱| 妹子高潮喷水视频| 男人添女人高潮全过程视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久性视频一级片| 国产片内射在线| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产精品一区二区在线观看99| 中文字幕色久视频| 免费看av在线观看网站| 久久久久久久久久久久大奶| 精品卡一卡二卡四卡免费| 两个人免费观看高清视频| 视频区图区小说| a 毛片基地| 亚洲中文av在线| 亚洲精品国产一区二区精华液| 午夜视频精品福利| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 亚洲视频免费观看视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产成人欧美在线观看 | 咕卡用的链子| 91成人精品电影| 亚洲成色77777| 久久这里只有精品19| 99久久99久久久精品蜜桃| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲中文字幕日韩| 欧美在线一区亚洲| 日日摸夜夜添夜夜爱| 午夜福利乱码中文字幕| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 好男人电影高清在线观看| a级毛片在线看网站| 伦理电影免费视频| 丰满少妇做爰视频| 国产成人啪精品午夜网站| 国产免费一区二区三区四区乱码| 美女视频免费永久观看网站| 久久av网站| 欧美日韩视频精品一区| 久久综合国产亚洲精品| 免费看av在线观看网站| 国产精品九九99| 亚洲伊人久久精品综合| 午夜91福利影院| 男女午夜视频在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 国产淫语在线视频| 成年美女黄网站色视频大全免费| 久久久国产一区二区| 秋霞在线观看毛片| 午夜精品国产一区二区电影| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲精品乱久久久久久| 下体分泌物呈黄色| av欧美777| 国产精品国产三级专区第一集| 久久久久精品国产欧美久久久 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 好男人电影高清在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 美女视频免费永久观看网站| 十八禁网站网址无遮挡| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲精品日本国产第一区| 久久av网站| 女人精品久久久久毛片| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产精品.久久久| 午夜激情久久久久久久| 亚洲欧美激情在线| 岛国毛片在线播放| 少妇的丰满在线观看| 亚洲av综合色区一区| 亚洲人成网站在线观看播放| 麻豆国产av国片精品| 色播在线永久视频| 日本91视频免费播放| 男女之事视频高清在线观看 | 午夜福利影视在线免费观看| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲av日韩在线播放| 久久青草综合色| 精品人妻在线不人妻| e午夜精品久久久久久久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 大香蕉久久成人网| 国产亚洲av高清不卡| 欧美在线一区亚洲| 成年人午夜在线观看视频| 大陆偷拍与自拍| 国产99久久九九免费精品| 久久天堂一区二区三区四区| √禁漫天堂资源中文www| tube8黄色片| 日本wwww免费看| 超碰97精品在线观看| 1024视频免费在线观看| 少妇 在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 黄片播放在线免费| 在线精品无人区一区二区三| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲男人天堂网一区| 精品一区在线观看国产| 国产xxxxx性猛交| 日本vs欧美在线观看视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 99国产综合亚洲精品| 欧美日韩一级在线毛片| 国产一区二区三区av在线| 国产男女内射视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 老司机影院毛片| 大码成人一级视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| kizo精华| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 无限看片的www在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 满18在线观看网站| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品国产乱码久久久久久男人| 99热国产这里只有精品6| 久久精品国产综合久久久| 免费少妇av软件| 国产成人精品无人区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产在线观看jvid| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久狼人影院| 一区二区av电影网| 亚洲熟女毛片儿| 久久中文字幕一级| 9色porny在线观看| 日韩视频在线欧美| 在线观看免费午夜福利视频| 少妇 在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 中文字幕最新亚洲高清| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产成人影院久久av| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲男人天堂网一区| 91麻豆av在线| 99久久人妻综合| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 男男h啪啪无遮挡| 美女中出高潮动态图| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久热这里只有精品99| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产一区有黄有色的免费视频| a级毛片在线看网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产精品九九99| 激情五月婷婷亚洲| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产在视频线精品| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产黄色免费在线视频| 久久影院123| 国产成人系列免费观看| 麻豆国产av国片精品| 亚洲专区国产一区二区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产亚洲精品第一综合不卡| 免费高清在线观看视频在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲天堂av无毛| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 考比视频在线观看| 99热国产这里只有精品6| 国产精品一区二区精品视频观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产在线一区二区三区精| 91国产中文字幕| 午夜91福利影院| 国产爽快片一区二区三区| 热re99久久精品国产66热6| 久久女婷五月综合色啪小说| 午夜激情久久久久久久| 美女国产高潮福利片在线看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 无遮挡黄片免费观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产人伦9x9x在线观看| 在线看a的网站| 色视频在线一区二区三区| 午夜福利乱码中文字幕| 黄色视频不卡| 久久这里只有精品19| 秋霞在线观看毛片| 免费观看av网站的网址| 日本av手机在线免费观看| 搡老岳熟女国产| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 男人操女人黄网站| 久久青草综合色| 蜜桃在线观看..| 午夜久久久在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 中文欧美无线码| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美精品亚洲一区二区| 午夜福利在线免费观看网站| 日本av手机在线免费观看| 国产主播在线观看一区二区 | 亚洲欧洲日产国产| 18禁观看日本| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲色图综合在线观看| 99国产精品免费福利视频| 亚洲av男天堂| 99久久人妻综合| 91国产中文字幕| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产精品久久久av美女十八| 美女主播在线视频| 婷婷色综合www| 亚洲成色77777| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 新久久久久国产一级毛片| videosex国产| 国产亚洲欧美精品永久| 少妇粗大呻吟视频| 超色免费av| 精品高清国产在线一区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 成人影院久久| www.av在线官网国产| 91精品国产国语对白视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 一本久久精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 热re99久久精品国产66热6| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 18禁观看日本| 各种免费的搞黄视频| 在线观看一区二区三区激情| 伦理电影免费视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 精品国产乱码久久久久久男人| 一本久久精品| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲 国产 在线| 国产国语露脸激情在线看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 99精品久久久久人妻精品| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产淫语在线视频| 一边亲一边摸免费视频| 欧美日本中文国产一区发布| 国产精品久久久久成人av| 99国产综合亚洲精品| 97精品久久久久久久久久精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 好男人电影高清在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产精品国产三级国产专区5o| 久久精品亚洲av国产电影网| 精品亚洲成a人片在线观看| 两人在一起打扑克的视频| av视频免费观看在线观看| 国产1区2区3区精品| 美女高潮到喷水免费观看| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲天堂av无毛| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产激情久久老熟女| 精品人妻在线不人妻| 国产激情久久老熟女| 精品视频人人做人人爽| 久久久久久久久久久久大奶| 嫁个100分男人电影在线观看 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 人妻人人澡人人爽人人| 一区二区日韩欧美中文字幕| 成人国产av品久久久| 午夜激情av网站| 国产精品av久久久久免费| 精品少妇久久久久久888优播| 久久av网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费观看人在逋| 国产精品久久久久久精品电影小说| 美女主播在线视频| 丝袜在线中文字幕| 1024视频免费在线观看| 99热全是精品| 成人国产一区最新在线观看 | 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲五月婷婷丁香| 热99国产精品久久久久久7| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产一卡二卡三卡精品| 777米奇影视久久| 精品视频人人做人人爽| 婷婷色综合大香蕉| 日韩视频在线欧美| 精品一区在线观看国产| 亚洲九九香蕉| 国产成人免费无遮挡视频| 天堂中文最新版在线下载| 啦啦啦啦在线视频资源| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产av一区二区精品久久| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久九九热精品免费| 欧美在线黄色| 男女边吃奶边做爰视频| 波野结衣二区三区在线| 黄色一级大片看看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 九草在线视频观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 只有这里有精品99| 亚洲少妇的诱惑av| 久久久国产一区二区| 色94色欧美一区二区| 午夜免费鲁丝| 99国产精品一区二区蜜桃av | 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品久久久久成人av| 伊人亚洲综合成人网| 丝瓜视频免费看黄片| 国产亚洲欧美精品永久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日韩大片免费观看网站| 亚洲国产看品久久| 啦啦啦在线免费观看视频4| 麻豆av在线久日| 国产精品一二三区在线看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲中文av在线| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产精品免费大片| 最近中文字幕2019免费版|